We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

NOT: protokol üç parça larva sivrisinek, doğurganlık etkisini incelemek için yetişkin kadın için DZNep bir kan-tabanlı maruz kalma DZNep ilacın sulu pozlama tarif ve DZNep tarafından SAK hidrolaz önleme basit bir kolorimetrik tekniği kullanılarak ölçüldü. Bu tahlillerin bir şematik temsilidir, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Olgunlaşmamış Sivrisinek Geliştirme ve Sağkalım Tahliller NOT: Bu kısım, sivrisinek larvaları gelişimi ve hayatta kalma etkileyen bir suda çözünür ilaç kullanımını açıklar. <ol><li> Hatch A. 28 ° damıtılmış su içinde C (dH 2 O) ve arka onlara 2. evre larvaları ile gambiae yumurta. </li><li> Altı-çukurlu DNAz, RNAse içermeyen bir hücre kültürü plakası almak ve her bir oyuğa 10 mi DH 2 O dökün. </li><li> 2. instar de sivrisinek larvaları seçin ve iyi başına 15 larva ekleyin. Plaka 2. evre larvaları eklemeden önce, sfazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine bunları ut. </li><li> Renk kodlu bantlar ile Etiket kuyu deney rastgele. Her plaka (Şekil 2) test konsantrasyonu başına 2 kuyu etiketleyin. </li><li> DH 2 O, 1 ml, 0.3 mg DZNep eritilmesi ile, 1 mM DZNep hidroklorür (MW = 298,73) stok çözeltisi hazırlayın 0.5 uM ve 5.0 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için etiketli çukurlara DZNep.HCl stok solüsyonu eklenir. NOT: Stok solüsyonu 4 ° C&#39;de saklanabilir Kısa vadede (bir ay 1 gün) veya -20 ° C için Uzun vadede (uzun bir ay) için ° C. NOT: Yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda için stok solüsyonu ilave belirgin kuyulardan su hacmini değişmez. Bununla birlikte daha yüksek konsantrasyonları durumunda, bu bileşiğin herhangi bir gereksiz şekilde seyreltilmesinden kaçınmak için, larva ortam içinde çözülmesi için tavsiye edilir. </li><li> Her kuyuya pul balık yiyecek eşit miktarda ekleyin. Plaka Kapaks ve 28 inkübe Bir kuluçka ° C. </li><li> 24-saatlik maruziyet süresinden sonra DZNep-işlenmiş ve işlenmemiş larva sivrisinekler için mortalite kaydedin. Çıkarın ve herhangi bir ölü larva atın. Tüm larvalar kalıp kadar her gün bu kaydı tekrarlayın veya pupa ve yetişkin olarak ortaya çıkar. Bunlar pupa kadar larva büyüklüğü her iki günde bir, örneğin, gün 0, 2, 4, 6, 8 kaydedin. </li><li> Yeterli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak larva gelişimi ve mortalite verileri analiz. NOT: Çubuk grafik, Microsoft Excel&#39;de ölüm verileri temsil etmek için kullanılabilir. Çok Değişkenli Varyans Analizi (MANOVA) ilacın farklı dozlarının sivrisinek larvalarının önemli ölçüde farklı yaşam neden olmadığını ortaya çıkaracaktır gibi JMP ya da SPSS gibi bir yazılım ile seslendirdi. </li></ol> Kadın Sivrisinekler Yapay Besleyiciye sayesinde İlaç yönetme 2. Verimlilik Testi NOT: Bu bölümde kan a ilacın eklenmesini detaylarınd yapay besleyici sistemini kullanarak yetişkin dişi sivrisinekler için beslenme. <ol><li> Kontrol ve test kafes erkek ve dişi sivrisineklerin eşit sayıda yetişkin sivrisinek kafesleri ayarlayın. Kadın kadar kafesleri hem pamuk topları batırılmış% 10 şeker çözeltisi sağlayın (3-5 gün Anopheles gambiae için optimum olan) beslemek için hazırız. </li><li> 2 saat önce kan beslemeye, kadın aç sağlamak için pamuk topları kaldırmak. </li><li> Bir ters geniş alt cam huni (çap = 50 mm, uzunluğu = 70 mm) ve endüstriyel yapıştırıcı ile kapatılmış bir çevreleyen plastik oluşan iki yapay kan besleyiciler birleştirin. Girişi ve su çıkışı için bağlantı üzerinden iki besleyiciler &#39;çıkışları (çap = 10 mm) plastik borular (çap = 7 mm) takın. &quot;Kontrol&quot; ve iki besleyiciler Etiket &quot;5 mcM DZNep.