This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1. Giriş <ol><li> Biyoreaktör kadar güç. Giriş sayfasını açmak için herhangi bir yere tıklayın. Kullanıcı adı seçin ve parolanızı girin ve &quot;Giriş&quot; e tıklayınız. </li></ol> 2. Kalibrasyon <ol><li> PH sensörü (önceki otoklav 2 puan) kalibre. </li><li> PH sensörü kontrol edin ve sensör ucu elektrolit solüsyonu ile doldurulur onaylayın. PH kalibrasyon çözeltiler (elektrolit), pH 4 ve pH 7 ile beher iki hazırlayın ve damıtılmış su ile uygun bir yıkama şişe. </li><li> PH sensörü, pH kablosunu bağlayın. Merhaba arayüzünde &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;kalibre&quot; tıklayın. Kalibrasyon Çözüm Temp alanına tampon sıcaklığını girin. </li><li> Tamponu 1 (pH 4) pH sensörü yerleştirin ve &quot;sıfır&quot; alanına değer girin. Stabilize grafiği bekleyin ve &quot;kalibre 1&quot; butonuna tıklayın. Damıtılmış su ile pH sensörü durulayın. </li><li> Tampon içinde yer sensör 2 (pH 7). Tampon girin&quot;Yayılma&quot; alanında 2 değer. Stabilize ve 2 düğmesine kalibre tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> &quot;Kaydet&quot; sonra &quot;Kapat&quot; tıklatın. </li><li> Çözünmüş Oksijen (DO) sensörünü kalibre. </li><li> DO sensörü sağlamak birkaç saat sistemine bağlı olması ile polarize edilmiştir. Merhaba arayüzünde &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve kalibre tıklayın. &quot;Bir DO&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> DO sensörünü ayırın ve &quot;sıfır&quot; alanına 0 girin. Stabilize ve &quot;Kalibre 1&quot; butonuna tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> DO sensörünü takın ve &quot;yayılma&quot; alanına 100 girin. Stabilize ve &quot;Kalibre 2&quot; butonuna tıklayın grafiği bekleyin. </li><li> &quot;Kaydet&quot; sonra &quot;close&quot; tıklatın. </li></ol> 3. Otoklav ve Install Sensörler ve Reaktif Gemiler <ol><li> AutoC kalibrasyon, yer sensörleri ve termal kuyuda sonrayıkamak poşetler ve 121 ° C, 15 psi&#39;de 30 dakika süreyle otoklav. </li><li> % 70 izopropil Alkol (IPA) ve biyolojik güvenlik kabini transfer torbalar (BSC) ile otoklav torbalar sanitize. Geminin dış ambalajı çıkarın. </li><li> % 70 IPA ile iç ambalajların dezenfekte ve biyolojik güvenlik kabini (BSC) ile gemi aktarın. İç ambalajını çıkarın ve nakliye sırasında hasara için gemi ve boru inceleyin. </li><li> PH takın ve iki ön limanlarında sensörleri DO. Sol arka kapısına termal kuyu yükleyin. Sensör kapağını açın. </li><li> Sensör bağlantı noktası üzerinden sensörü Kılavuzu. Portuna sıkıca sensörünü geçirin. </li><li> BSC üzerinden gemi aktarın. </li><li> Damar kovan dışında DO ve pH sensörü kablolarını asın ve hiçbir şey kovanı olduğunu kontrol edin. Ilk olarak, kovan içine ayak kabı kaydırın. </li><li> Dikkatlice Kabın termal kuyuya sıcaklık sensörü uygun. Teknenin tabanına dayanacak ısıtıcılar emin olun. </li><li> Kaldırboru kendi çanta ayarlar. Biyoreaktör kontrol ünitesindeki ilgili konnektörleri ve pompalara boru üzerine Maç renk kodlaması. </li><li> Doğalgaz prize konektörü basarak ana gaz hattını takın. Gaz prize konektörü saat yönünde bükerek mikro gaz hattını takın. Egzoz filtre boru yükleyin: </li><li> Filtre Fırını açın. Onun boru filtre ve fırın dışında iki kanca geçer böylece U-kanal egzoz filtresini sabitleyin. </li><li> Boru tutucu kondansatör torba ile boruyu takın. Kapıyı kapatın. </li><li> Sonraki biyoreaktör kontrol ünitesine Yol ekleme hatları A ve B, hem medya hem de çizgiler ve DO sensörü arkasında tezgah üzerine hasat hattı. </li><li> DO