This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi. Soruşturma için 1. Modelleri <ol><li> Hücre kültürü <ol><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-T293),% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde hücreler, muhafaza edin. </li><li> T75 matara hücreleri büyümek ve onları% 90 izdiham ulaşmak için bekleyin. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 3-5 dakika boyunca, tripsinizasyon (% 0.25 Tripsin-EDTA) vasıtasıyla hücre bölme yapın </sub&gt; 700 x g de 4 ° C &#39;de, 5 dakika için bir hücre aynı hücre ortamı hacmi, ve santrifüj ile tripsin inaktivasyonu. </li><li> Medya aspire ve kültür ortamında hücre pelletini. </li><li> 7 x 10 4 hücreleri T75 içinde uygun bir şişe ya da levha tohum hücreleri tedavi sitokin önce 48 saat şişe. Bu tedavi sırasında% 70 ~ yoğunluğu vermelidir. </li><li> Serum açlıktan ölüyor hücreleri, 24 saat sonra ortam aspire edilmesiyle ve serumsuz ortam, aynı hacimde (DMEM, steril) ile değiştirerek. </li><li> 5 ug / ul, 10 ng / ul çalışma konsantrasyonlarda ultra saf su ile liyofilize edilmiş toz, TNF-α, IL1-β ve IFN-γ, hazırlama, ve 10 ng / ml, sırasıyla ve çukurlara eklemek / matara. </li><li> Tedavi, serum, doğrudan uygun şişe hücre kültür ortamına çözünür sitokinlerin ilave edilerek hücreler aç. Tedaviler, tek tek sitokinlerin her bir 3 kokteyl oluşuyordu (şekilde &quot;* 3&quot; olarak anılacaktır) ya da sterBir kontrol olarak Ile su (&quot;0&quot; olarak anılacaktır). </li><li> Değerlendirme ve hasattan önce 24, 48 ya da 72 saat tedavi hücreleri inkübe. </li></ol></li><li> Hücre canlılığı değerlendirmesi <ol><li> 1x PBS içinde 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) &#39;in bir 5 mg / ml solüsyon -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) konur. </li><li> 12 oyuklu plakalar için, her bir göze MTT çözeltisi 100 ul ve hafifçe eşit dağılımını sağlamak için girdap. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de 15 dakika ila 1 saat boyunca inkübe edin ve mor renk değişikliği için bir mikroskop altında bakın. Mor bir mevcut ise, yeniden girdap ve mor gözlenene kadar, hücreler 5 dakika aralıklarla inkübasyona izin verin. Gerekli olan zaman miktan, her bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir. </li><li> Tüm mor renk hücreleri bıraktığı kadar tekrar pipet kullanarak, her bir MTT çözücü (izopropanol içinde 4 mM HCl ve% 0.1 NP-40), 700 ul ve 5-10 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir plaka (lar) kaya ya da . Mor iserenk, hücre çıkan çözücü ilave 200 ul ve girdap devam etmez. </li><li> Kaynaklar tutarlı ayarlar alındığı gibi, ancak 595 nm sürece, aynı zamanda kabul edilebilir olduğu, analiz için, her bir gözden 100 ul alır ve bir 96-çukurlu plaka içine koyun ve 570 nm kullanılarak bir plaka okuyucusu ile 630 nm&#39;lik bir referans dalga boyu ile oku. </li></ol></li><li> ALS Hayvan Modeli <ol><li> Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi. </li><li> Mutant SOD1 25 karşı standart primerler ile genotiplendirmesi gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> Mitokondri 2. izolasyonu NOT: Bu hızlı çalışır ve işlem boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak için önemlidir. <ol><li> Mitokondriyal yalıtım tamponu (MIB), omurilik yalıtım tamponu (SC MIB) ve deney tampon hazırlanması (EB) <ol><li> Öncesinde MIB ve EB için zaman aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın. </li><li> H2O, 70 ml Tris baz, 12.1 g çözülmesiyle 1 M Tris / MOPS yapmak 7.4 pH almak için kuru MOPS ekleyin. 100 ml finale ses seviyesini ayarlayın. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li><li> 80.2 K 2 HPO 4 ml ve KH 2 PO 4 19.8 ml karıştırarak 1 M Kphos olun. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> H2O ile 10 ml EGTA, 3.8 g eklenmesi ile 0.2 M EGTA / Tris yapmak Çözülmüş, ~ 30-40 ml kadar 1 M Tris / MOPS ekleyin. 50 ml oda sıcaklığında steril filtre ve saklamak için ayarlayın. PH ~ 6.7 olacağını unutmayın. </li><li> 10 ml yaparak, 1 M Glutamat yapmakGlutamik asit 1 M çözelti. Filtre sterilize ve mağaza 4 ° C. </li><li> Malik asit, 1 M solüsyon, 10 ml yaparak, 1 M MAlate&#39;I sağlayın. 50 mM Tris / MOPS ekleyin. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li><li> 200 mM sükroz, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 1 mM EGTA / Tris bir konsantrasyonda MIB sağlayın. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li><li> 250 mM sükroz, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörü kokteyli bir konsantrasyonda SC MIB olun. </li><li> 125 mM KCl bir konsantrasyonda EB yapmak, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 5 mM glutamat, 2.5 mM malat, 1 mM K fosfat, pH 7.4 ve 10 mM EGTA / Tris yer alır. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li></ol></li><li> Hücrelerin hasat öncesinde Ekipmanları hazırlık. <ol><li> Küçük bir cam kap ve homojenleştirme havaneli steril su ile üç kez durulanır ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Böyle bir standart matkap, hücre scra gerekli öğeleri toplayınpers, 1.5 mi, 15 ml ve 50 ml tüpler ve çözeltiler. </li></ol></li><li> Mitokondri İzolasyon <ol><li> Kültür Hücreler <ol><li> Her bir numune tipi için, hücreler iki T175 şişelerde. </li><li> Hücrelerdir ~% 90 konfluent sağlanması ve kontrol deneyi, ya da levha olarak kullanmak ve adım 1.2, yukarıda tarif edildiği gibi tedavi etmek. </li><li> Ve tezgah üstüne, aspirat ortam üzerinde 1x PBS ve her seferinde 15 ml iki kez yapışkan hücreleri yıkayın. </li><li> Tampon aspire ve şişenin tabanından yapışmayan hücreler giderilmiş şişeler kazıyın. </li><li> Her bir şişeye, girdap 1x PBS 15 ml ilave edilir, ve buz üzerinde tek tek 15 ml konik tüp ve yer aktarın. </li><li> Kazıma bir sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüj kullanılarak 700 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj tüpleri yapıldıktan sonra. </li><li> Aspire süpernatantlar ve MIB 1 ml her pelletini. </li><li> Her iki süspansiyonlar birleştirin ve homojenizasyon için, küçük bir cam kabına transfer edilir. </li><li> MIB Eklegeminin tampon ilk satırı ulaşana kadar. Üç kez geçirilerek orta hızda bir uçlu havan tokmağı ile homojenize hücreleri. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml&#39;lik bir konik tüp homojenleştirilir çözeltisini. </li><li> 18 gauge 1 ½ inç iğne kullanılarak bir 3 ml&#39;lik enjektöre çözüm çizin ve bir 27 ölçü ½ inç iğne ile buz üzerinde tekrar konik tüp içine sınırdışı. Hücre zarı bozulması için o gücü kullanmak için tüpün iç duvarına karşı çözüm sınırdışı etmeye özen gösterin. </li><li> Beş kez toplam şırınga adımları tekrarlayın. </li><li> Sallanan kovalı rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüjü içinde 600 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüje çözeltisini. </li><li> Dikkatle süpernatant kaldırmak ve üç 1.5 ml tüpler arasında dağıtmak. NOT: Mitochohücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise ndria, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri. </li><li> Aspire süpernatanları 100 ul MIB pelet birleştirmek ve hemen buz üzerine yerleştirin ve. Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır. </li></ol></li><li> Fare dokularından Mitokondri izolasyon <ol><li> IACUC protokole göre fare anestezisi. Anestezi ikna etmek için% 5,0 bir buharlaştırıcı ayarlayın. Göz yaklaştı veya bir pamuklu çubukla vurdu zaman hayvan ayak tutam veya kırpma refleksinin için refleksi eksikliği ile anestezi olduğunu doğruladı. % 1.5 ile% 2.0 arasında Buharlaştırıcı&#39;yı tutarak tüm cerrahi prosedür için anestezi altında fare tutun. </li><li> Hariçimkb PBS 1x buz soğuk ayrı ayrı hayvan ve yerden karaciğer ve spinal kord - / - herhangi bir kan uzakta durulayın. </li><li> Karaciğer için, buz üzerinde bir ağırlık çanak doku transferi ve 1 dakika boyunca taze jilet kullanarak ince parçalar halinde doğrayın. </li><li> Tampon ilk satırı ulaşıncaya kadar kaba doku ve (omurilik için karaciğer ya da SC MIB için MIB) uygun tampon ekleyin. Beş geçer elle havan ile doku homojenize. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Homojenatlar 15 ml tüpler temizlemek için aktarın. </li><li> 750 x g&#39;de, 10 dakika süre ile 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri. </li><li> Temiz tüpler içine Süpernatantlar kaydedin ve buz üzerine koyun. Not: hücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise mitokondri, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır. </li><li> Omurilik pelet yeniden askıya in SC MIB 500 ul. </li><li> Sadece SC MIB ile damar yarım bu kez dolum, her üç kez yeniden homojenize. </li><li> Taze tüp yeni Homojenat aktarın. </li><li> Santrifüj 750 x g&#39;de, 10 dakika süre ile 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor. </li><li> Her örnekten ilk süpernatant ile, daha fazla mitokondri içeren bu yeni süpernatanlan, birleştirin. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri. </li><li> Aspire süpernatanları 500 MIB ul ve 50 ul SC MIB omurilik peletler karaciğer pelet tekrar süspansiyon ve hemen buz üzerine yerleştirin. Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır. </li><li> Çözelti içinde mitokondri konsantrasyonunu tahmin etmek için bir protein konsantrasyonu analizi gerçekleştirir. Talimatı uygulayınticari bir Protein Deney Kiti veya benzer bir yöntemle 26 ile s. Mitokondri tipik konsantrasyonlar şunlardır: 2 T175 şişesi verim ~ 2 mg / ml, 1 fare karaciğer ~ 3-5 mg / ml ve 1 fare omurilik ~ 1-3 mg / ml olmuştur. </li></ol></li></ol></li><li> (Üretici tarafından sağlanan protokol uyarlanmış) Quantikine ELISA Kit c bir Ar-Ge Sıçan / Fare Sitokrom kullanarak sitokrom-c tahlil. <ol><li> Hemen tepkileri kurmadan önce, EB ile 0.5 mg / ml çalışma konsantrasyonu mitokondri sulandırarak reaksiyonları (tüp başına mitokondri tipik haliyle 30-50 ul) 1.5 ml tüpler içinde seyreltilmiştir mitokondri dağıtın. </li><li> Seyreltilmiş mitokondri, toplam hacminin% 1, EB veya DMSO ya ekleyin ve 7-10 dakika tezgah üstünde tepkileri kuluçkaya yatmaktadır. Daha uzun bir zaman diliminde gerekli olup olmadığını Bu reaksiyonlar, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca stabildir. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika ve dikkatli bir 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondrily süpernatant ayrı ve ayrı bir 1.5 ml tüpler her koyun. Not: tüpler her iki sonraki analiz için -20 ° C&#39;de donduruldu ya da hemen kullanılabilir. </li><li> Bir pelet ve süpernatan 27 sitokrom c konsantrasyonunun karşılaştırarak sitokrom c salınmasını belirler. <ol><li> 1x PBS içinde% 0.5 TX-100 ile reaksiyonun orijinal hacminin pelet çözündürülmesi ile örnekleri hazırlanır. </li><li> Her numune için, ELISA plakasına 2 kuyu, hemen çözündürülmüş pelet için bir sitokrom C bitişik 100 ul ilave edilerek tepkime üstte yüzen madde için bir hazırlama (şişeden doğrudan kullanımı) artı% 0.5 Tx 100 ul 1x PBS içinde 100 ve daha sonra, tüm topak ya da süpernatan numunesi arasında. </li><li> Yavaşça, Kapağı karıştırın ve 1 saat, 37 ° C inkübe 20 saniye plaka düşük ayar (seviye 2-4) girdap. </li><li> Daha sonra, üretici göre plaka seyreltilmiş yıkama tamponu ile dört kez yıkayıner talimatları. Kağıt havlu üzerine kuyu dokunarak herhangi bir aşırı çözüm çıkarın. </li><li> Her bir çukura 1 A + B geliştirme çözeltisi ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20-30 dakika süre ile plaka inkübe: Daha sonra, 1 150 ul ilave edin. </li><li> Son olarak, her bir durdurma çözeltisi 50 ul ve bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 540 nm de absorbans okumaları alır. Her reaksiyon için yüzer genel peletindeki sitokrom c değeri ile karşılaştırılması suretiyle sitokrom C salınımı miktarını hesaplayın. </li></ol></li></ol></li></ol> Mitokondriyal (Dys) fonksiyonu 3. Değerlendirme <ol><li> Reaksiyonları ayarlanır hemen önce, 0.5 mg mitokondri seyreltik / ml EB konsantrasyonu çalışma ve (mitokondri tipik haliyle 30-50 ul tüp başına kullanılır) reaksiyonlar için 1.5 ml&#39;lik tüplere yerleştirildi. </li><li> Mitokondriyal tedaviler <ol><li> 50 nM Valinomycin ile karıştırılır FCCP uygun tedavinin ekleyin (EB kontrol, 1 uM, 10 uM rotenon, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN ya da 200 uM ATP, nihai konsantrasyon) ile seyreltildi mitokondri toplam hacmine inci 10/01 reaksiyonu da ayırmak için. 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe. NOT: zararlı olabilir deri yoluyla kazara yutulması veya emilim gibi bu maddeleri kullanırken dikkatli alınmalıdır. </li><li> 100 uM&#39;lik bir çalışma konsantrasyonunda steril su içinde yeniden teşekkül ettirilmiş ve 2 uM, -20 ° C&#39;de saklandı, TMRE seyreltin ve mitokondriyal reaksiyon hacmine eşit bir hacim ilave edin. </li><li> 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondri. </li><li> Yük, bir 396-kuyulu bir levha üzerine, her numune süpernatanı hacminin yarısı floresan okuyun. NOT: TMRE uyarma ve emisyon dalga boyları için kullanılacak hacim ve plaka kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak optimize edilmelidirdeneyi. Uyarım / emisyon dalga boyları kullanılarak 1 uM TMRE 25 ul standart 384 oyuklu siyah plaka (nihai reaksiyon konsantrasyon) ve en yüksek sinyal elde edildi kullanılarak &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Kontrol (EB) ve kontrol örneğinden RFU deneysel örnek için plaka okuyucu elde edilen göreceli floresan değerini (RFU) bölünmesi ile her tedavi arasında floresan kat-farkını hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Madeira, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mitochondrial+bioenergetics.">Overview of mitochondrial bioenergetics.</a> Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).</li><li>Sakamuru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+homogenous+membrane+potential+assay+to+assess+mitochondrial+function.">Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function.</a> Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).</li><li>Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+genome.">Structure and function of the mitochondrial genome.</a> Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).</li><li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+import+system+of+mitochondria.">The protein import system of mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).</li><li>Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+reversible+binding+of+the+presequence+at+the+trans+side+of+the+outer+membrane+drives+partial+translocation+and+unfolding.">Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding.</a> Cell. 80, 127-137 (1995).</li><li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+mitochondrial+cell+death.">The pathophysiology of mitochondrial cell death.</a> Science. 305, 626-629 (2004).</li><li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins.">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).</li><li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+BCL-2+proteins.">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404 (2009).</li><li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition.">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).</li><li>Wu, C. C., Bratton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intrinsic+apoptosis+pathway+by+reactive+oxygen+species.">Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).</li><li>Kuwana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly.">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).</li><li>Joshi, D. C., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+in+live+rat+cortical+neurons.">Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons.</a> Journal Of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model+of+ALS:+part+I,+background+and+methods.">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods.</a> Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).</li><li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model+of+ALS:+part+II,+results+and+discussion.">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion.</a> Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).</li><li>Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intact+mitochondria+from+neonatal+rat+brain.">Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain.</a> Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).</li><li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies.">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy:+targeting+the+mitochondrial+cell+death+pathway.">Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway.</a> Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).</li><li>Del Gaizo Moore, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+lymphocytic+leukemia+requires+BCL2+to+sequester+prodeath+BIM,+explaining+sensitivity+to+BCL2+antagonist+ABT-737.">Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia.">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production.">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li><li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes.">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li><li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+optical+oxygen+sensing:+protocols+and+critical+analyses.">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis.">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Rekombinant sitokinler ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi 48 saat (Şekil 1) üzerine hücre ölümü orta miktarda neden olur. TNF-alfa, muamele ile uyarılan hücre ölümünün miktarı önceki çalışmalara 30 benzer ve hücre canlılığı, tek başına de literatürde 31,32 ile uyumlu olan herhangi bir sitokin olan belirleyici miktarda daha büyük olan çok sayıda sitokin birlikte uygulanmasından sonra azalır. miktarları ve sitokin tedavileri türleri yanı sıra bireysel sitokinler kokteyller karşılaştırmasını ayarlamak için yeteneği böbrek hücreleri sitokin maruz belirli etkilerini incelemek için, bu hücre kültürü modeli cazip kılmaktadır. Ayrıca, sonuçlar, çok tekrarlanabilir ve kolayca (Şekil 2) elde bulunmaktadır. Akılda tutulması gereken hususlar hücrelerin izdiham içerir. % 70-80 con tedavi, örneğin,% 100 izdiham tedavi hücreler, sitokinlerin aynı konsantrasyonlarda için iyi cevap vermezlerakıcılık. Hücre yanıtı muhtemelen (eritme çok daha fazlasını 8-12 hafta) çok uzun kültür yapılmış olan etkilenebilir Bundan başka, hücrelerin aracılığıyla gitti geçitlerinin sayısı, takip edilmelidir. Sitokinler ile kültür hücreleri tedavi hücre canlılığı ve daha sonra mitokondriyal sağlığı azalırken, hiçbir sepsis başına bir modeli anlamına gereğidir. Bununla birlikte, klinik olarak daha anlamlı bir modelinin kullanılması, örneğin uyarılmış THP1 hücreleri 33 doğal olarak salgılanan sitokinler ile fare ve / veya tedavisi izole primer böbrek hücrelerini kullanmak gibi, bu işin doğal bir uzantısıdır. Mekanizmaların içine ilk fikir yanı sıra önleyici veya müdahale tedavileri gibi ilaç bileşiklerin etkinliğini test etmek için bir ön platformu sağlayabilir mitokondri sepsis sırasında böbrek yetmezliği anlayış boşluğu, bu tür hücre kültürü modelleri ve değerlendirme göz önüne alındığında. Mitokondri kültürlenmiş hücreler ya da hayvan dokularından izolehızla mitokondriyal sağlığı üzerindeki hücre tedavileri veya hastalığın ilerlemesi etkisini değerlendirmek için kapasitesini göze. İzolasyon ve değerlendirme protokolleri teknik gerçekleştirmek için talep değildir ve kolayca diğer hücre çizgileri veya birincil dokular ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Her numune türü için kullanılan MIB ve EB belirli bir hücre veya doku tipi farklı gereksinimleri varsa gerekli ayarlanabilir iyi bir başlangıç ​​tarifleri vardır. Omurilik protokolü 15,34 ile birlikte Örneğin, yağlı asitsiz BSA ek olarak, nöronlar kullanım için genellikle gereklidir. hücre parçalama yöntemi de tam tersi daha fazla şırınga sınırdışı kullanarak veya el değiştirme homojenizasyon yerine bir matkap kullanarak veya tarafından değiştirilebilir. Omurilik mitokondri prosedürü olarak yapıldığı gibi Ayrıca, ilk santrifüj pelet yeniden homojenizasyon, mitokondri, tatmin edici bir miktarda elde etmek için gerekli olabilir. Bir izolasyon protokolü uygulanabilir mitochondri üreten iyi bir göstergeBir ELISA c sitokrom kullanılmasıdır. Bu deney, sitokrom C salınımı batı leke analizi için hızlı ve kolay bir alternatif olabilir ve ayrıca, peptitler veya başka bileşikler 19,27 ile mitokondri tedaviden sonra sitokrom C salınımı için faydalı bir değerlendirmesidir. Seçenek olarak ise, TMRE protokol geliştirme sırasında kullanılabilir, ancak sağlıklı olmak için bilinen bir numuneden izole mitokondri değerlendirmek için önemlidir. Rutin olarak literatürde tarif olmayan fare dokularından mitokondri izole ederken temel oluşturulması için kullanılan başka, karaciğer mitokondri de bir pozitif kontrol olarak hizmet edebilir. Örneğin, bu protokolde olduğu gibi, her hayvandan, hem protokol geliştirme yanı sıra deneyler sırasında karaciğerleri de çıkarıldı ve mitokondri izolasyonu için kullanılan. Bir hazırlanması için diğer bir husus izolasyon prosedürü sonunda elde edilen mitokondri miktarıdır. Mitokondri konsantrasyonu daha sonra 1 mg / ml veya daha az iseTahlil sonuçları güvenilmez (yayınlanmamış gözlemler VDGM) ispat edebilir. Her iki başlangıç ​​malzemesi, MIB tarifi veya bozulma yöntemi miktarı fonksiyonel deneyleri