&quot; </li><li> Beslenmesi için program kurmak, piyasada mevcut ısıtma elemanı kullanılması. &quot;Menü&quot; &quot;Ayarlar&quot; gidinve &quot;Ayar Noktaları&quot; seçeneğini seçin; Önceden yüklenmiş programlar görünecektir. &quot;SP1&quot; seçiniz ve 37 sıcaklığını ayarlamak ° C. NOT: ısıtma elemanı uygulanan kan, sabit bir sıcaklıkta muhafaza edilmesini sağlar. Ek program ayarları farklı sivrisinek ya da böcek türleri için de kullanılabilir. </li><li> Su ile bir kova doldurun ve suya ısıtma elemanı batırmayın. </li><li> Parafilm bir kare parça (50 mm x 50 mm) kesin ve ince bir zar film yapmak için streç. Parafilm ile yapay besleyiciler alt örtün. Parafilm (50 mm x 10 mm) başka bir parça kesin, onu germek ve besleyiciler kenarları mühür. </li><li> Tüpler tarafından besleyiciler ve ısıtma elemanı bağlayan, sistemi monte edin. Tamamlandığında, sistem üzerinde geçiş ve &quot;SP1&quot; seçeneğini seçin. Basın sistemini başlatmak için &quot;Enter&quot;. NOT: Su 37 ısıtılmış alacak C ° ve bu sıcaklıkta muhafaza edilmiştir. </li><li> Inci Monitörsu kova bir termometre kullanarak su e sıcaklığı. NOT: konnektörleri ve tüpler kan sıcaklığı 37 ° kalır, böylece sistem üzerinden sürekli bir su sirkülasyonu korumaya yardımcı ° C. </li><li> Herhangi bir kan dökülmemesi temizlemek için kullanılan olacak% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile bir düz dipli tepsiyi doldurun. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpüne defibrile koyun kan 2 ml ekleyin. &quot;Kontrol&quot; olarak etiketleyin. &quot;5 mcM DZNep&quot; &quot;5 mcM DZNep&quot; etiketli deneysel tüp DZNep stok solüsyonu (adım 1.5 bakınız) .Add 6 ul olarak etiketlenmiş deneysel tüp için işlemi tekrarlayın yavaşça bunu birkaç kez ters yüz edilerek kan ve ilaç karıştırın. Oda sıcaklığında tüpü 10 dakika kuluçkalayın. </li><li> Bir pipet kullanarak, uygun şekilde etiketlenmiş besleyiciler üstüne kontrol ve test kan 2 ilave edin. Çamaşır suyu çözeltisi içinde pipet atın. Karanlık bir çanta ile kafesi örtün ve f teşvik etmek periyodik kafesine havayı solumakbeslenmesi için emales. </li><li> Sivrisinek yaklaşık 30 dakika boyunca besleme olsun. Besleme tamamlandıktan sonra, besleyiciler almak, ısıtma elemanı kapatın ve Parafilm şerit. Yaklaşık 5 dakika için ağartıcı çözeltisi içinde besleyici daldırın ve iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın. </li><li> Besleyiciler çıkarın ve 48 saat için kafesleri şeker su ile pamuk topları koymak. Yumurtlama kolaylaştırmak için bir gecede kafeslerde su ve filtre kağıdı içeren bir yumurta yemek yerleştirin. Ilgili test veya kontrol konsantrasyonu her yumurta yemek etiketleyin. </li><li> Stereo mikroskop altında yumurta sayısını ve yapısını ertesi gün yumurta yemek çıkarın ve inceleyin. Q-colors5 yazılımını kullanarak görüntüleri edinin. Yumurta sayısını. Test ve kontrol kafesleri elde edilen yumurtaların sayısı farkı analiz edin. NOT: t-test yumurta sayısı (p ≤0.05) önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. </li></ol> Sivrisinek Enzim Önlemesinin 3. Biyokimyasal Deneyiİlaç tarafından NOT: Bu kısım, yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak DTNB kullanılarak, bir enzim aktivite deneyi tarif eder. <ol><li> DH 2 O 1 L HPO 4 Na 2 14.19 gr eklenerek bir 0.1 M Na-2 HPO 4 (dibazik sodyum fosfat) çözeltisi hazırlayın Daha sonra, DH 2 O, 1 L PO 4 NaH 2 13.79 gr eklenerek 0.1 M NaH 2 PO 4 (monobazik sodyum fosfat) bir çözelti