Biz numune hazırlama ile yardım için Mikroakiskan ve Alessia Tempestini yardım için Gijs wuite, Erwin JG Peterman, ve Peter Gross teşekkür ederiz. Bu araştırma n 284.464 ° ve Ricerca 2013 RBFR13V4M2 Eğitim, Üniversite ve Araştırma FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro için İtalyan Bakanlığı ve çerçevesinde hibe sözleşmesi kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) tarafından finanse edildi Flagship Proje Nanomax.

Nanometre Stabilite ile 1. Optik Cımbız Kur Deney düzeneği% 1&#39;in altına yakalama lazer nanometre seviyesi ve yoğunluğu dalgalanmalar istikrarı işaret iki optik cımbız sağlamalıdır. Bu koşulların kombinasyonu tipik gerilim altında dambıl nanometre istikrarı sağlayacaktır (1 pN - Birkaç pN onlarca), tuzak sertlik (0.1 pN / nm) ve ölçüm bant genişliği (görüntü elde etme oranı 20 sn -1). Deney düzeneği bir şema, Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir. <ol><li> Optik cımbız tasarım ve inşaat 15,17: <ol><li> Mekanik titreşimleri azaltmak için aktif izolatörleri bir optik masaya deney cihazları monte edin. Akustik gürültüyü ve mikroskop yapının mekanik rezonans absorbe elastomerik yalıtkanları mikroskop yapıya monte edin. </li><li> R, lazer kaynağının yakınında, ayırma lazer yolunda bir optik izolatör kaydedinnedeniyle optik geribildirim rastgele genlik dalgalanmaları kent içi. </li><li> Mümkün olduğu kadar yakalama lazerin yol uzunluğunu azaltmak ve hava akımları ve türbülansa bağlı bir lazer işaret dalgalanmalarını azaltmak için bir kapalı kutu içinde bütün yolu içine alın. </li><li> Dik polarizasyonlarda iki kiriş içine: (YAG lazer, 1.064 nm dalga boyu Nd) tek bir yakın-kızılötesi lazer kaynağı bölerek çift optik cımbız oluşturun. Onlar gerilim 12 altında dambıl dalgalanmaya sebep nedeniyle zaman paylaşımlı tuzakları kullanmayın. </li><li> (En az) bir tuzak ve DNA gerginlik hassas düzenlenmesi ince hareketlerini sağlamak için Doğrudan Dijital Synthesizers (DDSS) tarafından tahrik acousto-optik deflektörlerini (AODs) kullanın. DDSS gerilim kontrollü osilatörler (VCO&#39;lar) daha iyi bir tuzak stabilite sağlar. </li><li> Alt nm hassasiyetle tuzak boncukların pozisyonunu tespit etmek için kondansatörün tekrar odak düzleminde iki kadran detektörü fotodiyotlar (QDPs) takın. </li></ol></li><li> Bu yoğunluk f edinmikroskop girişinde yakalama lazerin luctuations görüntü elde oranından daha büyük bir bant genişliğine sahip bir fotodiyot kullanılarak% 1 altındadır. </li><li> İki yakalama lazerlerin işaret istikrar Giriş: <ol><li> Fosfat tamponu içinde silika boncuk hazırlayın: silis boncuklar, 20 ul seyreltilmiş (1.54 um,% 10 katı) 1 ml aseton içine kısa bir süre, 30 saniye, vorteks sonikasyon ve santrifüj 2 dakika 19,000 x g&#39;de. 1 ml aseton ve tekrar yıkama süspanse edin. 50 mM fosfat, 1 ml tampon içinde yeniden süspanse 2 kez yıkanır ve son olarak 50 mM fosfat tamponu, 100 ul süspansiyon haline getirin. </li><li> Silis boncuklar ile optik cımbız kalibre: (yaklaşık 60 mikron kalınlığında) çift yapışkan bant kullanılarak bir mikroskop lamı bir coverslip takarak bir akış hücresi hazırlamak. 