This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1. Login <ol><li> Schalten Sie den Bioreaktor. Klicken Sie irgendwo auf die Login-Seite zu öffnen. Wählen Sie Benutzernamen und Passwort eingeben und auf &quot;Login&quot;. </li></ol> 2. Kalibrierung <ol><li> Kalibrieren pH-Sensor (2-Punkt vor dem Autoklavieren). </li><li> Untersuchen pH-Sensor und bestätigen Sensorspitze mit Elektrolytlösung gefüllt. Bereiten Sie zwei Becher mit pH-Eichlösungen (Elektrolyt) pH 4 und pH 7 und verfügen eine Waschflasche mit destilliertem Wasser. </li><li> Verbinden Sie das Kabel mit dem pH-Wert pH-Sensor. Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; auf der Schnittstelle Hallo und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot;. Geben Sie Puffertemperatur im Temp-Feld Kalibrierungslösung. </li><li> Zeigen pH-Sensor in Puffer 1 (pH 4) und geben Sie in das Feld Wert &quot;Null&quot;. Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die auf den Button &quot;kalibrieren 1&quot;. Spülen Sie den pH-Sensor mit destilliertem Wasser. </li><li> Sensor in Puffer 2 (pH 7). Geben Sie Puffer2-Wert im Feld &quot;span&quot;. Warten Sie, Graphen zu stabilisieren und klicken Sie auf Kalibrieren 2-Taste. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot; klicken Sie dann auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Kalibrieren Sie den gelösten Sauerstoff (DO)-Sensor. </li><li> Sicherstellen, dass die DO-Sensor hat, indem er auf das System für mehrere Stunden verbunden polarisiert worden. Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; auf der Schnittstelle Hallo, und klicken Sie kalibrieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;DO A&quot;. </li><li> Trennen Sie die DO-Sensor und geben Sie 0 in das Feld &quot;Null&quot;. Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die klicken Sie auf &quot;Kalibrieren 1&quot;-Taste. </li><li> Schließen Sie den Sauerstoffsensor und geben Sie 100 in das Feld &quot;Span&quot;. Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die klicken Sie auf &quot;Kalibrieren 2&quot;-Taste. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot; klicken Sie dann auf &quot;Schließen&quot;. </li></ol> 3. Autoklav und installieren Sensoren und Reagenzienbehälter <ol><li> Nach der Kalibrierung Ort Sensoren und Thermalbrunnen in autoLlave Beutel und Autoklaven für 30 min bei 121 ° C, 15 psi. </li><li> Desinfizieren Autoklaven Beutel mit 70% Isopropylalkohol (IPA) und Transfer Beutel zu biologischen Sicherheitsschrank (BSC). Entfernen Sie die äußeren Umhüllungen von Gefäß. </li><li> Desinfizieren Innenverpackung mit 70% IPA und Transportbehälter für die biologische Sicherheitswerkbank (BSC). Entfernen Innenverpackung und das Schiff zu inspizieren und Schläuche für Schäden während des Transports Schaden ein. </li><li> Installieren Sie den pH-Wert und Sauerstoffsensoren in den beiden vorderen Ports. Installieren Sie den Thermalbrunnen auf der linken hinteren Port. Öffnen Sie die Sensorkappe. </li><li> Führen Sie den Sensor durch den Sensor-Port. Fädeln Sie den Sensor fest in den Anschluss. </li><li> Transportbehälter von BSC. </li><li> Hängen Sie die DO und pH-Sensor-Kabel außerhalb des Gefäßes Hülse und überprüfen, dass nichts in der Hülse. Schieben Sie den Behälter in der Hülse, mit den Füßen zuerst. </li><li> Sorgfältig passen die Temperaturfühler in den Behälter Thermalbrunnen. Sicherzustellen, dass der Boden des Behälters liegt, an den Heizungen. </li><li> Entfernender Schlauch setzt aus ihren Taschen. Spiel Farbcodierung auf den Schlauch an die entsprechenden Anschlüsse und Pumpen auf dem Bioreaktor-Steuereinheit. </li><li> Installieren Sie die Hauptgasleitung durch Drücken der Stecker in die Gassteckdose. Installieren Sie die Mikrogasleitung durch Verdrehen der Stecker im Uhrzeigersinn in die Gassteckdose. Installieren Sie den Abluftfilter Schlauch: </li><li> Öffnen Sie die Filter Ofen. Sichere den Abluftfilter auf dem U-Kanal, so das Schlauch geht durch die beiden Haken an den Filter und aus dem Ofen. </li><li> Installieren Sie den Schlauch durch Kondensator Tasche in der Schlauchaufnahme. Schließen Sie die Tür. </li><li> Route zusätzlich Linien A und B, beide Medienleitungen, und die Ernte Linie hinter dem DO-Sensor und auf der Bank neben dem Bioreaktor-Steuereinheit. </li><li> Schließen Sie die Kabel an die DO und pH-Sensoren. </li></ol> 4. Zugabe von Medium und Micro-Träger <ol><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Systemsteuerung Pumpen&quot; auf der Computer-Schnittstelle. </li><li> Bilden eine Sterile Verbindung zwischen einem unbenutzten Medium zusätzlich Linie (1 Orange-Band) und dem Medium Flasche / Beutel Quelle durch Schweißen der Rohrleitungen oder Armaturen mit Luer. </li><li> Klicken Sie auf den Schieberegler, um auf der Medienpumpe einzuschalten. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medien wenden Pumpe aus nach Zugabe gewünschte Menge des Mediums. </li><li> Platzieren Mikrokügelchen in Ca 2 +, Mg 2 + freiem PBS für 3 h bei RT. </li><li> Waschperlen mehrmals mit Ca 2 +, Mg 2 + freiem PBS. </li><li> Autoklav für 15 Minuten bei 115 ° C, 15 psi. HINWEIS: In 3 g / l (Trockengewicht) in diesem Experiment. </li><li> Pumpe in Mikroträgern, die hydratisiert, gewaschen und in den Reaktor in der gleichen Weise wurde das Medium im Schritt 4.1 zugegeben wurden autoklaviert. </li></ol> 5. Die Gleichgewichtseinstellung und Ein-Punkt-Kalibrierung DO <ol><li> Stellen Sie die Regler auf Auto und geben Sie die gewünschten Sollwerte. Hier verwenden Agitation Set Point (SP) = 15 min, Temperatur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Warten Sie auf die parameter ins Gleichgewicht. </li><li> Sensor bestätigen ist vollständig polarisiert. Bestätigen DO Barwert hat sich stabilisiert. </li><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot;. Klicken Sie auf &quot;DO A&quot;, klicken Sie auf &quot;One Point&quot;. </li><li> Geben Sie &quot;100&quot; in das Feld &quot;Span&quot;. Klicken Sie auf &quot;Kalibrieren 1&quot;, klicken auf &quot;Speichern&quot; und klicken Sie auf &quot;Schließen&quot;: </li></ol> 6. Starten eines Run <ol><li> Navigieren Sie zur Registerkarte Aktionen. Klicken Sie auf &quot;Batch&quot;. Verwenden des On-Screen-Tastatur oder eine externe Tastatur an eine Batch-Namen eingeben 16 Zeichen oder weniger. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Tastatur auf dem Bildschirm &quot;Hide&quot;. Klicken Sie auf &quot;Start Batch&quot; bestätigen Sie mit &quot;Start&quot; in der Überlagerung. </li></ol> 7. Impfen mit Zellen <ol><li> Bilden eine sterile Verbindung zwischen einem unbenutzten Medium zusätzlich Linie (1 Orange Band) und die Zelle Flasche / Beutel Quelle durch Schweißender Schlauch oder mit Hilfe der Luer Armaturen. </li><li> Installieren der Silikonabschnitt des Schlauchs in der Medienpumpe, so dass der Pfeil in Richtung der Rohrleitung zwischen der Pumpe und dem Behälter. </li><li> Überprüfen Schlauchklemme ist offen und seine verzweigte Schlauchklemme geschlossen ist. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medienpumpe einzuschalten, und klicken Sie auf &quot;Aus&quot; nach der Zugabe von Zellen. </li><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Systemsteuerung Pumpen&quot;. </li></ol> 8. Probenahme <ol><li> Nach Impfen und so oft wie gewünscht, um die Kultur zu überwachen, zeichnen Sie eine Probe aus der Kultur, in der folgenden Weise: </li><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Probe nehmen&quot;. Legen Sie die Sampling-Schlauch in der Probenahmepumpe und nach den Anweisungen auf dem Bildschirm manipulieren die Sampling-Hahn. </li><li> Führen Sie mindestens eine tägliche mikroskopische Beobachtung und Zellzahl an diesen Proben. </li><li> Wenn die Zellen die gewünschte Dichte in diesem C erreichtase 1,2 x 10 6 Zellen / ml, infizieren die Zellen durch die Zugabe eines Virus-Inokulum. </li><li> Aseptisch das Inokulum in den 20-ml-Spritze, und verbinden Sie die Spritze mit einem der Ersatz zusätzlich Ports auf den Reaktor. Einführung des Inokulums in den Reaktor durch Druck auf den Spritzenkolben. </li><li> Weiter Probenahme und der Analyse der Kultur für die Adenovirus intrazellulären Partikelkonzentration. </li></ol>

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	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

Autoren D. Giroux und Y. Hashimura sind Mitarbeiter von PBS Biotech, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet wird, erzeugt.