hazırlamak </li><li> PH 8.5, 0.1 M NaH 2 PO 4 çözeltisi, 0.1 M Na-2 HPO 4 çözelti titre edilir. Not: Bu, 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) çalışma stok çözeltisi olacaktır. </li><li> % 0.3 Triton X-100 ilave edilerek 0,1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) içindeki bir homojen hale getirme çözeltisi hazırlayın. NOT: homojenizasyon çözelti 4 O ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Prepare 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5), 10 ml SAK 6.15 mg çözülmesiyle 1.6 mM SAK (MW = 384,4) çözeltisi eklendi. </li><li> 0,1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5), 10 ml DTNB 6.3 mg çözülmesiyle 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) çözeltisi hazırlayın. Kullanılana kadar buz üzerinde taze DTNB çözümü tutun. </li><li> 1 ml dH 2 O. DZNep 0.3 mg çözülmesiyle 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) çözeltisi hazırlayın Daha sonra, dH 2 O. 0.002 uM 1.000 uM konsantrasyonlarda bir seri içinde 1 mM DZNep çözeltisi seyreltik </li><li> DZNep tarafından SAH hidrolaz inhibisyonunu ölçmek için, sivrisinekler ham enzim özü hazırlanması: buz gibi soğuk 0.1 M NaH 2 PO 4 (pH 8.5) ihtiva eden% 0.3 Triton X-1 ml 10-olmayan kan beslenen yetişkin sivrisinekler homojenize 100, bir cam doku homojenleştirici kullanılarak. Bir 1.5ml mikrosantrifüj tüp Homojenat aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca Homojenat santrifüj. Temiz süpernatant aktarın1.5 ml mikrosantrifüj tüp. SAK biyokimyasal analiz için enzim kaynağı olarak supernatant kullanın. </li><li> Boş tedavisi için (yani, DZNep, enzim yok), 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB ve 100 ilave ul 0.1 M Na-2 HPO 96 oyuklu her bir gözeneğine 4 (pH 8.5), düz dipli mikroplaka. </li><li> Kontrol (yani, DZNep) için, 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB ilave, 50 ul 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) ve 50 ul enzim bireye (SAH hidrolaz ham özüt elde edilmiş) kuyular. </li><li> DZNep muameleler için, 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB, tek tek oyuklara 50 ul enzim ve 50 ul seçilen DZNep konsantrasyonu ekleyin. Tedavi ve kontrol başına 4 çoğaltır hazırlayın. </li><li> 96-çukurlu bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 20 saniye aralıklarla, 5 dakika boyunca 405 nm de SAK enzim örneklerin optik yoğunluk (OD) okuyun. </li><li> Kontrol a gelen boş OD çıkarmand tedavi OD de her elde. Aşağıdaki denklemi kullanarak SAK hidrolaz aktivitesini kalan yüzde hesaplayın:% Artık Aktivite = (Tedavi OD / Kontrol OD) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokolün başarılı bir uygulama için hayati birkaç adım vardır. Larva deneyi için, bakım doğru etiket ve her test konsantrasyonu çoğaltmak için alınmalıdır. Test örnekleri rastgele ve ilgili test kuyuları ilacın belirlenen miktarda ilave kurmak bu deneysel önemli bir parçasıdır. 96 oyuklu bir mikro-2 nci instar sivrisinek larvaları eklemeden önce, her bir larva fazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine konabilir. Kuruma önlemek için, larva hemen forseps bir künt çifti kullanılarak mikroplak kuyularına transfer edilmelidir. Bu her bir mikro-su hacmini sağlar ve beklendiği gibi, ilacın konsantrasyonunun devam etmektedir. Vücut uzunluk ölçüm larvaları aktarırken, bu sabit tutmak amacıyla, birkaç dakika süreyle buz üzerinde larvaları konulması tavsiye edilmektedir. Farklı bir bileşik için bu protokol adapte zaman bakım her oyuğa ilave stok çözeltisi miktarını belirlemek