1 mg / ml BSA, akış ve 3 dakika bekleyin. Silis taneleri fosfat tamponu içinde 1/1000 seyreltilmiş Akış ve silikon gres ile akış odasını sızdırmaz. Tuzak her biri tuzağına boncuk ve güç spektrumu yöntemi 18 kullanarak tuzakları kalibre. </li&gt; <li> Pentil asetat ve nitro selüloz silika boncuk hazırlayın: silis boncuklar, 20 ul seyreltilmiş (1.54 um,% 10 katı) 1 ml aseton içine kısa bir süre, 30 saniye, vorteks sonikasyon ve santrifüj 2 dakika 19,000 x g&#39;de. 1 ml aseton ve tekrar yıkama süspanse edin. Ve pentil asetat, 1 ml içinde süspanse 2 kez yıkayın. Son olarak pentil asetat içinde çözülmüş,% 0.1 ile nitroselüloz pentil asetat bunları tekrar süspansiyon. </li><li> İkinci bir örtücü cam (60 x 24 mm) kullanılarak, bir lamel (24 x 24 mm) yüzeyi üzerine pentil asetat +% 0.1, nitroselüloz içinde çözülmüş 1,54 mikron çaplı silis boncuklar 2 ul yayıldı. Bir akış hücre oluşturmak için çift taraflı bant, iki adet kullanarak bir mikroskop lamı lamel takın. 50 mM fosfat tampon maddesi ile akış-hücre doldurun ve silikon yağı ile kapağını kapatın. </li><li> 2,000X büyütmede aydınlık görüntü mikroskopi bir silis boncuklar. Boncuk görüntü 190 p bir çapa sahip olacak şekilde görüş alanı, 768 x 576 piksel değerinde alınan 7 x 5 um olmalıdırixels. Ref. 17&#39;sinde olarak, kırınım halkaları görüntü sentroidi ve z xy pozisyonlarını hesaplar ve nm-doğruluğu ya da daha iyi bir piezo sahne hareket sürükleniyor düzeltir, bir geri bildirim yazılımı ile termal sürükleniyor dengeleyin. </li><li> Boncuk merkezi sol tuzağı orta örtü (QDP gelen xy sinyal seviyeleri kalibrasyon sırasında ölçülen aynı olması gerekir) ve pozisyon gürültü ve QDP onun standart sapmasının ölçülmesi. Doğru tuzak ölçümü tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Nanometre Doğruluk 2. Tek Molekül Yerelleştirme <ol><li> Floresan mikroskopi tasarım ve inşaat 15,19 <ol><li> Nanometre yerelleştirme doğruluğu için gerekli yüksek sinyal-gürültü oranları ulaşmak için yüksek kuantum verimliliği ve elektron-çarpılır CCD kullanın. </li><li> Bir görüntü piksel boyutu ~ 80 nm almak için optik seçin (örneğin, 16 mikron kalınlığında bir kamera piksel boyutunda bir görüntü büyütme ~ 200X). Bu suffi olduğunupixelation 8 dolayı lokalizasyon hatası ihmal Ciently küçük, ama yeterince büyük piksel başına fotonların önemli sayıda toplamak. </li><li> Uyarma kaynağı olarak ne olursa olsun, oryantasyonun bir tek kromoforların uyarılması üst düzeye çıkarmak için bir lazer (olmayan bir polarizasyon durumunu koruyan fiber optik vasıtası ile geçerek) olan ışığı polarize olmayan veya halka (bir λ / 4 dalga plakası içinden geçirilerek) polarize kullanır. </li><li> Verimli kesme hem uyarma ve tuzakla lazer ışıkları emisyon band geçiren filtreler seçin. Not: Deneylerimizde Atto532 boya ile işaretlenmiş protein ve 100 nm bant 600 nm&#39;de odaklanmış olan bant geçiş emisyon filtresi kullanılır. </li></ol></li></ol> 3. Mikroakiskan Tampon değişimi ve &#39;dambıl&#39; montaj, yani, iki optik tuzağa mikroküreler arasında tek bir DNA molekülünün ankraj, bir ısmarlama laminer kanallı akış kesin bir kontrol elde etmeksistem geliştirilmelidir. Bu, bir akış odasının, bir basınç deposu ve bir basınç kontrol sistemi (Şekil 2) tarafından tutulur. <ol><li> Akış Hücre hazırlama Not: bir protein-DNA etkileşim tek molekül deneyler için kullanılan akım odası 4 paralel tampon akımına izin vermek için fazla, tercihen 4 giriş ve çıkışa sahiptir 1, farklı deney için gerekli komponentlerden birini içeren her biri: boncuklar, DNA, protein ve görüntüleme tampon floresan etiketli. Akış