ve pH sensörlere kablolarını bağlayın. </li></ol> 4. Ekleme Orta ve Mikro-taşıyıcılar <ol><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve tıklayın bilgisayar arayüzü &quot;Denetim Pompalar&quot;. </li><li> Bir Steri FormKullanılmayan bir orta ilave hat (1 portakal bant) ve tüp kaynak veya luer bağlantı parçaları kullanılarak orta şişe / çanta kaynağı arasındaki le bağlantısı. </li><li> Ortam pompa açmak için kaydırıcıyı tıklayın. Medya ortamının eklenmesi istenilen miktarda sonra pompa kapalı kapatmak için kaydırıcıyı tıklayın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 saat boyunca, Ca2 +, Mg + 2 serbest PBS mikrotaşıyıcı boncuklar yerleştirin. </li><li> Yıkama Ca 2 +, Mg 2 + ücretsiz PBS ile birkaç kez boncuk. </li><li> 115 ° C, 15 psi&#39;de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. NOT: Bu deneyde 3 g / L, (kuru ağırlık) ekleyin. </li><li> , Sulu yıkandı ve ortam, aşama 4.1 &#39;de ilave edildi aynı şekilde reaktöre otoklave edilmiş mikro-taşıyıcılar pompalama. </li></ol> 5. Dengeleme ve Tek-nokta kalibrasyon DO <ol><li> Otomatik kontrolörleri ayarlayın ve istenilen ayar noktalarını girin. Burada, Ajitasyon Set Point (SP) = 15 rpm, sıcaklık SP = kullanmak 37.0 ° C, pH = 7.2, =% 100 DO. P bekleyinarameters dengelenmesi için akmaktadır. </li><li> Sensörünü onaylamak tamamen polarize olduğunu. DO bugünkü değeri onaylayın stabilize. </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;kalibre&quot; tıklayın. &quot;Tek nokta&quot; tıklayın, &quot;DO A&quot; tıklayın. </li><li> &quot;Açıklık&quot; alanına &#39;100&#39; girin. , Tıklayın &quot;Save&quot; ve &quot;Kapat&quot; düğmesini tıklatın &quot;Kalibre 1&quot; düğmesine tıklayın: </li></ol> 6. Çalıştır Başlangıç <ol><li> Eylemler sekmesine gidin. &quot;Toplu&quot; ı tıklayın. Toplu adı 16 karakter veya daha az girmek için ekran klavyesini veya harici bir klavye kullanın. </li><li> Ekrandaki klavyenizin &quot;Hide&quot; butonuna tıklayın. &quot;Toplu Başlat&quot; overlay &quot;Başlat&quot; tıklayarak onaylayın tıklayın. </li></ol> 7. Hücreleri ile inoküle <ol><li> Kaynak tarafından kullanılmayan bir ortam ilavesi hattı (1 turuncu bant dışı) arasında steril bir birleşme ve hücre şişe / torba kaynak FormLuer parçaları kullanarak boru veya. </li><li> Pompa ve tank arasındaki borular doğru ok noktalarına kadar ortam pompa hortumunun silikon bölüm takın. </li><li> Boru kelepçesi edin açıktır ve dallı boru kelepçesi kapalıdır. Ortam pompa açmak ve hücreleri ekledikten sonra &quot;Off&quot; tıklayın kaydırıcısını tıklayın. </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;Denetim Pompalar&quot; tıklatın. </li></ol> 8. Örnekleme <ol><li> Sık kültürü izlemek için arzu edildiği gibi inoküle edilmesi ve sonra, aşağıdaki şekilde, bu kültürden örneği almak: </li><li> &quot;Eylemler&quot; sekmesine gidin ve &quot;örnek almak&quot; tıklayın. Örnekleme pompaya örnekleme boru yerleştirin ve ekrandaki talimatlara göre örnekleme stopcock manipüle. </li><li> Bu örnekler en az bir gün mikroskopik gözlem ve hücre sayımı gerçekleştirin. </li><li> Hücreleri bu c istenilen yoğunluğa ulaştığında,1.2 x 10 6 hücre / ml &#39;ase bir virüs aşı ilavesi ile hücreleri enfekte etmektedir. </li><li> Aseptik 20 ml&#39;lik bir şırınga inokulum ekleyin ve reaktörün boş bir ek bağlantı noktalarından birine şırınga bağlayın. Şırınga pistonu basarak reaktöre inokulum tanıtılması. </li><li> Örnekleme Devam ve adenovirüs hücre içi partikül konsantrasyonu için kültürünü analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