için önlem alınmalıdıriyi. Bu gibi durumlarda, bu direkt olarak öncesinde her bir mikro-larvaları ilave su içinde bileşik hesaplanan miktarının çözünmesi için daha iyi olabilir. Kan tahlilleri beslenme için, sivrisinek deney öncesi şeker suya en az 2 saat kaldırarak uygun hasret hayati önem taşıyor. Aksi takdirde eksik beslenme ve yetişkin dişi yumurta üretimine küçük etkiye neden olabilir. DZNep çözmek için bir kaç dakika sürer gibi iyice karıştırılması ve kandaki ilaç düzgün dağılımı, hem de önemli bir adımdır. İlaç tedavi edilen kan hemen beslenirse, DZNep eşit sivrisinek sisteminde ve almaz. Kuvvetle defibrile kan daha iyi sonuçlar için (ekstraksiyon tarihten itibaren bir haftadan az yani) taze olması tavsiye edilir. Ilgi konusu bir bileşiği ile, bir biyokimyasal deneyde başarısı için kritik öneme çok aşama bulunmaktadır. Bu proto kullanılan her stok solüsyonu konsantrasyonları<html> col DZNep için optimize edilmiştir. Farklı bir bileşik için protokol uyarlamak için, farklı pH bir dizi test öneririz, SAK, DTNB konsantrasyonları ve böcek örnek boyutları en güvenilir sonuçları belirlemek için. Ham enzim özütü hazırlanması, bu prosedürde en zaman alıcı bir aşamadır. Homojenat hazırlanması sırasında emme okuma engelleyebilir yüzer maddesinde mevcut olan lipidler gibi, en fazla 10 yetişkin sivrisinekler kullanılması tavsiye edilir. Bu sorunu önlemek için, (bir tek kanal mikropipet kullanarak) süpernatant lipidlerin üst tabaka adımı 3.8 sonra kaldırılabilir. Üst sıvı temiz bir mikrofüj tüpüne aktarılmıştır gerekir. Adım 3.8 kalan viskoz lipitleri atmak tekrar edilmelidir. kalan berrak yüzer tüm tüpler bir araya toplanmış ve yavaşça karıştırılmalıdır. Bir çok-kanallı bir pipet kuyularında SAK eklemek için yüksek verim için kullanılabilir. DTNB deneyinde bir göstergesi olarak kullanılmaktadır ve son hazırlanır ve buz üzerinde tutulmalıdır. nt &quot;&gt; Bu protokol sivrisinek farklı yaşam evrelerinde bir bileşiğin etkilerini test etmek basit adımda ile kullanıcıya sunar. Ancak, bu protokolün kullanımına bazı kısıtlamalar. Bu teknik DZNep suda çözünürlüğü öncelikle bağlıdır vardır. Olgunlaşmamış larvaları çevreleyen ortam içinde çözüldü ilaca maruz kalmaktadır. bileşiği Eğer test edilen sulu ortam içinde çözünür olan, bu protokol için daha az etkili olabilir. doğurganlığını test için, defibrile koyun kanı içinde çözülmüş ilacın yetişkin kadın tabi tutuldu. This bir laboratuar (yani, sivrisinek beslenmesi için fare veya kobay kullanır) doğrudan memeli kan sivrisinek koloniler rears eğer mümkün olmazdı. Bu makalede belirtilen farklı tahlillerin kombine böcekler üzerinde bir suda-çözünür bileşiğin etkisini test etmek için yeni bir yol sağlar. DZNep çok kanser araştırmaları için, in vitro olarak, hücre çizgileri ile ilave edilir; Bununla birlikte, bu protokol u sağlarser in vivo bir böceğin çeşitli yaşam evrelerinde herhangi etkilerini incelemek için. Buna ek olarak, aynı zamanda toksikolojik analizler için adım-adım kurallarına araştırmacı sağlar. Mevcut literatürde, bilgi böcekler üzerinde epigenetik ilaçların etkileri konusunda sınırlıdır. Örneğin, DZNep kullanarak, potansiyel böcek kontrol maddeleri gibi diğer epigenetik ilaçlar ya da yeni bileşikleri keşfetmek yönelik bir ön koşul adımı olarak kullanılabilir bir işlem sağlar. Bu protokol, sıtma sivrisinek için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu DZNep etkisi ya da başka bir sivrisinek ya da böcek türlerinde söz konusu herhangi bir suda çözünür bileşik, test etmek için adapte edilmiş olabilir.