kanallarında bileşenlerin ayrılması dambıl etkili düzeneğini sağlar. Ayrıca, görüntüleme kanal birkaç nanometre mertebesinde bir hassasiyette DNA bağlayıcı proteinin lokalizasyonu için gerekli olan yüksek sinyal-gürültü oranı difüzyon proteinlerden arka floresan önlemek ve elde etmek için faydalıdır. <ol><li> 4 giriş ve bir çıkış oluşturmak için bir elmas uç ile mikroskop lamı (76 x 76 x 1 mm) olarak Matkap 1 mm çaplı delikler. </li><li> Temiz inciE mikroskop etanol ile kayar ve sokulan O-ring ve erişim deliklerini çevreleyen slayt yapışkan halkası ile olan bağlantı noktası merkezi. Bu yapıştırma işlemi rahatsız olur parmak izi, önlemek için bu adımı sırasında eldiven giymek esastır. </li><li> Sürgüye NanoPorts Kelepçe ve tam bağlantıya olanak vermek üzere 1 saat boyunca 180 ° C &#39;de ısıtılmış fırında yerleştirin. </li><li> Bir kağıt parçası üzerinde akış hücresinin anahat desen çizin. Kanallar ~ 3 mm genişliğinde olmalı ve mikroskop lamı üzerine delikler konumunu eşleşmesi gerekir. </li><li> Parafilmlerin iki parça üstüne çizim yerleştirin ve bir neşter ile çizilen taslak boyunca keskin ve sürekli kesim yapmak. Oluşan herhangi bir çıkıntı çıkarın. Sadece temiz bir destek sağlamak için kullanılan Parafilm ™ alt tabaka, atın. </li><li> Ters metalik destek bağlı NanoPorts içeren bir mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Dikkatle emin th yapma, delik Parafilm odası anahat hizayaparafilm de odasının giriş ve çıkış zorla kabul ettirmek değildir. </li><li> Temizlenmiş bir mikroskop lamel (62 x 56 x 0,15 mm) ile kaplayın ve dikkatlice odayı saran aşırı Parafilm çıkarın. </li><li> Üzerinde sürekli bir basınç uygulamak için akış hücresi üzerine, daha önce 120 ° C&#39;de ısıtıldı, iki ısı blok, koyun. Parafilm yaklaşık 25 dakika boyunca erisin. </li></ol></li><li> Basınç rezervuar ve tampon kapları Basınç deposu pleksiglas (veya benzeri) imal edilmiştir ve altı tampon kapların yerleşimini mümkün olmalıdır. En az iki fazladan bir tampon kap içeren olasılığı alet rahatlığını artırır. Hava kabarcığı o şeffaf kaplar ve önemli ölçüde akış sistemi kullanımına yardımcı tüpleri ve sorun giderme unutmayın. Dalma pistonları önceden kaldırılmış olan steril ve tek kullanımlık luer kilit ucu enjektörleri (2.5 mi), iyi bir tampon kapları ve boru girişi ile kolay bir bağlantı sağlar. Emin oluntoplam sıvı hacmi, basınç haznesi, düzgün ve kararlı bir akış elde etmek için gerekli bir şart içindeki hava hacmi ile karşılaştırıldığında küçüktür. <ol><li> Deneyler sırasında açık veya kapalı tampon akışını dönüm için tampon konteynerlerin çıkışında kesme vanaları bağlayın. </li><li> Mikroskop sahnede akış hücresi monte edin. Polietereterketon boru (iç çapı ~ 150 mikron) ve flangeless parçaları ile akış odası girişlerine kapatma vanalarını bağlayın. Boru ve akış hücresinin NanoPort takımları arasında bir bağlantı olarak flor ile birleştirilmiş etilen propilen boru ~ 3 cm (iç çap ~ 500 um) ekleyin. Bu adım, camdan akış hücresi veya NanoPort ayrılma kırılmasını önlemek için bölme girişinde tampon akışını azaltmak için çok önemlidir. Geniş iç çapı borunun kullanımı, tek başına, diğer taraftan, biyolojik örneklerin büyük miktarlar gerektirecektir. </li><li> Atmosfer basıncında açık bir Falcon tüpüne akış gözü çıkışının bağlayın. Buboru akış odacığının dışına akan tampon için dizayn olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li><li> Basınç kontrol sistemi <ol><li> Ince basınç rezervuarın içindeki hava basıncını ayarlayabilme yeteneğine sahip bir basınç kontrol sistemi kurmak. İki bilgisayar kontrollü manyetik valfler, biri 0,5 atm basınç kaynağına bağlı (kompresör) ve atmosfer basıncında, ikinci biri kullanılarak yapılabilir. Solenoid vanalar art arda artırmak veya arzu edilen bir değer ulaşana kadar hattı içindeki basıncı azaltmak için yaklaşık 7 milisaniye boyunca açılır. NOT: Bu yaklaşım Carlos Bustamante 20 uyarlanmıştır, ve bir kademeli motor şırınga pompası 21 ile daha düzgün bir akış elde edilir edildi. </li><li> Basınç haznesi üzerinde uygulanan etkili bir baskı izlemek için özel yazılmış yazılımlar tarafından kontrol edilen bir basınç dönüştürücü ekleyin. Tipik çalışma basınçları dambıl toplanma ve akış sistemi bileşenlerinin yıkamak için 200 mBar&#39;a için 20 mBar&#39;a sırasına vardır. </li></ol></li&gt; </ol> Biyotinile deoksisitidin trifosfat 4. DNA Uzantısı (biyotin-dCTP) DNA molekülü, en fazla 1 um tuzak boncuklara akışı ve ankraj altında genişlemeye yardımcı olmalıdır. Ayrıca, uzun bir DNA, DNA bağlama proteini aydınlatılması kızılötesi ışık yakalama önleyecektir. Bunun nedeni IR ışık emilimini artırır photobleaching bir heyecan kromofor sonuçlarından özel öneme sahiptir. NOT: Bu çalışmada, DNA molekülü, 3.7 um uzundu. Molekül, birincil operatör O1 üç kopya ve iki yardımcı operatörler, O2 ve O3 her birinin bir kopyasını ihtiva etmiştir. Bu diziler, bu şekilde yakalanan boncuklar ve IR lazer ışınları yaklaşık olarak eşit mesafede edilen, molekülün ortasına yerleştirilmiştir. <ol><li> Biyotin-14-dCTP, 60 pmol, 5x terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT), tampon 4 ul (1 M potasyum Ca doğrusal DNA 3&#39;-uçlarının 1 pmol karıştırıncodylate, 125 mM Tris,% 0.05 (h / h) Triton X-100, 5 mM CoCl2 20 ul bir toplam hacim) ve 1.5 ul TdT ve GKD 2 O (25 ° C&#39;de pH = 7.2). 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe karışımı. Bu DNA, ekstremite başına en fazla 60 olan nükleotidlerin eklenmesi ile sonuçlanır. 3&#39;-çıkmalar gömme veya küt uçlar daha yüksek verimlilik ile kuyruklu olduğunu DNA unutmayın. </li><li> TdT reaksiyon tamponundaki CoCl2 kaldırmak kolonlanyla veya fenol / kloroform ile ekstraksiyon ve etanol ile presipitasyondan sonra uçlu DNA ile saflaştınlır. </li><li> Saflaştırmadan sonra, DNA, bir kaç hafta veya daha uzun süreler için -20 ° C de 4 ° C&#39;de saklanır tekrarlanan erimesi ve tekrar soğutulmasından önlemek olabilir. </li></ol> 5. Etiketleme protein tiol grupları ile ATTO532 Sistein kalıntılarının modifikasyonu yoluyla Etiketleme protein aktivitesini değiştirmemesi gerekir. Bu sorunu aşmak için, bir LacI mutant LacIQ231C, yüklenebileceğini els, protein stabilitesi 22 ile karışmaz gösterilmiştir pozisyonda 231. Bu mutant pozisyonda 231 yabani tip ve kimyasal modifikasyonlar ile aynı özellikleri koruyan bir monomer başına yalnızca bir sistein taşır. NOT: Biz ATTO532 maleimidi ile protein etiketlenmiş. <ol><li> Protein 7,0-7,5 ve 2 &#39;den 10 mg / ml arasında değişen bir konsantrasyonda kadar değişen bir pH değerine sahip bir tampon içinde çözülmüş olduğundan emin olun. Not: Bu deneylerde, Lacl potasyum fosfat, 0.3 M,% 5 glukoz, pH 7.5 (tampon A) içinde eritildi. </li><li> Çözündürülür