Diese Einweg-Bioreaktor-System ist relativ einfach zu bedienen und bietet Echtzeit-Analysen für Reaktor Überwachung und Analyse. Es ist sehr gut für Säugetier und Insektenzellkultur mit Zelldichten erreicht über 30 Millionen Zellen / ml geeignet. Außer in diesem Bericht beschriebenen 11 A549-Zellen, haben wir SF-9 Insektenzellen im Bioreaktor als auch gewachsen. Die schonende Durchmischung durch den pneumatischen Luft Rad vorgesehen reduziert Zellschäden. Mehrere Schritte sind entscheidend bei der Einrichtung dieses Reaktors. Zuerst richtige Kalibrierung des pH und Sauerstoffsensoren ist für eine optimale Kontrolle der Kultur und für die Zugabe von Reagenzien, um den pH oder die Sauerstoff in dem System anzupassen. Zweitens muss das Reagenz und Saatgut Flaschen gefüllt werden, und die Luer-Anhänge in einer sterilen Umgebung, wie einem BSC. Sobald die Reagenzien sind aus der sterilen Umgebung bewegt wird, müssen die Anschlüsse an den Bioreaktor Zuleitungen mit Sorgfalt vorgenommen werden, um mikrobielle Kontamination zu vermeiden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Während dieses Bioreaktorsystem funktioniert gut für Säuger und Insektenzelllinien ist es nicht für Bakterienkulturen entwickelt. Das System kann nicht die schnelle Vermischung und Sauerstoffversorgung, die für die Bakterienzellen erforderlich ist. Bakterielle Wachstum wird am besten in einem Rührkessel-Bioreaktor durchgeführt. Im Vergleich zu anderen Einzel Bioreaktoren für Säugetier oder Insektenzellkultur ist dieses System einfach zu bedienen, bietet ausreichend Daten für die Analyse von Läufen, und hat ähnliche oder bessere Zellwachstum als die anderen Einzelnutzung System das wir geprüft haben. Der Einweg-Bioreaktorsystem pneumatische hat das Potenzial, viele der Forschung und klinische Anwendungen in den Bereichen von Biotherapeutika, Impfstoffe zu treffen, Stammzellen, und personalisierte Medizin 4. Darüber hinaus ist die Flexibilität dieses Systems ermöglicht Batch, Fed-Batch-, Perfusions-und Transfektion bezogen Bioreaktor Anwendungen 5. Schließlich haben Einweg-Bioreaktorsystemen der potenTiAl auf die Bedürfnisse von großen industriellen Produktion gerecht zu werden und um Leitlinien und Empfehlungen der nationalen und internationalen Aufsichtsbehörden 6-10 einzuhalten.