Yazarlar D. Giroux ve Y. Hashimura Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten PBS Biotech çalışanlarıdır.

Bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin kullanımı nispeten basittir ve reaktör izleme ve analiz için gerçek zamanlı bir analiz içerir. Bu, son derece iyi 30000000 fazla hücre / ml hücre yoğunluğu ile ulaşan memeli ve böcek hücre kültürü için uygundur. A549 hücreleri, bu raporda 11&#39;de tarif yanı sıra, hem de biyoreaktör SF-9 böcek hücreleri büyüdü. Pnömatik hava tekerleği tarafından sağlanan nazik karıştırma hücre hasarı azaltır. Bu reaktör kurarken birkaç adım önemlidir. İlk olarak, uygun bir pH kalibrasyonu ve sensörler kültür uygun izlenmesi için ve pH-değerini ya da sistemde oksijen ayarlamak için reaktifler ilave önemlidir DO. İkinci olarak, reaktif ve tohum şişe doldurulmuş ve diş ek bir BSC gibi, steril bir ortamda yapılmalıdır. Reaktif şişeleri steril ortamda dışına taşındı sonra, biyoreaktör besleme hatlarına bağlantıları mikrobik kontaminasyonu önlemek için dikkatle yapılmalıdır. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu biyoreaktör sistemi bakteri kültürleri için tasarlanmış değildir memeli ve böcek hücre hatları için iyi çalışıyor. Sistem, bakteri hücreleri için gerekli olan, hızlı karıştırma ve oksijen sağlayamaz. Bakteriyel çoğalma iyi bir karıştıran bioreaktör içinde gerçekleştirilir. Memeli ya da böcek hücre kültürü için diğer tek kullanımlık biyoreaktörlerde karşılaştırıldığında, bu sistem, kullanımı kolay çalışır analiz için yeterli veri sağlar ve biz değerlendirdik diğer tek kullanımlık sisteminden daha benzer veya daha iyi hücre büyümesini vardır. Tek kullanım için pnömatik biyoreaktör sistemi hücreleri, araştırma ve Biotherapeutics, aşıların alanda klinik uygulamaların bir çoğu yerine kök potansiyel ve kişiselleştirilmiş ilaç 4 sahiptir. Buna ek olarak, bu sistemin esnekliği Batch, ilaveli-fasılalı, serpme, ve transfeksiyonu göre biyoreaktör uygulamalar 5 sağlar. Son olarak, tek kullanımlık biyoreaktör sistemi potansiyeli taşıdığıbüyük ölçekli sanayi üretim ihtiyaçlarını karşılamak için kurallar ve ulusal ve uluslararası düzenleyici kurumlar 6-10 tavsiyelerine uymak için TIAL.