Tris (2-karboksietil) H2O içinde 100 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar fosfin hidroklorür (TCEP); TCEP çözüm kullanmak için önce taze hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Dikkatli bir şekilde 3 ul TCEP ve vorteks ile proteinin 100 ul karıştırın. </li><li> Düşük ışık koşullarında çalışan, 10 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar N, N-dimetilformamid (DMF) içerisinde boya çözülür. Vortex kadar tamamen eriyene. </li><li> Tepki miX: dikkatlice protein + TCEP ve vorteks boyanın 33 ul ekle. Hızlı eğirme mümkün olduğu kadar fazla çözelti toplamak. </li><li> 20 ° C&#39;de bir çalkalayıcı (8.000 rpm) 2 saat boyunca reaksiyon karışımı inkübe (ya da 4 ° CO / G), ışıktan koruyarak. </li><li> L-glutatyon H2O içinde 100 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona (GSH) çözülür Reaksiyon karışımı 3 ul ve 15 dakika boyunca 8,000 rpm&#39;de çalkalayıcı içinde inkübe edilir. GSH tiyol gruplarının bloke reaktivitesi ile reaksiyonu durdurulur. </li><li> Standart jel filtrasyon sütunları, diyaliz veya sıkma konsantratörü kullanarak etiketli proteini arındırın. NOT: Bu deneylerde, etiketli Lacl 10 kDa kesme konsantratörleri sıkma kullanılarak saflaştırıldı. <ol><li> 8,000 xg, 1 saat, 4 ° C &#39;de, tampon A en fazla 12 ml tepkime karışımı seyreltik yoğunlaştırıcı cihaza uygulamak ve santrifüjlenir. LacI etiketli, böylece, yaklaşık 500 ul bir son hacme kadar konsantre edildi ve fazla boya flo membran iletirw-ile. Flow-through ve adımı tekrarlayın 5.8.1 en az üç kez atın. </li></ol></li><li> -80 ° C&#39;de küçük parçalar ve deposuna etiketlenmiş bir protein bölün. Tekrarlanan donma ve çözülme kaçının. </li></ol> 6. Kombine Optik Yakalama ve Tek-molekül Floresans Görüntüleme Deneyler <ol><li> Tampon kaplara tampon A içinde 1 ml ilave edilir ve bağlantı boruları yıkama ve akış hücresinin 200 mbar&#39;lık basınç altında uygulanır. DNA, burada ve aşağıdaki adımlardan in bağlayıcı proteinin difüzyonunu maksimize etmek için, A, düşük iyonik güçlü tamponla ikame edilebilir tampon. Not: Bu deneylerde, TBE 0.5x ikinci. </li><li> Akış düzgünlüğü kesebileceği hava kabarcıklarının varlığı, kontrol edin. Çıkış borusu üzerinde nazik bir fiske kalan kabarcıklarını çıkarmak için yardımcı olacaktır. </li><li> 20 mBar&#39;a basıncı azaltmak ve tüm kanallar ve tüpler hava kabarcıkları açık ve tampon tüm kanallarda benzer hızlarla akar doğrulayın. </li><li>300 ul son hacim olması için numunelerin hazırlanması: streptavidin kaplı polistiren taneleri 1.87 um; Bölüm 4 uyarınca her iki ekstremitelerde biyotinikasyon lineer DNA, 20UM; LacI tetramer 300 pM bölüm 5&#39;e göre ATTO532 etiketlenmiştir. </li><li> Aşağıdaki sırayla şırınga kapların biri her numune ekleyin: boncuk görüntüleme tampon tek (tampon A + oksijen tutucu sistemi) ve dördüncü kanal etiketli protein ile ikinci, üçüncü kanal birinci kanalın, DNA&#39;da konumlanmıştır. </li><li> 3 dakika için 200 mbar&#39;da akışını açın numuneler bir akış kanalı içine gelmesi izin vermek. Ardından 20 mBar&#39;a basıncı azaltmak. </li><li> Parlak bir alan aydınlatma altında ilk kanalını görüntüleme iken, iki optik cımbız açmak ve her tuzak içinde bir polistiren boncuk yakalamak. </li><li> Diğer boncuklar tuzaklarına düşmek önlemek için ikinci kanala hızlı hareket ettirin. DNA kanal varış boncuk