Sıtma dünyada böcek bağlı ölümlerin en fazla sayıda sorumludur. Tahminen 219,000,000 olgu, öncelikle, Afrika 1 yaklaşık 660,000 ölüm ile sonuçlanan, dünya çapında yılda görülür. Uyumlu çabalara rağmen, sıtma programları çeşitli sorunlarla karşı karşıya. Insektisit tedavi cibinlik ve programın kapalı kalan püskürtme formu anahtar bileşenleri, yerel topluluklarında insektisit direnci bu çabaları 2 engel iken. insektisit dirençli sivrisinek popülasyonları hızlı artış büyük ölçüde kendi ortamında değişikliklere çabuk adapte ve farklı nişler 3,4,5 sömürmek için sıtma sivrisinek yeteneği atfedilir. Direnç mevcut mekanizmaların üstesinden gelmek için, yeni insektisit hedefleri ve gelecek nesil bileşiklerinin keşif garantilidir. Sıtma m değişik yaşam evrelerinde deneysel insektisitlerin etkinliğini belirlemek için basit bir adım adım protokolüosquitoes ölçüde bu çabalarını artırmak olacaktır. Hücre hatları ve hayvan modellerinde uyuşturucu etkileri Farmakolojik çalışmalar hücrelerin ve organizmaların genetik ve fizyoloji modüle için yararlı bir araç olarak epigenetik ilaçların kullanımını kurduk. DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu altta yatan bir DNA dizisini 6 değiştirmeden çok hücreli organizmalarda gen ifadesini etkileyen iki epigenetik mekanizmalar vardır. Böyle metilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, hücresel bütünlüğü ve gen ifadesini sürdürülmesinde önemli bir rol oynar ve birçok temel süreçleri 7,8,9 etkileyebilir. Bazı böcek türlerine Araştırma hücrelerinin oluşumu ile ilgili işlemlerde epigenetik önemi vurgulanmıştır ve hücre bakım 10, hem de dozaj telafisi 11 kök var. Ancak, hastalık vektörlerinde bu yaklaşım henüz keşfedilecek edilir. Sivrisinekler bu sistemi modüle bir bileşik Kullanımı bize verebiliryeni insektisit hedef yollar içine manzaraları. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), değişik kanser türlerinin üzerindeki etkisi 12,13,14,15,16 incelenmiştir bilinen bir histon metilasyon inhibitörüdür. DZNep dolaylı olarak histon lizin, N -methyltransferase önleyen bir kararlı, suda çözünebilen epigenetik ilaç (EZH2), memeli hücrelerinde Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) &#39;in bir bileşeni. PRC2 çok hücreli organizmalarda kök hücre büyümesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, ve histon metilasyon PRC2 aracılı gen susturma önemli bir yönüdür. Bağışıklık yetersizliği olan fareler içinde DZNep ile ön-muamele edilmiş hücreler, 17 daha az tümörijenik olduğu gösterilmiştir. Bu ilaç gibi EZH2 18 karıştığı olduğu alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi diğer hastalıklar, eğitim için kullanılan hale gelmektedir. DZNep kurulmuş bir S -adenosylhomocysteine ​​(SAK) hidrolaz inhibitörü 19, 20. in SAH hidrolaz sonuçlarının önlenmesiSAK birikimi ve buna bağlı olarak, temin edilebilen metil donör gruplar sınırlayarak metiltransferaz aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. SAK metabolik yollardaki böcekler dahil olmak üzere, pek çok organizmalar tarafından kullanılan bir amino asit türevidir. Yeni yapılan bir çalışmada diapause etkileyebilir ve böcekler 21 gelişimini geciktirebilir düşük dozlarda o DZNep göstermiştir. Burada, sivrisinek çeşitli yaşam sahnelerinde suda çözünür bileşik etkilerini araştırmak için sağlam bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokolün üç parça olgunlaşmamış sivrisinekler, yetişkin kan-besleme kadın ve yetişkin erkek ve dişi sivrisineklerin enzim aktivitesi üzerine bir suda çözünür bileşik etkilerini incelemek için talimatları içerir. İlk olarak, DZNep olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma çalışma için su içinde çözülmüştür. Bu ilaç maruziyeti 10 katlık bir artış ortaya çıkan herhangi bir karşılaştırma yapmak amacıyla iki konsantrasyonda yapılır. Yetişkin dişi sivrisinekler, DZNep ilacın etkisini araştırmak içindefibrile koyun kanı ilave ve dişilere yapay kan beslenir. Daha sonra, doğurganlık üzerindeki ilacın sonucu incelenmiştir. Son olarak, bir enzim etkinliği tahlili Yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak 5,5&#39;-ditiyobis- (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile gerçekleştirilir. Bu protokol, bir sıtma sivrisinek Anopheles gambiae ile geliştirilmiştir iken, kolayca sivrisinek ya da diğer böcek herhangi bir türün ilgi bileşiklerinin etkilerinin araştırılması için adapte edilebilir. Bu protokol detaylı teknikler etkili bir şekilde su ya da sulu ortam içinde, sınırlı ya da çözünürlüğe sahip bir ilaç için tatbik edilemez.