Süspansiyon içinde büyümeye hücreleri, agregat Çoğalan hücreler, ve hücreler, bir alt-tabakaya sabitlenmiş yükselmektedir memeli hücre soyları büyüme özelliklerine göre üç kategoriye ayrılabilir. Bu video gösterilen hava tekerlekli biyoreaktör hücrelerin her üç tip büyümeye mümkün olsa da, bu video mikro-taşıyıcılar üzerinde ankoraj-bağımlı hücreleri büyütmek için bioreaktörün kullanımını gösterecektir. , Hücreler ürünü - ankoraj-bağımlı hücreleri daha memeli hücreleri üretmek amacıyla yetiştirilebilir. Örneğin, insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök ile henüz hücrelerin hasat edilmesi ve hastalıklı doku içine enjekte edilmesi ile yetiştirilmektedir. Bu video gösterilen pnömatik biyoreaktör bu uygulama için bu tür mezenkimal kök hücrelerin üretilmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır (Serra et al., Kişisel iletişim, 2013). Anchorage dependent memeli hücreleri, tipik olarak, özel bir muamele edilmiş büyüme yüzeyi 1 &#39;e uygun hücre kültür plakaları, hücre kültürü şişeleri veya silindir şişelerde, 2B kültür kabına küçük çaplı büyütülür. Daha fazla hücre arzu edildiği zaman, ya da plakalar, şişeler daha fazla ya da daha büyük damarların kullanılarak genişletilebilir. Bununla birlikte, daha düşük maliyetli bir ankoraj-bağımlı hücrelerin büyük miktarlarda kültivasyonu, hücre bağlanması için yüzey alanını artırmak için gerekli mikro-taşıyıcılar olarak adlandırılan küçük bir katı boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücrenin bağlanma özelliklerine bağlı olarak, mikro-taşıyıcılar birden fazla değişik tipte örneğin kaplanmış dekstran, peptid, ya da kolajen gibi, ticari olarak temin edilebilir. Mikro taşıyıcılar, hücre büyümesi için daha geniş bir yüzey alanı hacim oranı sağlamak için geniş bir yüzey alanına sahiptir; ve mikro taşıyıcılar, hücreler biyoreaktör de 2 yüksek yoğunluklarda kültive edilmesini sağlar çalkalama ile süspansiyon içinde muhafaza edilebilir. Biorea Şu anda, türleriyapışık hücreler mikro-taşıyıcılar üzerinde yetiştirilen ctors hücre kaplı mikro-taşıyıcı süspansiyonu sağlamak için eksenel pervaneler kullanır döndürme şişeleri ve karıştırılmıştır tankı sistemleri içerir. Çeşitli faktörler, oksijen gerilimi, kesme stresi, yüzey matris ve bir gıda maddesi ve metabolit konsantrasyonları dahil olmak üzere, hücrelerin başarılı bir şekilde ekimi için önemlidir. Biyoreaktörler kullanılması, gerçek zamanlı büyüme koşullarının izlenmesi ve önemli ölçüde daha düşük üretim maliyetleri 1&#39;e potansiyeli sağlar. Dahil olmak üzere, in vitro hücre ekimi, karıştırılmış bir süspansiyona, dönen duvar kap, içi boş elyaf, bir rocker platformunda torba biyoreaktör ve akışkan yataklı sistemler 3 birçok ortak biyo-reaktör tasarımları vardır. Bu sistemlerin birçoğu gibi yüksek maliyet besin konsantrasyonu geçişlerini, hidrodinamik kesme, hücre toplama ve zorluk örnekleme, izleme ve kontrol cel gibi, hücre ekimi için benzersiz sorunları sunmak ve -up ölçekl ölçek-up. Çeşitli yapışık hücre çizgileri, viral aşıların üretimi veya gen terapi uygulamaları için viral vektörlerin üretimi için ya da, virüs üretiminde kullanılmaktadır. Bu video, tek kullanımlık hava basınçlı (Hava Tekerlek) biyoreaktör sistemi kullanılarak, insan akciğer kanser hücreleri (A549) bir onkolitik adenovirüsün üretimi için mikro-taşıyıcılar üzerinde hücre kültürünü göstermektedir. Pnömatik biyoreaktör tasarımı bioreaktörün dibine serpilmiştir gaz kaldırma kuvveti tarafından desteklenmektedir dikey bir çalkalama tekerlek kullanır. Bu nazik Karıştırma yöntemi hidrodinamik kesme kuvvetleri sınırlar, ama yine de iyi, orta ve hücre 4 karıştırma sağlar. Karıştırılmakta olan tank reaktörden ile karşılaştırıldığında, pnömatik reaktör daha yüksek hacimli hava Teker biyoreaktör sistemleri (Şekil 1) olarak düşük duvar kesme stresine sahip bulunmaktadır. Karıştıran tank biçimindeki bioreaktörlerde aksine, bu tek kullanımlık reaktörün dikey itici gaz kabarcıklarının akışı içinde tarafından açıldığındaYumuşak ve düzgün karıştırma ortamı (Şekil 2) sağlayan kabından oluşur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Şekil 