akışının sonuna kolayca fark olduğuna dikkat edin. </li><li> O kullanmaNE AOD iki optik tuzak halkalar arasında akış uzatılmış DNA bağlanmasına olanak sağlamak için ileri ve geri diğer kordonun yakınında bir tuzak (boncuk) hareket eder. Bir DNA dambıl oluşturulduğunda, statik boncuk etkin ileri-geri hareket ettirildiği tuzak kordonun hareketini takip başlar. </li><li> Tampon kanala hızlı hareket ve tampon akışını kapatın. Tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak üzere bir kuvvet-uzama eğrisi analizi 4,23-25 ​​gerçekleştirin. Birden fazla molekülün mevcut olmadığı takdirde, ve adım atmak dambıl 6,7 yeniden başlar (örneğin, kuvvet-uzama eğrisinin faz yükselterek entalpi, DNA kontur uzunluğundan daha kısa bir uzunlukta oluşur). </li><li> Tek bir DNA dambıl elde edildikten sonra tekrar akışını açın ve protein kanala dumbbell taşıyın. DNA ile etiketlenmiş-LacI&#39;daki etkileşimini izlemek için geniş alan floresan mikroskobu geçin. Akışını kapatın ve satın alma başlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level.">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li><li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+mechanisms,+one+molecule+at+a+time.">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes &amp; development. 25, 1205-1231 (2011).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level.">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers.">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li><li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase.">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers.">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li><li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+optical+trapping,+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time.">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension.">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiona+in+the+trap:+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).</li><li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy:+enhanced+photobleaching+of+fluorophores.">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li><li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle.">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li><li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping.">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor,+single-molecule+fluorescence+imaging.">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li><li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA+with+optical+tweezers.">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li><li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization.">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li><li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers.">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Son on yılda, tek bir molekül manipülasyon ve görüntüleme teknikleri mekansal ve zamansal çözünürlük açısından büyük bir ilerleme gördük. Manipülasyon ve görüntüleme teknikleri kombinasyonu artık örneğin DNA, RNA ya da hücre iskeleti lifleri gibi tek bir canlı polimerin mekanik koşulların kontrolünü sağlayan güçlü araçlar tabanı ve aynı polimer ile etkileşen proteinlerin tek devamlı yer olduğunu . Tuzak polimerin mekanik koşullarını kontrol özellikle tercih edilir. Aslında, ...