Zellen, die in Suspension wachsen, Zellen, die als Zuschlagstoffe zu wachsen, und die Zellen, die mit einem Substrat verankert wachsen: Säugerzelllinien können in eine von drei Kategorien auf der Basis ihrer Wachstumseigenschaften klassifiziert werden. Obwohl die Luft-Rad-Bioreaktor, in diesem Video gezeigt, in der Lage, alle drei Arten von Zellen wachsen, wird dieses Video Verwendung des Bioreaktors zur Verankerung abhängigen Zellen auf Mikroträgern wachsen zu demonstrieren. Wobei die Zellen selbst sind das Produkt - verankerungsabhängigen Säugetierzellen können zum Zwecke der Herstellung von mehr Zellen gezüchtet werden. Beispielsweise menschlichem Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen werden zur Zeit mit dem Zweck der Ernte der Zellen und deren Injektion in die erkrankte Gewebe kultiviert. Der pneumatische Bioreaktor in diesem Video gezeigt hat für die Herstellung solcher mesenchymaler Stammzellen für diese Anwendung als geeignet erwiesen (Serra et al., Persönliche Mitteilung, 2013). Anchorage dependent Säugetierzellen werden in der Regel gewachsen kleinen Maßstab in 2D Kulturgefäße wie Zellkulturplatten, Zellkulturflaschen oder Rollerflaschen, wo sie auf eine speziell behandelte Oberfläche 1 Wachstum zu halten. Wenn mehrere Zellen erwünscht sind, können die Platten oder Flaschen durch Verwendung von mehr oder größere Gefäße erweitert werden. Aber für kostengünstigere Kultivierung großer Mengen von verankerungsabhängigen Zellen, wodurch die Oberfläche für die Zellanheftung kann mit kleinen festen Kügelchen genannte Mikroträgern durchgeführt werden. In Abhängigkeit von den Bindungsmerkmalen der Zelle gibt verschiedene Arten von Mikroträger im Handel erhältlich, wie Dextran, ein Peptid oder Kollagen beschichtet ist. Mikroträger haben eine große Oberfläche im Verhältnis zum Volumen bietet eine größere Fläche für das Zellwachstum; und die Mikroträger in Suspension unter Rühren, das die Zellen zu hohen Dichten in Bioreaktorsystemen 2 kultiviert werden können beibehalten werden. Derzeit sind die Arten von bioreactors wo adhärenten Zellen auf Mikroträgern gewachsen sind Spinnerflaschen und Rührkessel-Systeme, die axiale Laufräder verwenden, um Aussetzung der Zelle resistenten Mikrounternehmen zu erhalten. Mehrere Faktoren sind wichtig für die erfolgreiche Kultivierung von Zellen, einschließlich der Sauerstoffspannung, Scherspannung, Oberflächenmatrix und Nährstoff-und Metabolit-Konzentrationen. Die Verwendung von Bioreaktoren ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Wachstumsbedingungen und der Potential signifikant niedrigeren Produktionskosten 1. Es gibt verschiedene Designs Bioreaktor für in-vitro-Zellkultivierung einschließlich gerührten Suspension, rotierenden Wandgefäß, Hohlfaser-, Beutel-Bioreaktor auf einer Wippe Plattform und Wirbelschichtsysteme 3. Viele dieser Systeme präsentieren einzigartige Probleme für die Zellkultivierung und skalieren -up, wie hohe Kosten, Nährstoff Konzentrationsgradienten, hydrodynamische Scher, Zellaggregation und Schwierigkeiten bei der Probennahme, Überwachung und Steuerung cell Scale-up. Verschiedene adhärenten Zelllinien sind in der Herstellung von Viren, entweder bei der Herstellung von viralen Impfstoffen oder zur Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie-Anwendungen verwendet. In diesem Video mit dem einmaligen Gebrauch pneumatische (Luft-Rad) Bioreaktorsystem, zeigen wir die Kultur der Menschenlungenkarzinomzellen (A549) Zellen auf Mikroträgern für die Produktion eines onkolytischen Adenoviren. Der pneumatische Bioreaktor Design verwendet eine vertikale Bewegung Rad, das durch den Auftrieb des Gases in dem Boden des Bioreaktors gespült angetrieben wird. Diese sanfte Methode begrenzt Rühren hydrodynamische Scherkräfte, aber immer noch gewährleistet eine optimale Medium und Zell Mischen von 4. Im Vergleich zum Rührkessel, hat die pneumatische Reaktor geringer Wandschubspannung auch bei hoher Lautstärke Air-Rad-Bioreaktorsystemen (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Rührkesselreaktoren, wird die vertikale Laufrad dieser einmaligen Gebrauch Reaktor durch einen Strom von Gasblasen innerhalb gedrehtDas Schiff, das für die schonende und gleichmäßige Durchmischung Medium (Abbildung 2) ermöglicht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

