Bu çalışma Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale tarafından desteklenen, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, Hopital de Strasbourg, pour la Recherche Derneği sur le Kanser, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche ve Bölge Alsace. Pietro LaNeve la Recherche Médicale Fondation tarafından dökün desteklenmiştir. Şu anda, o bir Istituto Italiano Tecnologia (İİT) bursu bir alıcı. Yayın maliyetleri Neurex ağı tarafından desteklenmektedir (TriNeuron - Program İnterreg IV Yukarı Ren)

1. Numune Toplama <ol><li> Pipetleme yarı yapışık Schneider&#39;in 2 hücreleri, (ortalama 1-5 x 10 6 hücre), ayırmak ve santrifüj (1 dakika için 100 xg) hasat. In vitro kültürlenmiş hücrelere yapışık durumunda, standart koşullarda bunları trypsinize veya doğrudan bir hücre kazıyıcı yardımı ile, RNA ekstraksiyon reaktifi için uygun bir miktar içine levhalardan toplarlar. </li><li> Embriyo toplanması için, sinek kafeslerde Drosophila suşları büyümeye ve izin embriyolar yumurta döşeme plakaları üzerinde birikir. Damıtılmış su içinde bir fırça (dH 2 O) embriyolar siliniz, elek filtreleme tarafından enkaz atmak yıkayınız ve bir şişe 48 embriyolar kurtarmak. </li><li> Bir diğer yöntem olarak, elle dokular / organlar teşrih. Vis gibi diseksiyon iğneler veya forseps kullanılarak, bir stereo mikroskop (20 X büyütme) altında, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde, Drosophila karın testisler (piRNA analizi için tercih edilen bir sistem) yalıtmakSullivan ve arkadaşları 49 ayırd. </li><li> Pestle RNA ekstraksiyon reaktifi 0.5 hacim bağımlılığı üzerine örnekleri homojenize. </li></ol> 2. RNA Ekstraksiyon / Analiz <ol><li> Aşağıdaki Üreticilerin talimatları ticari reaktif ile RNA izolasyonu gerçekleştirmek. DİKKAT! RNA ekstraksiyon ajanlar genellikle zehirli ve yakıcı vardır. Alternatif bir şekilde, RNA izolasyonu için bir 50 Proteinaz K tabanlı bir protokol uygulanır: <ol><li> Durdurma Mix 400 ul numune içine seyreltilir ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Kloroform: izoamil alkol ve kloroform ekstraksiyonu ve etanol (EtOH) çöktürme / yıkama, standart fenol suda çözülebilen komponentlerin reküperasyonu. Hava örnekleri kuru ve dietilpirokarbonat (DEPC) içine tekrar süspansiyon çift (dd) H 2 O damıtılmış -lı </li></ol></li><li> UV spektrofotometrik ölçümü ile RNA konsantrasyonu değerlendirin. Ayrıca, RNA saflık 2.0 civarındadır, yüksek bas sağlamakA 260 üzerindeki ed / A 280 okuma. </li><li> Aşağıdaki gibi agaroz jeli denatüre edici RNA, hazırlık Kontrol <ol><li> Bir temiz bir beher içinde, sürekli karıştırma altında, DEPC ile GKD 2 O 82 ml, 1.2 g Agaroz çözülür. Tamamen eriyene kadar kaynatın. </li><li> Jel solüsyon soğumaya bırakın; sıcaklığı 60 ° 10X 4-morfolinpropansülfonik asit 10 ml eklemek C ulaştığında (MOPS) 1X son konsantrasyonda (YP) için tampon, ve 8 ml 3 formaldehit% 37% FC. DİKKAT! Formaldehit kanserojen. </li><li> Yatay elektroporez hücresine jel dökün. Jel en az 1 saat boyunca bir başlık altında katılaşması için izin verin. Katılaşma sonrasında, MOPS 1X içine jel daldırın. </li><li> Tümbölen RNA numunesinin 2 mikrogram ve Ladder 1 mikrogram (doğru değerlendirilmesi istendiğinde bir RNA işaretleyici kullanın). RNA agaroz yükleme boyası (ALD) 3 cilt ve Ladder&#39;a. Sıcaklık 70 ° C&#39;de 5 dakika boyunca buz üzerinde ve hemen serin. CAKatkı! ALD İçeriği (etidyum bromür ve formamiddir, Malzeme bakınız) sırasıyla, mutajen ve aşındırıcı. </li><li> Örnekleri yükleyin ve arada tampon geri dönüşümü ile yaklaşık 1 saat boyunca 50 V de jel çalıştırın. UV görselleştirme veya jel görüntüleme ile RNA fraksiyon desenini kontrol edin. 28S ve 18S rRNA ve tRNAs tekabül eden somut bantları tanır (Şekil 1). </li></ol></li><li> -80 ° C&#39;de Kuzey Testi veya saklamak RNA devam edin. </li></ol> 3. denatüre Akrilamid Jel Hazırlanması <ol><li> Bu bölme aşamasında için küçük bir dikey elektroforetik cihazı (plaka boyutu yaklaşık 8 cm x 9 cm, tarak kalınlığı 0,75 mm) kullanın. </li><li> Bir döküm çerçeve içinde birbirine temiz gözlük birleştirin. </li><li> (19: 1), MOPS 1X çözelti, 7 M üre,% 10 akrilamid / bis-akrilamid, 10 ml hazırlayın. Dökümden hemen önce,% 10 amonyum persülfat ve TEMED 100 ul, 10 ul ve süratli bir şekilde karıştırın. DİKKAT! Akrilamid nörotoksik ve kanserojendir. </li><li> Cam plakalar arasındaki jel dökün ve kabarcıkları önlemek için dikkatli iyi tarak yerleştirin. Jel, kullanılmadan önce en az 45 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize edelim. Alternatif olarak, jel O / N, su ile ıslatılmış filtre kağıdı ile sarılmış ve saran sargısına kapalı olarak muhafaza edilebilmesi. </li></ol> 4. Numune Hazırlama <ol><li> 0,5-20 kısım her numune için toplam RNA&#39;nın ug. 3-4 ul hacim aşarsa, vakum örnek kurutun. </li><li> Boyut tayini için bir belirteç olarak (hazırlanması için, Bölüm 4.3 ve 4.4), örnekler paralel radyo-etiketli düşük frekans merdivenin bir kısım (20-30 cps) çalıştırın. Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi, örnekler paralel olarak işleme tabi tutmaktadır. </li><li> Merdiven: 10 bp-merdivene 0.1 ug kullanılarak fosfat ileri reaksiyonu kurmak. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve 20 mM FC kadar etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> EtOH yağış / yıkama, kuru hava ve saflaştırarakGKD 2 O (yaklaşık 100 ul). tekrar süspansiyon DİKKAT! 32 P radyoaktif bir kaynağıdır. </li><li> Her bir numune için akrilamid mavi boya (ABD) bir eşit hacmi ekleyin. 5 dakika boyunca 80 ° C&#39;de ısıtılarak denatüre etmek ve yükleme. DİKKAT kadar buz üzerinde serin! Formamid (ABD cinsinden) aşındırıcıdır. </li></ol> 5. Elektroforetik Fraksiyonasyon <ol><li> Döküm destek cam plakalar çıkarın ve düzgün elektroforez hücrede bir araya. Yeterli Running Buffer (RB), her iki iç ve dış bölmeyi doldurun. </li><li> Yavaşça tarak kaldırmak ve 10 dakika boyunca 200 V&#39;de jel ön çalıştırın. Yükleme örnekleri önce, bir şırınga aracılığıyla bazı RB squirting kuyulardan üre mevduat silsin. </li><li> Düz ipuçlarına her oyuğa altındaki aşama dikkatlice 4,5 tabakalandırmak örnekleri için. Ters akmasını önlemek için anot ve katot bağlantıları kontrol edin. Numuneler 5 dakika boyunca 100 V&#39;ta jel girdikten sonra, ben200 V&#39;a voltajı arttırın </li><li> Yaklaşık 7 cm uzunluğunda, bir fraksiyonlara ayırma, bir 45 dakika süren bir çalışma yeterlidir. Jel taşma Bromofenol mavisi (ABD bir izleme pigment) kaçının. </li><li> Tercihe bağlı bir adım olarak, etidiyum bromür (EtBr) boyama ile parçalanmış uzun RNA jel üzerinde: Görsel <ol><li> Jel üstünden uzağa 2 cm kesmek ve kısaca GKD 2 O. dilim durulayın </li><li> RB, EtBr 0.5 ug / ml YP nazik karı koca gibi yaşayacaklar ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında jel dilim inkübe edin. </li><li> RB 15 dakika jel destain, UV ışınlaması veya jel görüntüleme uzun rRNA görselleştirmek. RNA yükleme ve kalitesi (bkz Şekil 1, Panel 7). DİKKAT edin! Etidyum bromür bir mutajen. </li></ol></li><li> Bu arada küçük RNA türlerini içeren jel alt kısmı blot devam edin. </li></ol> 6. Jel Blot <ol><li> 6 lekeleme alanına sığdırmak için kurutma kağıdı parçaları ve uncharge eşdeğer bir parça kesmekd naylon membran. Kağıt yapraklarını, membran ve RB 2 blot pedleri nemlendirin. Tamamen art arda RB onları sıkarak pedleri emmek için emin olun. </li><li> Aygıtından jel çıkarın ve bir spatula ile ortalama gözlük açın. Kuyu kaldırmak için temiz bir kesici kullanın. Jel ıslak whatman bir kağıt yerleştirin ve hafifçe yukarı kaldırın. </li><li> Jelin serbest yüzünde bir naylon zar yerleştirin. Numune yükleme işlemi göre olan filtre yönlendirmek için bir köşe işaretleyin. &quot;Sandviç&quot; (3 Kağıt parçalarını her tarafı) tamamlayın. Olası bir hava kabarcıklarını çıkarmak için, yüzey üzerinde leke plastik çubuk döndürün. </li><li> Blot kaset iki lekeleme pedleri ve daha sonra arasındaki blot yerleştirin. , Blot modülü kaseti monte RB ile bölmeyi doldurup (jel ve pozitif terminali arasında kalmalıdır naylon membran) doğru yönde kontrol edin. </li><li> 20 dakika boyunca 20 V aktarın. Not: 10 dakika kurutma modülü ve r açtıktan sonra, homojen koşulları sağlamak içintransferi tamamlamadan önce 180 ° sandviç otate. </li></ol> 7. Membran Çapraz <ol><li> Taze Çapraz Çözüm (XLS) 6 ml hazırlayın. Doyurabilecek 10 cm (naylon membran daha büyük) 10 cm XLS. DİKKAT kurutma kağıdı parçası x! HCI (XLS bir bileşeni) son derece yakıcıdır. </li><li> Blot sökün ve ıslak 3MM filtre kağıdı üzerinde membran yerleştirin. Not: RNA, doymuş kağıt ile doğrudan temas halinde olmamalıdır. Iki cam levha arasında filtresi ve kağıdı yerleştirin ve Saran-şal sarın. </li><li> Bir GKD 2 O yıkama, ardından 2 saat boyunca 60 ° C &#39;de membran, ısıtın. -20 ° C&#39;de saklayın veya melezleşme geçin. </li></ol> 8. Membran melezleme <ol><li> RNA yükleme (isteğe bağlı adım 5.5) kontrol edilmiş ise, doğrudan melezleme devam edin. Ya da, bir naylon filtreden en üstüne uzak 1 cm kesmek sistemi çapraz hybridizatio bilmekparçalanmış uzun RNA&#39;lar ns. </li><li> 37 ° C&#39;de hibridizasyon çözeltisi (HS) 10 ml ön ısıtma. , 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de somon spermi, 1 mg denatüre buz üzerinde serin ve hümik ekleyin. </li><li> , Bir hibridizasyon etüvü içinde dönme altında, en az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de HS filtreyi inkübe edin. Filtrenin RNA tarafı HS karşı karşıya olduğunu kontrol edin. </li></ol> 9. Probe Sentez <ol><li> 4.3 de tarif edildiği gibi, belirli bir antisens oligonükleotid olarak 10 pmol bir fosfat ön reaksiyonu ayarlayın. </li><li> (EtOH ya da çökeltme yoluyla) Tris-EDTA-NaCl (TEN) 5 hacim, reaksiyona tampon ve bir Sephadex G-25 sütun üzerinde jel dışlama kromatografisi ile birleşmemiş nükleotidlerden işaretli primer arındırmak ekleyin. Prob aktivitesi sıvı parıltı sayacı ile değerlendirilebilir. </li></ol> 10. Membran Hibridizasyon <ol><li> 10 ml taze alikot (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan ve tamamlanan) ile bitmiş HS değiştirin. Isı için sondaBuz üzerinde serin ve yeni ekle HS 10 dakika boyunca 95 ° C olarak ölçülmüştür. 37 ° C AÇIK filtreyi inkübe. </li></ol> 11. Membran Yıkama <ol><li> Hibridizasyon çözüm kurtarmak ve bir radyoaktivite-koruyucu kutusuna -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yıkama Tamponu (WB) &#39;de durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile iyice yıkayın. </li><li> Filtre köşelerde bakiye radyoaktivite kontrol etmek için bir Geiger Mueller Dedektörü kullanın. Arka plan emisyon yaklaşık 5 cps olduğunda, fuar zar geçin. </li></ol> 12. Sinyal Algılama <ol><li> Otoradyografisidir filmlerde ya da moleküler görüntüleme ekranı ON filtreyi Açığa. Fotografik işleme veya dijital dönüşüm ile sinyallerini veriyor. </li><li> Özel ölçüm yazılımı (İmageJ veya Optiquant) tarafından bant yoğunluğu analiz edin. </li></ol> 13. Membran sıyırma <ol><li> Soyma çözeltisi kaynayan 500 ml su altında, zar birincil sinyalleri kaldırmak için, Daha sonra 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Yeni bir (ön) hibridizasyon ile devam ya da -20 ° C&#39;de filtre saklayın. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

RNA nörogenezi düzenleyen hangi aracılığıyla intertwining sophisticate bizim takdir sürekli artmasına rağmen, nöral kök hücre biyolojisi, nöronal farklılaşma / fonksiyonel entegrasyon, sinir patolojileri ve kanser gelişimini etkileyen RNA bazlı circuitries mekanik etkileri keşfedilmemiş kalır. Drosophila kısa kodlamama RNA&#39;lar ve transkripsiyon faktörleri majör moleküler oyuncuları olarak hangi keşfedilmemiş hücresel yollar, çözülmeye enstrümantal melanogaster gibi krallıklar aracılığıyla bu ağların bakım genetik sistemlerin potansiyelini yapar. Bu görüşe göre, aday küçük RNA ekspresyon seviyelerinin profil doğru işlevsel analizleri için propaedeutic gerçekleştirilir: Örnek Kuzey Beneklenmesi deneyi geliştirilmiş bir versiyonu olarak aracılığıyla gerçekleştirilir DMEL-miR279 in vivo gsm / kayma kaderi belirleyicisi modüle eden yeni gösterimi, gelen ekspresyon analizi için bir araç. <p1977 51 yılında ilk kalkınma beri class = &quot;jove_content&quot;&gt;, NB RNA analizi için referans yöntem olarak kabul edilmiştir. Sinyal ölçümü ile biçim veya olası hataları multiplex zor dönüşüm olarak bu testin bazı içsel sınırlamaları rağmen, RNA moleküler biyolojisinde son atılımlar küçük ribonükleik endojen