<table><tbody><tr><td>96-well microplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>A different centrifuge can be used</td></tr><tr><td>Colored tape rolls</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Egg dish cups</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter papers</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Glass feeders</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating element</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>A different incubator can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 2&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH meter&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>store at -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

İnsektisit direnç sıtma kontrol programları için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sivrisinekler sıtma tropikal ülkelerde bir yerde hazır ve nazır sorunu kontrol yapma, hızlı ortamındaki değişikliklere geniş bir uyum. insektisit dirençli popülasyonların ortaya çıkması vektör sivrisinek kontrolü için yeni ilaç hedef yolları ve bileşiklerin keşif garanti. Epigenetik ilaçlar iyi ancak çok böcekler üzerindeki etkileri hakkında bilinen değil, kanser araştırma kurulmuştur. Bu çalışma sıtma vektörü, Anopheles gambiae üzerine, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), kanser tedavisi için bir deneysel epigenetik ilacın toksikolojik etkilerini inceleyen için basit bir protokol sağlar. Bileşik tedavi kontrole göre yetişkin sivrisinekler doğurganlığını düşük ise mortalite ve boyut olarak azalma konsantrasyona bağlı bir artış DZNep maruz olgunlaşmamış sivrisinek gözlenmiştir. Buna ek olarak, S, bir ilaca bağlı bir azalma vardı -tedavileri kontrol etmek DZNep göreceli maruz kaldıktan sonra sivrisinek adenozilhomosisteine ​​(SAK) hidrolaz aktivitesi. Bu protokoller da, suda çözünür epigenetik ilaçların veya bileşiklerin toksikolojik etkileri keşfetmek için eşsiz bir çoklu-uçlu yaklaşımı göstermek, deneysel ilaç için birden fazla toksikolojik uç noktalar değerlendirmek için basit, adım-adım prosedürü ile araştırmacı sağlamak ve Vektör Sivrisinek ve diğer böceklere karşı ilgi.

Şekil 1, deneylerin bir şematik temsilidir; Bu makalede listelenen prosedürün çeşitli adımları açıklar. Protokol sivrisinek farklı yaşam evrelerinde dayalı olarak, burada ayrıntılı deneyler için takip edilecek belirli bir düzen vardır. Kullanıcı örnek durumuna bağlı olarak, aynı anda bir veya daha fazla deneyleri yapmak için seçebilirsiniz. Şekil 2 olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma deneyleri için ayarlanmış plaka gösterir. Test konsantrasyonları ve kopya sayısı, kullanıcının ihtiyaçları ve uyuşturucu durumuna bağlı olarak değişebilir. Olgunlaşmamış sivrisinek deneyi için, DZNep 1 mM stok çözelti, 0.5 uM ve bir ilaçsız popülasyonu içeren oyuklara sahip bir kontrol tava ile birlikte 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için sivrisinek içeren su ilave edildi. Deney göstermiştir ki daha larva ve pupa GözetimDZNep işlenmiş oyuklarda göre, kontrol oyuklarında Ived. Şekil 3 deney sırasında sıtma sivrisinek genel hayatta kalma üzerine DZNep etkisini göstermektedir. Sonuçlar epigenetik ilaç DZNep büyüme ve gelişmeyi bastırır ve olgunlaşmamış sivrisineklerin mortalite uyardığını ortaya koymuştur. 