Tek molekül (SM) teknikleri büyük ölçüde geleneksel, toplu çözüm ölçümler 1-3 bazı sınırlamaları aşmanın ihtiyaca cevap verecek son otuz yılda geliştirdik. Tek bir biyolojik moleküllerin manipülasyon Biyopolimerlerin 4 mekanik özelliklerini ölçmek ve protein-protein 5 ve protein-DNA etkileşimleri 6,7 mekanik parametrelerini kontrol etme fırsatı yaratmıştır. SM floresans saptama, diğer taraftan, lokalize ve nanometre hassasiyetle tek mölekülleri izleme olasılığına yol açan, in vitro ve in vivo olarak protein aktivitesini incelemek için son derece çok yönlü bir araç temsil eder. SM görüntü enstrüman nokta-yayılma-fonksiyonu takılması sayesinde, aslında, bir hassas sinyal-gürültü oranı (SNR) esas olarak ve yaklaşık bir nanometre 8,9 sınırı ulaşan lokalizasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bu metodolojiler güçlü buluyorummotor proteinlerinin aktif halde dinamikleri çalışma uygulamaları yanı sıra, DNA-bağlama proteinleri hedef arama altında yatan difüzyon prosesleri. Hedef bir DNA dizisinin bir fonksiyonu bekleme süresi olarak difüzyon katsayılarının hesaplanmasına ve doğru bir tek boyutlu difüzyon olaylar sırasında incelenmiş DNA uzunluk ölçme özelliği, bir protein-DNA etkileşim dinamikleri çalışma ve araştırma için güçlü bir araç temsil eder Belirli hedef arama mekanizmaları. Son zamanlarda, bu iki tekniğin bir kombinasyonu, örneğin (örneğin bir tel ya da aktin bir DNA molekülü) bir karşılıklı etkileşim eşinin enzimin ve bulma / lokalizasyonu biyolojik bir alt-tabakanın aynı anda işleme ortamı deney düzeneğinde, 10-14 yeni nesil (üretti miyozin ya da bir DNA-bağlama proteini). Bu tekniklerin avantajları başta böylece ena, tuzağa polimer üzerinde mekanik kontrol uygulamakla olasılığı dinlenmekuvvetleri veya momentleri karşı etkileşim dinamikleri çalışma bling. Ayrıca bu yöntem, klasik yöntemler SM, yani bir yüzey üzerinde çalışılan moleküllerin immobilizasyonu için ihtiyacı (cam slayt, ya da mikro-) ana sınırlamalarının kaçınarak yüzeyden uzak biyokimyasal reaksiyonları ölçülmesine imkan verir. İki tekli moleküller tekniklerin kombinasyonu özellikle mekanik stabilite ve 15 (özellikle nm hassasiyet ile yerelleştirme gerektiren) yeterli SNR şartlarından doğan, çeşitli teknik zorlukların üstesinden gerektirir. Optik cımbız, gürültü azaltma ile SM floresens bağlanması ve bindirme kızılötesi lazer 16 ve biyolojik komplekslerinin düzeneği ve deneysel ölçümler 11 yapılması için biyokimyasal tamponların denetimi ışıkla Özellikle zaman, büyük önem taşımaktadır. İşte, başarılı performans için yöntemleri tarifBir çift hapsi / SM Floresans yerelleştirme kurulum ölçümleri. Metodoloji, spesifik LacI bağlayıcı dizileri (yani, operatörler) ihtiva eden laktoz represör proteini (Lacl) floresan (Atto532) ile etiketlenmiş ve (iki optik cımbız arasında sıkışan) bir DNA molekülüne bağlanan olarak algılanan bir örnekle gösterilmiştir. Bu hedef arama işleminin kontum boyunca DNA ve difüzyona LacI bağlayıcı tespit yönteminin etkinliğini göstermektedir. Bu yöntem, DNA dizisi, DNA bağlama proteini, herhangi bir kombinasyonu gibi başka sistemler (mikrotübüllerin veya aktin filamentler ve onlarla etkileşim motor proteinlerinin) için de geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:151px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:203px;">Web Address</td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:115px;">elastomeric isolators</td>
			<td style="width:141px;">Newport</td>
			<td style="width:167px;">Newdamp</td>
			<td style="width:151px;">Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies</td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical isolator</td>
			<td style="width:141px;">Optics for Research</td>
			<td style="width:167px;">IO-3-YAG-VHP</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ofr.com/">http://www.ofr.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength</td>
			<td style="width:141px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:167px;">Millennia IR</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acousto-optic deflectors (AODs)</td>
			<td style="width:141px;">A&#38;A optoelectronic</td>
			<td style="width:167px;">DTS-XY 250</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.aaoptoelectronic.com/">http://www.aaoptoelectronic.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Direct Digital Synthesizers</td>
			<td style="width:141px;">Analog Devices</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.analog.com/">http://www.analog.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quadrant detector photodiodes</td>
			<td style="width:141px;">OSI optoelectronics</td>
			<td style="width:167px;">SPOT-15-YAG</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.osioptoelectronics.com/">http://www.osioptoelectronics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">DIO and FPGA board</td>
			<td style="width:141px;">National Instruments</td>
			<td style="width:167px;">NI-PCI-7830R</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ni.com/">http://www.ni.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Halogen lamp</td>
			<td style="width:141px;">Schott</td>
			<td style="width:167px;">KL 1500 LCD</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.schott.com/">http://www.schott.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Condenser</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:167px;">U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-global.com/en/">http://www.olympus-global.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Objective</td>
			<td style="width:141px;">Nikon</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:141px;">Coherent</td>