ifadesini denemeye yönelik bir &quot;hızlı ve temiz&quot; sistemi olarak bu geleneksel tekniği yeniden keşfedilen var asitler veya gain- veya kayıp fonksiyon-yaklaşımların etkinliğini doğrulamak için. Yaklaşım düzenleme RNA&#39;lar 52 sürekli yeni özellikleri karakterizasyonu kendi alaka için ön planda kalırken paradigmatik örneği olarak, Kuzey analizi, microRNA orijinal keşif temelinde yatmaktadır. Burada tarif edilen varyant bağlı RNA kimyasal çapraz bağlama için artmış duyarlılık dayanmaktadır. Biz believethe yöntemi hala kötü Drosophila istihdam, bBu RNA hedef tespit 41,43 ortalama 10-30 kat artış ile küçük örnekler (az 1 ug), mümkün profilleme RNA ifadesini yapar beri bizim koşullarda elde edilen ut istismar, önemli keşiflerinden 52 yol açmıştır (Şekil 2 ve 3). RNA bütünlüğü tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik bir sorunu oluşturmaktadır. RNA manipülasyonlar çıkarma ve yükleme arasında meydana gelen olası örnek bozulmayı sınırlamak için doğruluk ve hız gerektirir. Bu amaçla, tüm solüsyonlar, RNaz etkinliği engelleyecek şekilde (DEPC) (otoklav daha sonra 37 ° C&#39;de% 0.1 DEPC varlığında 2 saat inkübasyona bırakıldı ve) kullanımı, daha önce işleme tabi diethylpyrocarbonate- olması gerekir. Çözelti tedavi, bir çözücü olarak su kullanılarak DEPC ile daha iyi sonuçlar saygı garanti eder. Tüm ekipman eşit bir Rnase-spesifik yüzey temizleyici ile temizledikten sonra, DEFPC ddH20 durulanmalıdır olacaktır. <p class="jove_content"&gt; RNA İzolasyonu: Farklı protokoller bozulmamış RNA izole etmek için kullanılabilir. Herhangi bir ticari guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform reaktif başarılı bir şekilde kullanılabilmektedir: bunlar son derece küçük RNA ekspresyon özellikle düşük olduğunda tavsiye edilmektedir (örneğin, rasi4, Şekil 2) veya RNA saflaştırma (taze numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir olmadığında, örneğin, doku depoya korunmuş reaktif). Deneyim, stabilize örneklerinden RNA izolasyonu ölçüde sert sonuçlandı ve daha şiddetli çıkarma şartları. Standart koşullarda, açıklanan proteinaz K-tabanlı bir yöntem de, (önemli bir örnek Şekil 1&#39;de temsil edilir) iyi kalitede hazırlıklarını garanti ama depolama reaktiflerdeki korunmuş örnekler için uygun bir seçim değildir. Bu prosedür, küçük RNA, spesifik olarak saptanması için hedeflediği için, son olarak, özel kolon saflaştırma dayalı kitler de th da, doğrudan küçük RNA izolasyonu için kullanılabilecektirisimli RNA bütünlüğünü doğrulamak için zor hale getirir. Yukarıda tarif RNA bütünlüğü kontrol için klasik bir jel bazlı prosedürüne bir alternatif olarak, nükleik asit, RNA, kalite desen çip üzerinde küçültülmüş analiz cihazları ile değerlendirilebilir. Tampon seçimi: MOPS-NaOH tamponu (pH 7) Geliştirilmiş Kuzey lekeleme ve jel elektroforezi her ikisi için tercih edilen bir tampon olarak önerilmiştir. Biz de tatmin edici bizim deneylerde Tris-borat-EDTA (TBE) tamponu kullanılmıştır. Tris (hidroksimetil) aminometan nükleofil amin gruplarının varlığı kendini hidrolize olan ve tedavi sırasında DEPC inaktive olur çünkü bu durumda ise, bu DEPC ile muamele edilmiş su yerine tedavi TBE tamponu içine önceden hazırlanmış Tris çözülmesiyle tavsiye edilir. Elektroforetik çalıştırın ve Blot: jel Ön çalışan fazla persülfat kaldırılması ve hyperfocusing ortadan kaldırmak için gereklidir. Ön çalışma parametreleri çok hızlı electropho kaçınarak, parçalanması sırasında da muhafaza edilmelidirRetikülosit çalıştırın. Yüklemeden önce, içeride tampon squirting, kuyulardan mümkün Üre tortuları kaldırmak için emin olun. Bu sinyaller tespit sırasında çözüldü otoradyografik bantları üreten, örnek dökülmesine ve teminatlar doğru RNA tabakalaşma sınırlayacaktır. Herhangi bir nötr naylon zar nükleik asit aktarımı için bir destek olarak kullanılabilir. Belirtilen koşullarda fazla 20-30 dakika boyunca RNA leke yoktur. Çapraz bağlama: EDC-bazlı kimyasal çapraz bu gelişmiş Northern Blot sürümü kritik metodolojik ilerlemeyi temsil etmektedir. Olasılığı RNA 5&#39;mono-fosfat grubu ve naylon primer aminler arasında kovalent sınır tarafından nötr yüzeylere kısa RNA türlerini çapraz bağlanması için melezleşme için kullanılabileceği bazların çoğunluğu bırakır. Bu geleneksel çapraz bağlama için 10-20xrespect olarak duyarlılığı arttırır. Bu uygun bir membran doygunluk için yeterli bir miktarda, her bir lekeleme için çapraz bağlama çözeltisine taze miktarının hazırlanması için çok önemlidir. Hibridizasyon ve Yıkama: Sondalar tercihen taze etiketli olmalıdır. (Melezleşme için kullanılabileceği sonda miktarı, ayrıca spesifik aktivitesine bağlı olarak ve bu buluşa katılan radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotid miktarı ve benzeri) bir spesifik aktivitesinin Prob, hedef saptama hassasiyetini belirler. 3000 Ci / mmol bir özgül etkinliğe ATP kullanılmıştır [32P γ-] olduğunda, 5 &#39;uçlarında, 100% etiketleme için 10 6, cpm / pmol beklenmektedir. Hibridizasyon Çözelti geri kazanılabilir ve göz önünde yeniden kullanılabilir, nedeniyle bu 32P bozunma, yaklaşık 14 gün içinde sistemi aktivitesi değinmektedir. Nedeniyle membran tarafsızlık, düşük arka plan gürültü melezleşme üzerine bekleniyor. Daha sıkı yıkama koşulları gerekli olması halinde, aşamalı olarak (0.2x SSPE kadar) yıkama tamponu iyonik kuvvetini azaltmak ya da 37 ° C yıkama sıcaklığı yükseltmek iyonik deterjanlar ya da (en fazla% 0.5 SDS ile) artan bir şekilde artırmıştır. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; sonraki melezleme ile sinyallerini örtüşen önlemek için, birincil sonda tamamen sıyırma üzerine filtreden olduğunu yeniden açarak doğrulamak için tavsiye edilir. Bununla birlikte, filtre RNA ilerleyen kaybıyla soyulmak ve yeniden sondalama fazla 3-4 döngüleri kaçınılmalıdır. RNA, boyut ölçümü ne zaman gerekli olduğunu Northern leke analizi önemlidir. Bu tahlil floresan tabanlı QPCR minik RNA&#39;lar tahmini için yaklaşımlarının doğruluğunu yoksun olsa bile, bir avantaj / denatüre parçalaması kullanılarak kurutma ve hedef RNA&#39;lar algılama önce benzersiz adımlar olarak prob-bağımlı hibridizasyon türemiştir. Bu nedenle, örneğin belirli sinyallerin açığa doğrudan ve özel ticari kit kullanımını ima enzimatik işlem / dönüşüm / amplifikasyonu herhangi bir ek aşamasını gerektirmez. RNA seviyeleri ölçülür ve tek dokular üzerinde birçok örnek arasmda karşılaştırılabilir. Böylece NortheRN benek yaygın QPCR verileri için sıkı bir doğrulama olarak kullanılır. Spesifik deneysel koşullara bağlı olarak tetiklenen yöntem RNA&#39;ların sınırlı miktarda (Şekil 2 ve 3), böylece de her iki hassasiyet ve çözünürlük seviyesinde, son yıllarda geliştirilmiştir başarılı bir analiz için gereklidir. Biz sunulan protokol malzeme, sınırlı miktarlarda mevcuttur, özellikle geniş bir uygulama yelpazesi için adapte edilebilir. RNA örneklerinin biyolojik kaynağı heterojen olabilir: Drosophila söz konusu kadarıyla, embriyolar ya da diğer gelişim aşamaları, tek tek hücrelerin izole Ayırma cytotypes veya hücre kültürleri, uygun olan, ama aynı zamanda el ile dokuları ya da organları kesildi. Ayrıca, microRNA hücre ve RNA aracılı gen ifade kontrolü alanında soruşturma önemli konu kısa düzenleme RNA&#39;lar en bol sınıf rağmen onlar dezavantajları mutlakaHücresel kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar tek aile titute. Küçük RNA&#39;ların Çok sayıda küme genellikle ön moleküllerinin endo-ribonucleolytic işleme türeyen krallıklar (örneğin, endojen siRNA&#39;lar, piRNAs, snoRNAs, bitki tasiRNAs) ve bunların çoğu (modifiye edilmemiş) bir serbest 5 &#39;ucundan itibaren özelliği, işleyiş. Bu özellik uzun RNA&#39;lar bakıldığında RNA boyutu yanı dikkate alınması olsa bile, kesinlikle kimyasal çapraz dayalı özel geliştirilmiş metodolojisini uygulamak için gerekli benzersiz yapısal önkoşul oluşturmaktadır. Şekil 2 de, geliştirilmiş bir hassasiyet Northern Blot analizleri nispeten zayıf rasi4 54 ve spesifik ekspresyon düzeylerinin koşullarında germ-çizgisi küçük RNA özgü bir sınıf (RNA ya da piRNAs Piwi etkileşen.) Üyesi seviyelerini tespit rapor Bu yöntemin, özellikle bilgi protokolü ayrıca tarak tarafından geliştirilebilir göz önüne alındığında, daha iyi sonuç yaptırımLiteratürde daha önce 55,56 açıklanan diğer pratik uygulamaları ile içerebilen.

RNA biyokimya geçmiş yıllarda 1 muhteşem ilerlemeler yaşanmıştır. Gen ifadesinin kontrolü RNA potansiyeli son anlama yeni RNA bazlı düzenleyici mekanizmaların 3,4 keşfedilmesiyle ve bilinen transkripsiyon sonrası olayların bir derin karakterizasyonu ile, güçlü bir kodlayıcı olmayan ribo-düzenleyiciler 2&#39;nin tanımlanması ile patlama edilmiştir 5. Hep birlikte bu çalışmalar izin RNA biyoloji dramatik güncel bilimsel peyzaj önemli bir araştırma konusu haline sahneyi yapmak. Özellikle, son yıllarda biz moleküler nörobiyoloji 6, modern hayatın bilimde en dinamik araştırma alanlarında birinde &quot;RNA dünyası&quot; yaygın etkisi duygusu alıyorsanız. Geçtiğimiz yüzyılın son on yılında, toplam bilimsel senaryo RNA müdahelesi 7,8 keşfiyle ve küçük düzenleyici RNA&#39;ların 9,10 devrim olmuşturmicroRNA özellikle 11 ile ilgili olarak, endojen gen ekspresyonu ve kombinasyon pleiotropik düzenleyici olarak hemen hemen tüm hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde implike küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar ifade edilmiştir. MiRNA&#39;ların yüksek sayıda Drosophila ve de 12-15 insan hücrelerinde tespit edildiğinde neredeyse 10 yıl Ambros ve Ruvkun laboratuarlarında tarafından Caenorhabditis elegans miRNA ilk keşiften sonra, yenilenen dikkat alanına döndü. O zamandan beri, çok yönlü transgenik yaklaşımları sayesinde, Drosophila melanogaster miRNA biyosentezi ve aktivite araştırılacağı değerli bir biyolojik bağlamda olarak durdu. Drosophila miRNA&#39;ların yolları, metabolizma yaşlanma sinyalizasyonu kapsayan,-böcek spesifik veya evrimsel olarak korunmuş süreçlerinde farklı işlevleri ortaya çıkarmıştır , davranış ve, elbette, nörojenez. Bu doğrultuda, son zamanlarda ilginç co bir roman bağlantı 16 tanıttıana gen gsm / kayma ve RNA yolun arasında meydana gelen rrelation. Sinek transkripsiyon faktörü GCM / Glide 17-19 multipotent glial vs nöronal kaderi seçim nöral öncüleri 20 uçmak dikte hücre kaderinin belirleyicisi, eşsiz bir örneğini oluşturmaktadır. Yirmi yıl bu konu üzerinde uzun araştırmalar gsm / üzerinde yakınsak gen ekspresyon düzenleme çoklu ve çakışan girdilerin oluşumunu nöral gelişim sırasında nöronal ve glial meslektaşları arasındaki hassas oranını dengelemek için gerekli eşik seviyelerini kurmak için 21-28 kayma altını açıkça gelmiştir. Biz DMEL-miR279 hedefleme yoluyla düzenlemenin gsm yayınlayabilmesine-transkripsiyonel ince ayar / ifadesini 16 kayma katkıda bulunan bir diğer kontrol düzeyi temsil keşfetti. Küresel olarak, bu araştırma çizgiler gerektirmiştir belirli metodolojik iyileştirmeler: yıllar boyunca, çeşitli teknolojiler aslında trad analiz etmek için geliştirilmişitional RNA&#39;lar gibi küçük olmayan bir kodlama RNA miktarının belirlenmesi için dönüştürülmüş, RNase koruma tahlilleri, cDNA dizileri 29-31, gerçek zamanlı PCR yöntemleri 32-35 ve 36,37 dizi analizi gibi. Diğer taraftan, teknik yaklaşımlar yeniden kalibre alanında sürekli ilerlemeler önemli avantajlar sağlamaktadır. Northern blot analizi (nb ya da RNA jel leke analizi) temsili bir örneğini teşkil eder: Bu boyut belirlenmesi yanı sıra, her iki ekspresyon seviyesi kantitatif sağladığından büyük ölçüde, RNA birikmesine profil kullanılır. Bununla birlikte, yöntemin içsel zayıf hassasiyet kısa RNA gibi, düşük miktarda gen ifadesi ince ayarlayıcıları uygulanacak olduğunda sınırlayıcıdır. Bir zararlı sonucu belirli biyolojik numunelerin zor başvurusunu yapan toplam RNA, büyük miktarda gerekliliktir. Bu gibi sebeplerle, küçük RNA&#39;lar tespiti için spesifik NB varyantları için 38-40 geliştirilmiştir: Biz geliştirilmiş NB yordam yararlandıedure 41 (ENB, Gelişmiş Northern Blot), DMEL-miR279 ve gsm / kayma arasındaki yukarıda belirtilen etkileşimi durulaştırmada ederken. Bu yöntem, bir karbodiimid türevi aktivitesine dayanarak diğer kimyasal çapraz bağlama adımı dayanır [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid, EDC] bir katı destek üzerine sabitlemek için bir nükleik asit. Karbodiimid aktive karboksil veya fosfat grupları ve amin grupları arasında amid 42 bağların oluşumunu katalize etmek üzere bilinen çok yönlü bir çapraz bağlayıcıdır. Bu özellik, naylon membran yüzeyinde amino gruplarına da mono-fosforile edilmiş 5&#39;-hidroksil grubu vasıtasıyla kovalent olarak çift küçük RNA&#39;ların etmek için kullanılabilir. Elde edilen bağlantı konfigürasyonu, sırayla, dikkate değer tespiti ile sonuçlanan iyileştirme 43 prob hedef hibridizasyon verimliliğini hareketsizleştirilmiş nükleik asidin erişilebilirliğini arttırmaktadır. Bu teknik belli relevanc kabulDrosophila moleküler çalışmalar e, hangi küçük kodlamama RNA&#39;lar yeni ve farklı sınıfların oluşumu 44 ortaya çıkmaktadır. Bunlar arasında, 45,46 diziye özgü gen susturma katılan piwi etkileşen RNA&#39;lar (piRNAs 47), belirli bir alt tipi teşkil rasiRNAs. Bu yöntemin operasyon detayları tam olarak tarif edilen ve bir rasiRNA, rasi4 arasında, ilk kez, microRNA DMEL-miR279 ve DMEL-miR286 analizine göre ve bundan sonra görselleştirilebilir. Biz RNA (az 1 mikrogram) minimal miktardaki kötü ifade hedeflerini ortaya bize izin bu yöntemi, extremes itti.

<table><tbody><tr><td>FINAL COMPOSITION/NAME</td><td>COMPANY</td><td>CATALOGUE (Stock)</td><td>COMMENTS</td></tr><tr><td colspan="4">GENERAL REQUIREMENT</td></tr><tr><td>Centrifuge, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Decontaminant, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Apply on glass/plasticware, wipe and rinse</td></tr><tr><td>RNase inhibitor, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Hazardous //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">SAMPLE PREPARATION</td></tr><tr><td>Stereo Microscope, M60</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA EXTRACTION/ANALYSIS</td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction reagent, TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 for extraction</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 1:1 for extraction</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Never cool down SDS to avoid&amp;nbsp; precipitation //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>Denaturing Agarose Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2% Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M MOPS sodium salt, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>Agarose Loading Dye</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Hazardous //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Hazardous //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Ethidium bromide (EtBr) 30 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Hazardous //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">SMALL RNA FRACTIONATION</td></tr><tr><td>Flat gel loading tips</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Denaturing Acrylamide Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Hazardous. Let the gel polymerize for 45 min before use</td></tr><tr><td>1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Label 0.1 &amp;mu;g, as described in the &quot;probe labeling&quot; reaction</td></tr><tr><td>Acrylamide Blue Dye&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Hazardous //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Running Buffer (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alternative RB: 1x TBE Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBE Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Staining Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide 0.5 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Hazardous //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Whatman paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Nylon Membrane, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td colspan="4">CROSSLINKING</td></tr><tr><td>Crosslinking Solution (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-methylimidazole (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12.5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Hazardous //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3.1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRIDIZATION</td></tr><tr><td>Liquid Scintillation Counter&amp;nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039; CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3&#039;</td></tr><tr><td>5s-rRNA anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3&#039;</td></tr><tr><td>Dmel-miR279 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3&#039;</td></tr><tr><td>Dmel-miR286 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3&#039;</td></tr><tr><td>Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Hybridization Solution (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5x Denhardt&#039;s Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&amp;nbsp;60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Probe Labelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;M oligonucleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 &amp;mu;l Ci/&amp;mu;l [&amp;gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Hazardous //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/&amp;mu;l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">WASHING</td></tr><tr><td>Geiger Mueller Detectors</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &amp;ndash; EM77021</td><td></td></tr><tr><td>Washing Buffer (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stringent Washing Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SIGNAL DETECTION</td></tr><tr><td>PharosFX Plus System</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>Freely available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantity One</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ray films , BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td>Developer for X-ray films</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Fixer for X-ray films</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">STRIPPING</td></tr><tr><td>Stripping Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Geçen yıl RNA düzeyinde gen ekspresyon kontrol mekanizmaları etrafında bilimsel ilgi patlaması yaşandı. Moleküler biyoloji dalı ölçüde post-transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli oyuncu olarak RNA&#39;lar kodlamayan keşfiyle tarafından desteklendi. Böyle bir devrimci perspektif yüksek verimlilik düzeyi (genom tanımlama) ya da tek aday analizi (spesifik türlerin kararlı durum birikimi) gibi hem, eşlik ve kısa RNA&#39;lar ifade profilleme için güçlü teknolojilerin geliştirilmesi tarafından tetiklenen olmuştur. Birkaç state-of-sanat stratejileri dozlama veya kaçan moleküllerin görüntülenmesi için mevcut olmasına rağmen, Northern Blot tahlil RNA ifade anında ve doğru değerlendirilmesi için moleküler biyolojide uygun yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu birçok durumda daha sofistike, pahalı teknolojiler ve uygulama doğru bir ilk adım, kolayca anlayışlar kazanmak için tercih edilen bir yöntemdir kalır temsilRNA biyoloji içine. Burada elle larva / yetişkin dokular kesilmiş ya da in vitro kültürlenmiş hücrelerde, insan embriyosu Drosophila melanogaster ikinci zayıf eksprese microRNA (ya da diğer küçük düzenleyici RNA türlerini) tespit edilmesi için (Kuzey Benek Gelişmiş) verimli bir protokol genel bakış. RNA çok sınırlı bir miktarı ve sitometri izole edilmiş hücreler olabilir, akış malzeme kullanımı da öngörülmektedir.