geçmeden önce optimize edilmelidir. Başarılı bir izolasyon protokolü ulaşıldıktan sonra, mitokondri, aynı zamanda, toplam ATP içeriğine ve ATP üretimi 13,14 gibi tahlillerde de kullanılabilir. Burada açıklanan mitokondri fonksiyonu protokolü standart floresan plaka okuyucu kullanarak potansiyel algılama boya TMRE mitokondriyal alımı dolaylı ölçümü sağlar. Mitokondri izole edilmiş ve uygun bir kimyasal ilave edildikten sonra, bu TMRE ile inkübe edilir ve ardından tane haline getirilmiştir. Bu tür multi-ilaça dirençli taşıma ATP akı gibi değişkenler karıştırıcı, bütün hücreler veya hayvanların tedavi edilmesi ve değerlendirme ΔΨ önce mitokondri izole edilmesi ile önlenir. süpernatant floresan miktarı daha sonra mitokondri sağlıklı anlayışı ile analiz edilirgüçlü bunların ΔΨ ve TMRE bu nedenle daha alımı. Sonuç olarak, üstte kalan sıvı floresan miktarı sağlıksız mitokondrilerde sağlıklı mitokondrilerde daha az, daha fazla olmalıdır. EB-tek tedavi, bu kontrol ve bağlanmamış mitokondri arasındaki floresan kat fark olmak üzere hesaplanabilir. Run reaksiyonların her set ile diğer önemli kontrol yalnız TMRE olduğunu. Bu kumanda sonucu mümkün olan en yüksek floresan okunmasını sağlar. TMRE Yeni seyreltilmiş olan reaksiyonlara ilave yana doğal farklılıklar bulunmaktadır. Örneğin, ~ 20.000, 25.000 ve 30.000 TMRE sadece okuma protokol gelişimi sırasında çeşitli zamanlarda elde edildi. Tedavi mitokondri muamele edilmemiş önemli ölçüde farklı değildir ve / veya, eğer TMRE sadece sinyal tedavi mitokondri örneklerin herhangi bir daha büyük ise, daha sonra birleştirilmiş mitokondri izolasyon başarılı muhtemelen değildi. ΔΨ azalma elde edilen bir oranı ile ölçüldüğü haliyleBu protokol zaman kontrolü için daha önce rapor miktarlarda, sağlıklı hücrelere 2,35 benzer. Kontrol izole mitokondri, muamele edilmemiş HEK-293T hücreleri ve * 3 sitokin ile muamele edilmiş hücrelerden ΔΨ değişikliklerin karşılaştırması MTT testinin gözlenen azalma hücre canlılığı mitokondri fonksiyonlarında azalma çevirir gösterdi. Burada 13,14 gösterildiği gibi bu levha okuyucu deneyi kolaylıkla herhangi bir kaynaktan izole edilmiş ve ALS gibi hastalık modellerinde incelemek için kullanılan mitokondri ile kullanılabilir. Çeşitli çalışmalar, bu plaka okuyucu testinin oluşumunda önemli olduğunu MOMP, algılamak için mitokondri özel floresan boyalar kullanılmıştır var. Ancak, bu çalışmalar bloke bileşikler ekran veya MOMP 35,36 neden, keşfetmek, yeni ΔΨ algılama boyalar 2 ya da böyle bir mikroçip 37 flow sitometri gibi diğer formatları tanımlamak için tüm hücreleri kullanmak ya. O reklamı açıklar ki bu protokol benzersizetailed yöntem izole ve hızla bilinen ΔΨ değiştiren bileşikleri yanıt yoluyla tüm hücre tedavisinin etkilerini araştırmak için mitokondri kullanmak için. Bu protokol, eşleşmeyenler ve önleyicilerinin çeşitli kullanır, ve bunların herhangi bir mitokondriyal durumunu değerlendirmek için uygun olacağını gösterir. Dolayısıyla, hücre stres veya artan hücre fonksiyon bozukluğu mitokondriyal değişiklikler bu özel araştırma merkezleri, protokol, spesifik bileşikler ve / veya süksinat ve NADH elektron kaynaklarının eklenmesi aracılığıyla olan mitokondrial metabolizmanın değişiklikleri keşfetmek için kullanılabilir iken . İzole mitokondri değerlendirmesini gerçekleştiren Önemli hususlar tedavi hacimleri tutarlılık, MIB mitokondri tutmak ve tedaviler kurmak olacak hemen önce EB onları seyreltilmesi ve onların ΔΨ hala emin olmak için izolasyon 3 saat içinde mitokondri kullanarak içerir korunur.örneğin JC-1 gibi diğer mitokondriye özgü floresan boyalar üzerinde TMRE seçimi küçük konsantrasyonlarda ve tek bir dalga boyu kullanılarak floresan analizi basitliği kullanma yeteneği kaynaklanmaktadır. Bu yöntem benzer ancak plaka okuyucu kullanımı daha az zaman alır ve daha az optimizasyon 35 gerektirir, floresan mikroskopi kullanılarak 2,38 veya sitometri 37 akış yapılabilir olabilir. Clark elektrodu 22 (Del Gaizo Moore, yayınlanmamış gözlemler) ile karşılaştırıldığında ek olarak, bu protokol çok daha az teknik olarak zor, daha hızlı gerçekleştirmek için, ve daha kolay tekrarlanabilir. Her bir mitokondriyal tedavi miktarda titre mitokondriyal fonksiyonu ve konsantrasyonlarının optimum hakkında daha ileri bilgi sağlayabilir yapılmalıdır. Mitokondriyal reaksiyonların toplam hacmi izolasyonu olarak gerekli tedavi reaksiyonlarının sayısı sırasında elde edilen örnek miktarı uygun olarak ayarlanabilir. 50 μ mümkün değilse, standart bir miktarL kullanılır; Bununla birlikte, mitokondri uygun olarak yaklaşık 20 ul güvenilir sonuçlar verir. ΔΨ oksijen tüketimi korelasyon olsa, tahlil doğrudan oksijen tüketimini ölçmek değil sundu. Örneğin MitoExpress floresan oksijen algılama sistemi geliştirilmiştir birlikte, muhtemelen bir Clark elektrodu yukarıda anılan kullanarak yukarda bazı önlemek için, reaksiyon başına fiyat ve deney başına mitokondri büyük miktarlarda gereklilik sınırlayıcı sorun olarak kalmaktadır. Bu nedenle, TMRE ve klasik ΔΨ eşleşmeyenler ya da inhibitörlerin kullanılmasının birçok avantajı vardır. Yine, birden çok numune ya da çok sayıda tedavinin / numune, yeniden üretilebilirlik, düşük miktarda başlangıç ​​malzemesi ihtiyaç ve / veya reaksiyon başına gerekli olan izole edilmiş bir mitokondri daha az miktardaki küme analizi, bu protokol, ilgi çekici hale getirmektedir.