3&#39;te, biyoreaktör çalıştırmak başlatılması için parametreler gösterilir. Bu rakam sıcaklık, çözünmüş oksijen, pH ve ajitasyon parametreleri ayarlayarak önce ekranını gösterir. Parametreleri ayarlandıktan sonra, çalışma parametreleri sürekli olarak takip edilmekte ve ayarlamalar gerekli koşulları korumak için yapılabilir. Yazılım sorunları kolay tanımlanması için izin veren bir sürekli okuma üretir. DMEM,% 10 FBS, SAFC anti-köpük C, 250 ppm, 2 mM L-glutamin ve 3 g / mikro-taşıyıcı L ihtiva eden 2.5 ml kullanarak bu deneyde, sistem o kadar oksijen yüzdesi% 50, bir stabilize sıcaklık 37 ° C ve pH 7.2. Reaktör 10 x 7 4 hücre / ml (ve / veya mikro-taşıyıcı 10 hücre) bir konsantrasyonda A549 hücreleri ile aşılanır. Bu çalışma için seçilen parametreler, 2 saat (Şekil 4) bulunan mikro-taşıyıcılar yapışan hücrelerin çoğunluğunda sonuçlandı. 12 saat sonra, hücreler şeytan(Şekil 5) ve düzleşme mikro taşıyıcı yüzeye yayılması ve süzücü işaretler. 24 saatin sonunda, mikro-taşıyıcıların (Şekil 6) hücreleri olmadan mikro taşıyıcı ve mikro-taşıyıcılar üzerinde hücrelerin herhangi bir iri kümeleri ile hücrelerin nispeten daha dağılımı vardır. A549 hücrelerinin mikro-taşıyıcı kolonizasyon yüzdesi, 24 saat ve daha sonra% 90 (Şekil 7) ile% 75 olduğu. Hücreler, 48 saat (Şekil 8) sonra ~ 1000000 hücre / ml olacak şekilde katlanarak büyümeye devam etti. 50 saat sonra, onkolitik adenovirüs ile (2 x 10 8 virionlar / ml) bir dozu ile enfeksiyondan sonra, yoğunluk mi 1.200.000 hücre / yükseldi ve daha sonra litik enfeksiyon ilerledikçe düşmeye başladı. Viral inokülüm ~ 10.000 kat büyütme oldu. Önceki deneylerde, gaz akışı izleme ve uyarlama hücre büyümesi (yayınlanmamış veriler) üst düzeye çıkarmak için önemli olduğunu bulduk. Hızla büyüyen hücreleri oksijen sistemi ile tüketebilir<html> sıfıra bırakarak DO seviyesi. Hücreler büyümeye devam ederken, çok daha yavaş bir oranda olmuştur. Izlemek ve logaritmik büyüme fazı sırasında hücre taleplerini karşılamak için oksijen akışını ayarlamak için kritik öneme sahiptir. Her çalışma, günlük hücre sayısı ile pH, DO ve sıcaklık karşılaştırarak optimum büyüme için analiz edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Reaktör çeşitli hacimlerde duvar kayma kuvvetlerini ölçen bir karıştırıcı bioreaktör kıyasla Pnömatik Biyoreaktör Sistemi (PBS) Şekil 1. Akışkan dinamiği. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Pnömatik-Tekerlek reaktör çark. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Biyoreaktör Çalışmayı başlatmak için parametrelerin 3. Pnömatik Tekerlek yazılım ekran görüntüsü Şekil. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> A549 hücreleri 2 saat Aşıdan ile Şekil 4. Mikro-taşıyıcı kolonizasyon. (Ortalama mikro-taşıyıcı çapı ~ 180 mikron.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Şekil 5. 12 saat kültürünün başlatılmasından sonra, A549 hücreleri, bağlama düzleştirme ve mikro-taşıyıcılar üzerine yayılmaktadır.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Kültüründe 24 saat sonra hücreler ile kaplanmış Şekil 6. Mikro-taşıyıcılar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> A549 hücreleri tarafından mikro-taşıyıcı kolonizasyon Şekil 7. yüzdesi aşılamadan. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Şekil 8. adenovir ile kültür öncesi canlı A549 hücrelerinin sayısı ve Enfeksiyondanbize. viral enfeksiyon adım 50 saatte meydana unutmayın.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System at JoVE.com

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

Video: Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Biyomühendislik

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Bir Benchtop Biyoreaktör Operasyonu

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Çeşitli mikrobiyal Toplulukları Yüksek Yoğunluklu Yetiştirme için Yeni Bir Biyoreaktör

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

CRISPR Plazmidlerinin Yapımı ve Çift Luciferase Muhabir Sistemi Ile Memeli Hücrelerinde Nakavt Etkinliğinin Saptanması

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...