Şekil 1 &#39;de metinde tarif edilen ve şematik bir şekilde temsil genel prosedür takip edilerek, farklı kökenlerden gelen karmaşık bir RNA örneklerinden küçük RNA&#39;ların tanımını inceledik. (: Agaroz jel fraksiyonasyon denatüre bağlı bir adım) ve çift yüklü Şekil 1&#39;de sunulan deneyde, RNA bütünlüğü açısından kontrol Proteinaz K ekstre Drosophila Schneider 2 hücrelerinden izole edilmiştir. Jelin yarısı nötr bir zar üzerinde kurutulur ve kimyasal olarak çapraz bağlantılı EDC; ikinci yarısında, daha sonra UV çapraz bağlantılı, pozitif yüklü bir naylon filtre üzerinde (1,2 x 10 5 μJ / cm 2) transfer edilmiştir. DMEL-miR279 ailesine ait iki microRNA endojen ifadesi (DMEL-miR279 kendisi ve DMEL-miR286 15) her iki durumda da doğrulandı. Geliştirilmiş işlem (ENB) standart bir (SNB) daha yüksek hassasiyet saygı sağlar. Şekil 2 ve 3 vurgulanır. Deney Mantığı yukarıdaki ile aynıdır: burada testisler inen yetişkin ekstrakte edilen toplam RNA titrasyonu boyunca piRNA rasi4 Northern Blot otoradyografik algılama temsili bir sonuç rapor etmektedir. RNA, 0.5 ug yüklendiğinde ENB önceden özel bir bant tespit sağlar. Ölçüm kenara orantılı bir sinyal, doz / yanıt oranının saptanması lineer aralığında bağlı olduğunu göstermektedir, parçalanmış RNA miktarı ile orantılı olarak artar gösterir. Grubu aşağıda SNB göre bu yöntemin daha iyi hassasiyet onayladı. Bu durumda, tespit edilebilir bir sinyal en az SNB için RNA 10 ug elektroforetik ayırma ile elde edilir. Şekil 3 &lt;belirtildiği gibi benzer sonuçlar, örneğin, farklı bir kodlayıcı olmayan RNA türünün, 5S rRNA elde edilir/ Strong&gt;. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig1highres.jpg" width="500" /> Genel Northern Blot prosedürü 1. şematik Şekil. Ana prosedürel adımlar listelenmiş ve giderek sayılı. Sonuçlar aynı koşullarda gerçekleştirilen Geliştirilmiş Kuzey Blot (ENB) ve Standart Kuzey Blot (SNB), arasında karşılaştırıldı: Drosophila Schneider&#39;in 2 hücreleri (Panel 1), elektroforez (Panel 2), transfer (Panel 3) ve melezleşme (RNA izolasyonu Panel 5). ENB hedef RNA 5&#39;-ucunda ve membran arasına bağlanan bir kovalent (kurar nötr bir filtre (3 Panel membran sol yarısı) ve EDC-esaslı çapraz bağlama (Panel 4) gerektirir, bu raporda tarif edilen gelişmiş prosedürden söz eder Panel 4 pembe nokta). SNB RNA, çapraz pozitif Nylo yüklü bir UV tedavisi (Panel 4) elde edilirn, membran (3 panel, zarın sağ yarısı). O da SNB ve ENB prosedürü arasındaki farklar yanıt verdiği 5&#39;ler RNA spesifik sinyal, karşılaştırmalı koşullarda bir kalibratör değildir. Bu durumda, bir 5&#39;-etiketli (10 cps tekabül eder) bir miktar (bir referans &quot;başak&quot; olarak işlev, 50 nt uzunluğunda karıştırılmış oligonükleotit elektroforezden önce her bir örneğe ilave edildi (puan 4.3 ve protokolün 4.4) Panel 7). Yükleme aynı zamanda uzun rRNA (protokol noktası 5.5) on jelde EtBr boyanması ile tespit edilebilir. L = Merdiven. FV = Frontal View, LV = Yandan Görünüm, YG = Yatay Görünüm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51814/51814fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Comparrasi4 ifade akseptör kuzey benek analizi. testis özel piRNA rasi4 endojen seviyelerinin yüksek (ENB) veya standartlar (SNB), Northern blot ile açığa çıkarılır, Drosophila ergin testis çıkarılan (Her kuşaktan, yukarıda belirtilmiştir), toplam RNA üzerinde gerçekleştirilmiştir artan miktarları , veya tüm karınlarının dan (Abd). Her metodoloji için, bir kenara histogramlar yükleme kontrolü &quot;başak&quot; a aynı miktarda rasi4 saygı göreceli miktarlarını rapor. İki yöntemlerden sayımsal jeller altına yerleştirilen kesin grafiğinde birleştirilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51814/51814fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig3highres.jpg" width="500" /> 5s r Şekil 3. Karşılaştırmalı Northern Blot analizleriRNA ifade. Pozitif kontrol ve deneysel kalibrasyon gibi bir önceki analiz 5&#39;ler rRNA&#39;nın uzatıldı. Detaylar Şekil 2 deki gibi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51814/51814fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.9K Görüntüleme.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır. 

Video: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Genetik

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biyokimya

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Biyoloji

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Drosophila'da Tek mRNA Moleküllerinin Tespiti ve Miktar Tayini

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Yazar Spotlight: Drosophila Kas Dokusunda mRNA Mekansal Dağılımının Araştırılması 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Gelişim Biyolojisi

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Tüm Dağı RNA Floresan