Yaşayan hücreler yağ ve karbonhidrat şeklinde metabolik enerjiyi banka ve biyosentezi, membran taşıma ve hareket için bu enerjiyi kullanır. Bazı enerji glikoliz sırasında doğrudan ATP içine beslenme şekerlerin dönüşüm yoluyla sitosol içinde elde edilmektedir. Bununla birlikte, bir hücre ATP üretiminin başlıca kaynağı mitokondriyal solunum zincirinde 1 ile mitokondri içinde yararlanır. mitokondri yapısı, etkili ve verimli bir ATP üretimi için gerekli olan uzaysal yönlendirilmesini sağlar. Mitokondri bileşenleri bir zarlar arası boşluk ve birlikte matris içteki mitokondriyal bölme, ev ile ayrılmış bir çift zar sahip ve ATP üretimi dahil kimyasal reaksiyonları koordinat. iç zarı solunum zinciri gibi ATP sintaz, ATP oluşumu için bir araya ADP ve Pi getiren protein kompleksi ihtiva zara bağlı protein komplekslerinin bir dizi içerir. haner membran kristalı içine katlanmış ve elektronlar sitokrom-c, zarlar arası alanı içinde kompleksleri arasında hareket eden bir çözünür elektron taşıyıcı aracılığıyla solunum zinciri kompleksleri boyunca iletilir. Elektronlar hareket ettikçe, indirgeyici eşdeğerleri oksidasyon oluşur ve hidrojen iyonları zarlar arası boşluğa matristen pompalanır. Zarlar arası alanı içinde yüksek iyon konsantrasyonunun bir sonucu olarak, bir elektrokimyasal gradyan iç mitokondriyal zarın (Δψ) 2 üzerinde bir zar potansiyeli elde oluşturur. Oksijen elektron taşıma zincirinin son elektron alıcısı ve hidrojen iyonları matriks geri arası boşluğa ATP sentezler akan ve bunu doğrudan yaparken ATP oluşumuna neden olur. Bütünüyle tarif edildiği gibi bu işlem, oksidatif fosforilasyon gibi bilinmektedir. krista kıvrımlar maksimal elektron taşıma ve ATP üretimi içinde sağlayan, iç zarı yüzey alanını arttırmakHer mitokondri. proteinler, enzimler ve oksidatif fosforilasyon ile ilgili diğer moleküller, nükleer ve mitokondriyal genlerin elde edilir. Mitokondri 13 protein olarak tRNA&#39;ların ve ATP üretimi için gerekli olan 3 mRNA için kendi dairesel DNA kodlama içerir. Bununla birlikte, çok daha fazla protein gereklidir ve böylece kodlanan nükleer bulunmaktadır. Bu, nükleer-şifrelenmiş proteinlerin çoğunluğu ön-madde proteininin N-terminalinde presequences kullanımı ile mitokondrial matris hedeflenir ve bunların alma Δψ 4,5 kısmen tahrik edilir. Bir hücrenin Biyoenerjetiğin katkıda ötesinde, mitokondri, aynı zamanda, TCA ve beta-oksidasyon düzenleyen kalsiyum yoluyla hücresel sinyal, aynı zamanda apoptoz 6 önemli bir rol olarak önemli metabolik süreçleri de etkilemektedir. Özellikle, hücresel stres zamanlarında, üzerinde ikamet veya BCL-2 ailesi proteinleri mitokondriyal neden olabilir mitokondriyal dış membran etkileşimdış membran geçirgenliği (MOMP) 7,8. MOMP sırasında, sitokrom C ve diğer proteinlerin çeşitli sitosolik proteinler ile birlikte karmaşık bir apopitozom 9,10 adı oluşturan sitozolüne yayımlanan ve edilmektedir. apopitozom apoptoz yürütme aşamasında hücresel proteinler ve DNA parçalamak için gitmek kaspazlan harekete geçirir. MOMP meydana bitmez, ΔΨ çöktü ve ATP üretimi durdurdu. Bu nedenle, apoptoz gibi başlatılır mitokondriyal fonksiyonu ele geçirilmiş ve ΔΨ değişiklikler mitokondriyal ve hücre sağlık 12 ile korele edilebilir. Apoptoz da hastalık oluşmasından ve / veya ilerlemesi hakkında değerli bilgiler elde edebilirsiniz birçok hastalık modelleri, ΔΨ için mitokondriyal fonksiyon ve değişiklikler bir son nokta iken. Örneğin, mitokondriyal yapısal ve fonksiyonel değişiklikler nörodejeneratif hastalıkların 13,14 sırasında belgelenmiştir. Protokol, iso ilk bölümündeonların ΔΨ muhafaza sağlam mitokondri lation tarif edilmektedir. HEK-293T hücreleri apoptozisini sağlamak için farklı konsantrasyonlarda ve yeniden birleştirici TNF-α, IL1-β ve IFN-γ kombinasyonlarına maruz bırakıldı. Sık sık kendi reseptörüne bağlanmasının 6, TNF-α etkileşimi tarafından tetiklenebilir primer insan septik örnekleri 15 ve apoptoz harici yolunun yüksek olduğu rapor edilmiştir, çünkü bu sitokinler seçilmiştir. Kültürlenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, primer dokulardan işlevsel mitokondria izole etmek için gerekli ince varyasyonlar olduğundan çok fazla araştırma hayvanları kullandığı için, ve protokol, aynı zamanda, karaciğer ve lateral skleroz (ALS) fare modeli ön omurilik ile ilgili mitokondri izole açıklamaktadır. protokolü ikinci bölümü bir flüoresan plaka okuyucusu ile potansiyel duyarlı fluoresan boya kullanılarak mitokondriyal membran potansiyeli düzensizlikler izlemek için geliştirilmiştir. FarkHücresel durumu (sağlıksız vs yani, sağlıklı) arasındaki ın mitokondrial membran potansiyelinin dağılımı neden bütün bunlar ayrılması ajanlar, solunum zinciri inhibitörleri, karmaşık inhibitörleri ve iyonoforlar ile birlikte izole mitokondri ΔΨ gücünü nicelleştirilmesiyle ayırt edilir. Bu nedenle mitokondri tepki mitokondriyal (dis) fonksiyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir mitokondriyal inhibitörleri ile tedavi üzerine ΔΨ değişimi geniş, mitokondri sağlıklı. Yerine fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi daha izole mitokondri kullanımı patoloji veya tedavi doğrudan organele 16-18 değişiklikleri modüle kesin kanıt sunmaktadır. Kültürlü hücrelerden mitokondri izole etmek literatürde yöntemler varken, bunlar belirsizdir 17 ve / veya özel ekipman 16 kullanmaktadır. Bu protokol detaylı izolasyon