			<td style="width:167px;">Sapphire</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.coherent.com/">http://www.coherent.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CCD 200X and 2000X</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">XC-ST70 CE</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electron-multiplied CCD</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">C9100-13</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">piezo stage with nm-accuracy</td>
			<td style="width:141px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:167px;">P-527.2CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.physikinstrumente.com/">http://www.physikinstrumente.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Emission Filter</td>
			<td style="width:141px;">Chroma Technologies</td>
			<td style="width:167px;">600/100m</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.chroma.com/">http://www.chroma.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">silica beads (1.54 mm)</td>
			<td style="width:141px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:167px;">SS04N/5303</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bangslabs.com/">http://www.bangslabs.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">B4287</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pentyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">46022</td>
			<td style="width:151px;">Flammable liquid and vapour (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">nitrocellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8267-5EA</td>
			<td style="width:151px;">Flammable solid&#160; (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">heat block</td>
			<td style="width:141px;">MPM Instruments Srl</td>
			<td style="width:167px;">M502-HBD</td>
			<td style="width:151px;">with 2 removable blocks; preheated at 120&#176; C</td>
			<td><a href="http://www.mpminstruments.com/">http://www.mpminstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoPort assemblies</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">N-333</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">polyetheretherketone tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1535</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luer lock-tip syringes 2.5 mL</td>
			<td style="width:141px;">Terumo</td>
			<td style="width:167px;">SS 02LZ1</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.terumomedical.com/">http://www.terumomedical.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">shut-off valves&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">P-732</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">flangeless fittings&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">LT-111</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">fluorinated ethylene propylene tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1549</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:203px;">two computer-controlled solenoid valves</td>
			<td style="width:141px;">Clippard, Cincinnati, USA</td>
			<td style="width:167px;">ET-2-H-M5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.clippard.com/">http://www.clippard.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pressure transducer</td>
			<td style="width:141px;">Druck LTD</td>
			<td style="width:167px;">PTX 1400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotin-14-dCTP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:167px;">19518-018</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:141px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">EP0161</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.thermoscientificbio.com/">http://www.thermoscientificbio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO532 maleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">68499</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="157">
			<td height="157" style="height:157px;width:203px;">N,N-dimethylformamide (DMF)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">227056</td>
			<td style="width:151px;">Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C4706</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G4251</td>
			<td style="width:151px;">Acute toxicity, Oral (Category 5), H303</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10&#160;kDa cutoff spin concentrators</td>
			<td style="width:141px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:167px;">UFC901024</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.it/">http://www.merckmillipore.it/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 &#181;m</td>
			<td style="width:141px;">Spherotech, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">SVP-15-5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spherotech.com/">http://www.spherotech.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-dna interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Başarılı bir deneyde, tek bir (veya daha fazla) etiketli proteinler, DNA molekülü (Şekil 3A) boyunca / Unbinding ve / veya difüzyon bağlama monodimensional tabi tutulur. DNA molekülü boyunca protein lokalizasyonu DNA dizisinin bir fonksiyonu olarak kinetik parametrelerin ölçümü sağlar. 1D difüzyon neden tampon koşulları uygulandığında, bu difüzyon katsayısı D 1D örneğin protein yörüngeleri takip ve tespit etmek mümkündür. Tek bir nok...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions at JoVE.com

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Görüntüleme.  University of Florence.  Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir. 

Video: Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.