In Abbildung 3 sind die Parameter für die Auslösung der Bioreaktorlauf gezeigt. Diese Abbildung zeigt den Bildschirm vor der Einstellung der Parameter Temperatur, Sauerstoffgehalt, pH-Wert und Agitation. Nachdem die Parameter festgelegt sind, werden die Laufparameter kontinuierlich überwacht und Einstellungen vorgenommen, um die erforderlichen Bedingungen aufrecht zu erhalten. Die Software erzeugt einen kontinuierlichen Anzeige, die für die einfache Identifizierung von Problemen ermöglicht. In diesem Experiment wurde unter Verwendung von 2,5 l DMEM mit 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-Schaum-C, 2 mM L-Glutamin und 3 g / l Mikroträger wird das System stabilisiert, so dass die Prozent Sauerstoff beträgt 50%, die Temperatur 37 ° C, und der pH-Wert beträgt 7,2. Der Reaktor wird mit A549-Zellen bei einer Konzentration von 7 x 10 4 Zellen / ml (oder 10 Zellen / Mikroträger) inokuliert. Die für diese Ausführung gewählten Parameter führte bei der Mehrzahl der Zellen innerhalb von 2 h (4) haften, um die Mikroträger. Nach 12 Stunden sind die Zellen Dämonentrier Zeichen der Abflachung und Ausbreitung auf der Mikroträgeroberfläche (5). Um 24 h, haben Mikroträger eine relativ gleichmäßige Verteilung der Zellen, ohne Mikro-Träger ohne Zellen und ohne große Klumpen von Zellen auf den Mikroträgern (Abbildung 6). Der Anteil der Mikroträger Kolonisierung durch A549-Zellen 75% bis 24 h und anschließend 90% (Figur 7). Die Zellen weiterhin exponentiell zu ca. 1 Million Zellen / ml nach 48 Stunden (Figur 8) wachsen. Nach Infektion mit einer Dosis von onkolytische Adenovirus (2 x 10 8 Virionen / ml) bei 50 Stunden, erhöht sich die Dichte auf 1,2 Millionen Zellen / ml und begann dann zu verringern, wie die lytische Infektion fortgeschritten ist. Es war ~ 10.000-fach Verstärkung des viralen Impfstoff. In vorherigen Experimenten haben wir festgestellt, dass die Überwachung und Anpassung Gasstrom ist für die Maximierung des Zellwachstums (unveröffentlichte Daten). Schnell wachsende Zellen können das System mit Sauerstoff abzureichern<html> die DO-Ebene zu Null abgesenkt. Während die Zellen weiter zu wachsen, war es bei einer viel langsameren Geschwindigkeit. Es ist wichtig, Überwachung und Anpassung der Sauerstofffluss, um die Zell Anforderungen während der logarithmischen Wachstumsphase zu erfüllen. Jeder Lauf kann für ein optimales Wachstum durch den Vergleich der pH-Wert, DO und Temperatur mit täglichen Zellzahlen analysiert werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Fluiddynamik des Pneumatik-Bioreaktorsystem (PBS), verglichen mit einem Rührkessel-Bioreaktor Messung der Wandscherkräfte an verschiedenen Reaktorvolumen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Pneumatische Air-Rad-Reaktor Laufrad. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Pneumatische Luft Rad Software Screenshot von Parametern, den Bioreaktor Lauf zu initiieren. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Micro-Träger Besiedlung mit A549-Zellen 2 h nach der Inokulation. (Durchschnittliche Mikroträger Durchmesser ~ 180 um.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Figur 5. 12 Stunden nach der Initiation der Kultur werden die Zellen A549 Anbringen Abflachung und Verteilen auf den Mikroträgern.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Abbildung 6. Micro-Träger mit den Zellen nach 24 h in Kultur beschichtet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> Abbildung 7. Prozentualer Anteil der Mikroträger Kolonisierung durch A549-Zellen nach der Inokulation. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Abbildung 8. Die Anzahl der lebensfähigen A549-Zellen in Kultur vor und nach Infektion mit adenoviruns. Beachten Sie, dass die Virusinfektion Schritt erfolgte bei 50 Stunden.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Serie: Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Betrieb einer Tischbioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

A Novel Bioreaktor für High Density Anbau von Diverse mikrobiellen Gemeinschaften

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

Bau von CRISPR Plasmiden und Nachweis von Knockout-Effizienz in Säugetierzellen durch ein Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...