yöntem açıklanır ve birbirincil doku ve kültürler 13,14,19,20 dahil olmak üzere diğer hücre çizgileri, kolayca uyarlanabilir. Birçok izole mitokondri çalışmaları bu protokolde ama Clark elektrodu ile kullanılan aynı mitokondriyal eşleşmeyenler ve inhibitörleri tekrar ekipman çok özel ve özel parça, (21 literatürde birçok kağıtları temsili bir örnektir) kullanmaktadır. Ayrıca, bu, geleneksel bir yöntem, düşük verim ve yüksek bir karmaşıklık 22,23 gibi sınırlılıklara sahiptir ve mitokondri önemli miktarda (~ 500 ug / reaksiyon) gerektirir. Bu protokol, floresan zara algılama potansiyel sistemi TMRE standart makine birçok laboratuvarda bir floresan plaka okuyucu ile birlikte kullanılır. Bu hızlı bir şekilde hücreler ve izole mitokondri girer ve düşük konsantrasyonlarda 24 kullanılabilir çünkü TMRE yaygın olarak kabul edilmektedir. Çoklu reaksiyonlar hızla tandem kurulabilir ve toplu bu protokolü kullanılarak analiz. Ayrıca, reaksiyonin izole edilmiş bir mitokondri (~ / reaksiyon, 10 ug) &#39;in bir çok küçük bir miktar gerekmektedir. Daha az malzeme gerektiren, daha küçük doku ya da hücre kültürü numuneleri mitokondri izolasyonu için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir, daha çok kez tekrarlandı ve reaksiyon kurmak ve ATP üretimi, oksijen tüketimi, ithal gibi izole edilmiş bir mitokondri deneyleri için potansiyel olarak yeterince malzeme olabilir tahliller yapılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi (x 3), 24-48 saat boyunca hücre ölümü aşamalı miktarlarda (Şekil 1A yol açar ). Hücre canlılığı MTT denemesi kullanarak değerlendirilmiştir ve sürekli olarak ~ 24 saat, tedaviden hücre canlılığını% 10 azalma ve 48 saat tedavi ile ~% 20&#39;lik bir düşüş olduğunu göstermektedir edildi. Bireysel sitokinler ile benzer konsantrasyonlarda (100 ug / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ), 48 saat sonra benzer bir hücre ölümü sonuçlar ve tedavi ile tedavi edilen hücreler ortaya koymaktadır düşüş, canlılığı Kombinatoryal için (Şekil 1B) etki kaynaklanmaktadır. Şekil 1B canlılığı veriler 3 ayrı deneyde üç kopya halinde her bir çalışma ortalama +/- standart sapmasını temsil eder ve hata çubukları, sıkılığı veri tekrarlanabilirlik göstermektedir. sitokinlerin miktarı daha elucidat bu tedavi protokolünde ayarlanabilirhücre ölümü üzerindeki her bir sitokin katkı e ve ilave sitokinler veya diğer faktörler aynı zamanda şu şekilde sürece uygun kontrollerin yürütülür, dahil edilebilir. Hücrelerden ve dokulardan mitokondri izolasyonu 1940 28,29 beri literatürde tarif edilmiştir. işlem için öncül ham mitokondri ~ 10,000 x g&#39;de topak haline bilinmektedir diferansiyel santrifüjleme, ardından hücre bozulmasıdır. İzole mitokondri kullanan birçok protokoller kendi membran potansiyelini sürdürebilir sağlam çift membranlar gerektirir, ve bu nedenle izolasyon tamamlandıktan sonra bütünlüğünü değerlendirmek gereklidir. Kültürlenmiş HEK hücrelerinden mitokondri izolasyon protokolünün geliştirilmesi sırasında, bir sitokrom C deney sağlam mitokondri elde edilmiştir olmadığını belirtmek için kullanılmıştır. ELISA kitleri edilen ticari olarak satılan sitokrom kullanarak, mitokondri sonra izole edildikten sonra ölçülmesi ve EB seyreltildi ve ya her EB ya da DMSOeklenmiş ve reaksiyonları tezgah üstünde kuluçkaya için. Daha sonra üstte kalan sıvı kısmın çevreleyen mitokondri ayırarak, her iki fraksiyondan sitokrom C içeriğinin aşağıdaki şekilde analiz mitokondriyal membran bütünlüğü için ve bir göstergesi olarak kullanılmıştır; sitokrom c çoğunluğu sonra mitokondriyal pelet içinde tutulan sitokrom c fazla% 15 süpernatan içinde bulunursa, o zaman mitokondri fonksiyonel çalışmalar için uygun olmadığı ise mitokondri, bozulmamış olarak kabul edilmektedir. Tablo 1 &#39;de görüldüğü gibi, izole edilmiş mitokondri ön işlemden DMSO ile olduğunda, protokol verimi ~% 12 sitokrom c salınımı ve ~% 15 tanımlamıştır. Benzer sonuçlar diğer hücre çizgileri ya da hayvan dokuları 19,20,27 izole mitokondri için daha önce rapor edilmiştir. Seçenek olarak ise, mitokondriyal bütünlüğünü de fare karaciğer ve omurilik mitokondri izolasyonu sırasında kullanılan TMRE ile değerlendirilebilir. İlk izolasyon protokolü developme sırasındant çalışmalar karaciğer ve sağlıklı, normal farelerin mitokondri omurilik izole mitokondri değerlendirildi. Her numune için, ΔΨ FCCP + Valinomycin (Tablo 2) ile inkübe kişilerce EB ile muamele izole mitokondri floresan sinyalinin karşılaştırılması suretiyle değerlendirildi. 1&gt;, işlenmiş ve işlenmemiş Mitokondri arasındaki floresans bir oran sağlıklı, dokunulmamış mitokondri bir gösterge olarak kullanıldı. Başarılı mitokondri izole etme protokolleri geliştirilmiştir sonra, mitokondri kontrol, işlem görmemiş hücrelerden izole edilir ve * 3 sitokin ile işlenen hücrelerde ya da normal ve SOD1 fareler analiz edilmiştir. Her iki gruptan HEK mitokondri TMRE alımına değişiklikleri ile ölçülen çeşitli eşleşmeyenler ve inhibitörleri ve ΔΨ ile muamele edildi. Kontrol EB kat farkı, yerel (/ tedavi edilen mitokondri inhibitör iki grup arasında ΔΨ mukavemetinde bir fark olduğunu gösterir uncoupler temsili veriler ve mitokondri tedaviTablo 3&#39;te culations). Ayrıca, 3 tedavi hücreleri (Şekil 2) hücre canlılığı verileri doğrulayan, mitokondriyal sağlık sitokin tedavileri etkilenmiş olduğunu belirtmek * ile tedavi edilmemiş hücrelerden yüzde azalma. Dört ALS farelere göre karaciğer ve dört ayrı normal kontrol farelerinin omurilik izole mitokondri ile TMRE alımı ile ΔΨ gücünün değerlendirilmesi doku sağlık bu protokol kullanılarak tayin edilebilir olduğunu göstermektedir. ΔΨ kat farklılık ve yüzde azaldığı gösterildiği gibi, EB-muamele ve FCCP + kontrol ve hastalık ilerledikçe hayvanlardan mitokondri Valinomycin muamele karşılaştırılması önemli ölçüde farklı olduğu (Tablo 4, bakınız, aynı zamanda 13 ve 14 referanslar). <img alt="Şekil 1," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52076/52076fig1highres.jpg" width="500px" /> Şekil 1: Hücre ölümü teşvik* 3 işlenmesi suretiyle D&#39;nin (a) HEK-293T hücreleri, 24 veya 48 saat ve hücre ölümü ile tedavi edilmiştir. zamanla progresif ve bireysel sitokin tedavisi ile daha büyük olan, bir MTT testi ile ölçülür. Değerler kontrol ile normalize edilmiştir, işlem görmemiş örnekler ve veriler n için üçlü ölçümleri temsil etmektedir: = 3 +/- standart sapma. (B), HEK-293T hücreleri bireysel sitokinler veya bir kokteyl (* 3) 48 saat süre ile ve hücre ölümü değerlendirildi ile muamele edildi MTT tahlili ile. Veriler, tek tek sitokin ve n = 6 her biri için n = 5 * 3 temsil eder +/- standart sapma. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Pelet (AU) </td><td> Üst faz, (AU) </td><td> % Sitokrom c salınımı </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0,818 </td><td> 0.115 </td><td> 12.6 ± 2.27 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0,793 </td><td> 0.142 </td><td> 15.3 ±; 2.23 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Kültürlenmiş hücrelerden izole mitokondri sitokrom c Alıkonma Veriler, n = 4 ortalamasını temsil +/- standart sapma. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td> Karaciğer 1 </td><td> Karaciğer 2 </td><td> Omurilik 1 </td><td> Omurilik 2 </td></tr><tr><td fo:padding-top="17px" rowspan="3" style="vertical-align:middle;text-align:center"> RFU </td><td> EB </td><td> 97.830 </td><td> 94.132 </td><td> 339.716 </td><td> 290.154 </td></tr><tr><td> F / V </td><td> 435.188 </td><td> 461.299 </td><td> 385.366 </td><td> 482.480 </td></tr><tr><td> oran </td><td> 4.45 </td><td> 4.9 </td><td> 1.13 </td><td> 1.66 </td></tr><tr><td colspan="6"> EB = Deneysel tampon ve F / V = ​​FCCP + Valinomycin. </td></tr></tbody></table> Tablo 2:., Normal fare dokularından izole mitokondri ΔΨ ölçümü iki ayrı hayvanlar (örneğin, karaciğer, 1 ve omurilik 1 aynı hayvan vardır) tandem karaciğer ve omurilik mitokondri izole etmek için kullanılmıştır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td> EB </td><td> oligo </td><td> çürüme </td><td> KCN </td><td> ADP </td><td> F / V </td></tr><tr><td fo:padding-top="10px" rowspan="2" style="vertical-align:middle"> RFU </td><td> 0 </td><td> 4844 </td><td> 12.507 </td><td> 12.734 </td><td> 9925 </td><td> 10.892 </td><td> 4844 </td></tr><tr><td>* 3 </td><td> 6517 </td><td> 13.639 </td><td> 12.435 </td><td> 10,235 </td><td> 13.154 </td><td> 6517 </td></tr><tr><td fo:padding-top="9px" rowspan="2" style="vertical-align:middle"> Katlama Fark </td><td> 0 </td><td> NA </td><td> 2.58 </td><td> 2.63 </td><td> 2.05 </td><td> 2.25 </td><td> 2.65 </td></tr><tr><td> * 3 </td><td> NA </td><td> 2.09 </td><td> 1.91 </td><td> 1.57 </td><td> 2.02 </td><td> 2.18 </td></tr><tr><td> % Düşüş </td><td> 0 vs * 3 </td><td></td><td> 18.94 </td><td> 27.41 </td><td> 23.35 </td><td> 10.24 </td><td> 17.67 </td></tr><tr><td colspan="8"> EB = Deneysel tampon; oligo = oligomycin; = rotenone çürümeye; KCN potasyum siyanür ve F / V = ​​FCCP + Valinomycin =. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Hücre c Ham veriler ve hesaplamalarulture mitokondri deneyleri izole. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52076/52076fig2highres.jpg" width="500px" /> Şekil 2: Mitokondri sitokin ile muamele edilmiş hücrelerden izole edilmiş zar potansiyeli azalmıştır. Tablo 2&#39;de hesaplanan her bir muamele için 0 vs * 3 ΔΨ yüzdesi azalma, kontrol ile karşılaştırmalı olarak göstermektedir. Veriler ya da n = 2 (= 3 (oligomycin, rotenon, ve FCCP / Valinomycin) n çift reaksiyonlarda ortalamasını temsil etmektedir KCN ADP) +/- standart sapma. Kat fark hesaplamalara dayalı * = istatistiksel olarak anlamlı p-değerleri; p = 0.03, sırasıyla oligomycin, rotenone ve FCCP / Valinomycin, 0.01 ve 0.05. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td> Omurilik </td><td> Karaciğer </td></tr><tr><td fo:padding-top= &quot;11px&quot; rowspan = &quot;2&quot; style = &quot;vertical-align: orta&quot;&gt; Fark katlayın </td><td> Kontrol </td><td> 1.54 ± 0.48 </td><td> 3.20 ± 1.56 </td></tr><tr><td> SOD1 </td><td> 1.10 ± 0.30 </td><td> 3.12 ± 1.75 </td></tr><tr><td> % Düşüş </td><td></td><td> 28.1 </td><td> 2.48 </td></tr><tr><td> p değeri </td><td></td><td> 0.03 </td><td> 0.41 </td></tr></tbody></table> . Tablo 4: grup başına 4 hayvanların ortalamasını temsil FCCP + Valinomycin Data tarafından değerlendirilen Mitokondri SOD1 farelerin omurilik izole potansiyel membran azalmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue at JoVE.com

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

39.3K Görüntüleme.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

Video: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biyoloji

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...