5 uM maruz kişiler, çok sayıda farklı olarak 8. günde ölmüştür ise 0.5 uM maruz sivrisinek çoğunluğu, deney 10. günde öldü, kontrol tedavisi (ilaç yok) olarak sivrisinekler ölüm kalmıştır etkilenmeyen ve çeşitli deney gününde 8 yetişkin olarak ortaya çıkmıştır. Bir ters ilişki ilaç konsantrasyonu ve sivrisinek vücut büyüklüğüne (Şekil 4) arasında gözlenmiştir. Şekil 5, sivrisinek doğurganlık üzerinde DZNep etkisini göstermektedir. Kan DZNep içeren beslenen yetişkin dişi sivrisinekler önemli bir reductio sergiledin canlı yumurta sayısında. Şekil 5A kontrol kafes (ilaç yok) elde edilen yumurta gösterir. Şekil 5B testi kafesinden elde edilen yumurta gösterir. Test kafesine elde edilen yumurtaların büyük bir kısmı koyu renkli ve normal kan beslenen dişi sivrisinekler (Şekil 6) elde edilen yumurtaların karşılaştırıldığında yüzer parçalar (exochorion hava dolu açılımları) yoktu. koyu renkli yumurta ile birlikte yüzen olmaması exochorion oluşumunda epigenetik potansiyel rolünü gösterir. Şekil 7 yetişkin erkek ve dişi sivrisinekler sıtma SAK hidrolaz aktivitesi üzerine DZNep etkisini göstermektedir. OD bir DZNep bağımlı azalma DZNep SAH hidrolaz aktivitesi inhibe ettiğini gösteren kontrol muamelesi (ilaç yok) ile karşılaştırıldığında her bir ilaç tedavisi için görülmektedir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig1highres.jpg" wiDTH = &quot;700px&quot; /&gt; Şekil 1:. Sıtma sivrisinekler üzerinde bir epigenetik ilaç kullanan tahlillerin şematik gösterimi düzeninin sol kısmı olgunlaşmamış sivrisinek kullanarak geliştirme ve hayatta kalma deneyleri gösterir. orta kısmı yetişkin kadın için ilaç, kan-besleme yoluyla doğurganlık deneyi göstermektedir. sağ kısmı ilaç ile enzim inhibisyonu biyokimyasal deneyi göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Levha olgunlaşmamış sivrisinek geliştirme ve hayatta kalma tahlil tasvir &quot;C&quot; işaretleri kontrol kuyuları Etiket.. Etiket &quot;0,5&quot; 0,5 uM DZNep ile kuyu gösterir. Etiket &quot;5&quot;, 5 uM DZNep ile kuyu gösterir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig3highres.jpg" /> Şekil 3: </stRong&gt; sıtma sivrisinek hayatta kalma ile ilgili DZNep etkisi. konsantrasyon-bağımlı bir ölüm olgunlaşmamış sivrisinek ile görülmektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig4highres.jpg" /> . Şekil 4.:. 0.5 uM DZNep (boyut = 4 mm) (C), larva ile muamele olgunlaşmamış sivrisinekler üzerinde DZNep Etkisi (A) Kontrol tedavisi (boyut = 5 mm) larva (B), larva 5 ile işlemden geçirildi mcM DZNep (boyut = 3 mm). Bütün larvalar deney aynı gün ölçüldü. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig5highres.jpg" /> Şekil 5:. Kontrol muamelesi sivrisinek doğurganlık Yumurta tabağına DZNep Etkisi (ilaç yok) sivrisinek yumurta çok daha büyük bir sayı içerir, (A) iştigal5 mcM DZNep (B) ile tedavi kadın yumurta yemek ile kırmızı. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig6highres.jpg" /> Şekil 6: Bir mikroskop altında görülen sıtma sivrisinekler yumurta yapısına DZNep Etkisi. Kontrol tedavisi (A) Yumurta (ilaç yok) sivrisinek yüzen ve rozet gibi meclisleri. (B) Yumurta yüzen ve rozet benzeri derlemeler eksikliği DZNep 5 uM ile tedavi sivrisineklerden gösterilecek. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52041/52041fig7highres.jpg" /> Şekil 7:. Sıtma sivrisinek DZNep tarafından SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep kontrol muamelesi (ilaç yok) ile karşılaştırıldığında, OD bir azalmaya neden olur.

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Sıtma Sivrisinekler Gelişimi, doğurganlık ve Kalma bir Epigenetik İlaç Test Etkileri Toksikolojik Tahliller

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Görüntüleme.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Genetik

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Sivrisinek Spermatogenezini İncelemek için Floresan In Situ Hibridizasyon

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

Yazar Spotlight: Anofel Sivrisineğinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Biyoloji

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Sıtma Sivrisinekler Gelişimi, doğurganlık ve Kalma bir Epigenetik İlaç Test Etkileri Toksikolojik Tahliller

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili