Name: optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Biz düzenleme ve yorumlar, ve Dr Dr. Mickey Yang teşekkür ederim. Yardım için Lei Zhang ve Bo Peng. Bu çalışma Bilim Ofisi, Enerji Birleşik Devletleri Bölümü Temel Enerji Bilimler Dairesi (yok. DE-AC02-05CH11231 sözleşme), Ulusal Kalp, Akciğer ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Kan Enstitüsü (tarafından desteklenen hayır . R01HL115153) ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Genel Sağlık Bilimleri Ulusal Enstitüsü (yok. R01GM104427).

% 1 Taze negatif boyama solüsyonu 1. Hazırlama (a / h) <ol><li> Karanlık bir odada ya da kutu içinde 100 ml deiyonize su ihtiva eden bir cam şişeye, 1 mg Uranil format (UF) toz koyun. </li><li> Bir karanlık oda / kutu içinde oda sıcaklığında çözelti O / N karıştırın. Çözelti isabet ışığı engellemek için alüminyum folyo ile çözelti şişe sarın. </li><li> Yavaşça 0.2 mikron ile (gözenek büyüklüğü) filtre, bir 5 ml şırıngaya monte solüsyonu filtre. Filtrelenen solüsyon birkaç alüminyum folyo kaplı Falcon tüpleri içine toplandı. Filtre şırınga, aynı zamanda ışığa maruz engellenmesi için alüminyum folyo ile sarılmış olması gerekir. </li><li> 1 ml şırınga üzerine monte 0.02 um (gözenek büyüklüğü) üzerinden tekrar filtre solüsyonu filtre. Süzülen çözelti 2 ml&#39;lik viyallere toplandı ve kısım edilmiştir. Şırıngalar ve flakonlar kullanımdan önce alüminyum folyo ile örtülmüştür. </li><li> Hemen bir sıvı nitrojen dolu kabın içine şişeleri daldırarak uzun saplı forseps kullanarak tümbölen şişeleri Freezesonra, çözelti süzülmüştür. </li><li> Depolama ve gelecekteki kullanım için -80 ° C derin dondurucu içine dondurulmuş şişeleri aktarın. </li></ol> Negatif Boyama Workstation ve Kuluçka Workstation 2. Hazırlık <ol><li> Oda sıcaklığında ayarlanmış bir su banyosu içinde,% 1 UF çözeltisinin bir şişesinin çözülme. Alüminyum folyo ışık maruz kalmasını önlemek için şişenin etrafına sarılı kalır emin olun. </li><li> Tamamen 1 ml&#39;lik bir enjektör 0.02 um filtre ile monte sarılmış bir alüminyum folyo ile çözülmüş sonra ne solüsyonu filtre. Şişeyi sarılmış yeni bir alüminyum folyo içine süzüldü çözüm toplamak ve kullanım için bekleyen bir kap kaplı buz kutusunun içine buz üzerine yerleştirdi. </li><li> Boş bir protein kristalleşme plaka yüzeyine bir ~ 8 inç uzunluğunda Parafilm Ön iterek parmağı ile çözüm plakaları olun. Bu ~ 5 mm çapında bir dairesel levha satır üretecektir. Bir buz içinde buz yassı bir yüzeyi üzerinde Parafilm ™ levhalar içeren, her satır yerine 6 plakaları yapmaker bir kapak, boyama iş istasyonu olarak. </li><li> Pipet ~ 35 ul her satırda kalan üç plakaların her üzerine deiyonize su ve pipet ~ 35 ul her satırda sağ üç tabak için UF çözüm süzülür. Proteinler boyamadan önce ışığa maruz kalmasını önlemek için bir kapak ile boyama iş istasyonu örtün. </li><li> Buz ile boş bir kutu yarım doldurarak bir EM ızgara inkübasyon istasyonu hazırlayın ve bir destek tabanı üzerine monte edilebilir bir askı yanına yapıştırılır. Cımbız &#39;ipuçları yakındaki buz yüzeyi olduğu askı örnek cımbız, yerleştirin. Yarım kutu dudak yüksekliği ile cımbız &#39;ipuçlarını kapsayacaktır. Bir kuluçka istasyonu yapmak için ideal bir buz kutusu boş bir pipet uçları kabı kullanıyor. </li></ol> 3. OPN&#39;ler Operasyon <ol><li> Ince karbon film 10 sn için 300 örgü bakır EM ızgaraları kaplı Glow-deşarj. </li><li> Cımbız ile bir ızgara Pick up ve buz üzerinde 45 ° eğim ve 1 inç ızgara tutarak askının içine cımbız kancaKuluçka istasyon iç yüzeyi. </li><li> ~ Nihai protein konsantrasyonunda tekrar ~ 0.01 ila 0.005 mg / ml Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi (DBP) ile, protein örnek seyreltilir. Depozit ~ 4 ul hemen EM ızgara karbon tarafındaki seyreltildikten sonra numunenin seyreltilmiştir. (Protein DPBS hassas ise, DPBS bir tampona değiştirilebilir) </li><li> Kuluçka istasyonu içinde ~ 1 dakika için EM ızgaraların üzerine örnek inkübe. </li><li> Hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile ızgara kenarına temas yoluyla fazla çözeltiyi çıkarınız. </li><li> Fazla çözelti EM gridine çıkarıldı hemen sonra Parafilm tabakanın üzerine saf su yüzeyinin yaklaşık ilk damla (~ 35 ul) hızlı bir şekilde ızgara dokunun. Sonra filtre kağıdı ile derhal fazla suyu almak. </li><li> Parafilm kalan iki su damlacıklarının EM ızgara yıkayarak iki kez başka adımı tekrarlayın 3.6 (3.6 Adım ve numune suyun çok hassas ise 3.7 atlanabilir). </li><li> EM GRI Floathemen EM gridine fazla suyun sonra UF çözeltisi sağ ilk damla yüzeyi üzerinde uzaklaştırılmıştır d. Ve daha sonra 10 saniye boyunca inkübe edilir. UF çözeltinin yüzeyinde yüzen kılavuz önce 3 saniye içinde su ile yıkama işlemlerini tamamlamak için emin olun. Yıkama süresi daha kısa, daha kaliteli olacak. </li><li> - 3 kez ~ 2 için bir filtre kağıdının içine ipuçlarını nüfuz ederek cımbız temizleyin. </li><li> Filtre kağıdı ile ızgara kenarına temas yoluyla ızgara üzerinde aşırı çözüm çıkarın ve sonra UF ikinci damla ızgara yüzer. </li><li> İkinci damlacık adım 3.10 yukarıda devam edin. </li><li> UF çözeltisi damla üstünde üçüncü ızgara Float ve yaklaşık 1 dakika boyunca boyama istasyonu kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı adım: 3.6 de tarif edildiği gibi bir su üzerine hızlı bir şekilde ızgara yıkayın. Bu ek bir adım yüklenen ücretsiz altın parçacıkları veya leke arka plan üzerinde içeren örnekleri yararlanacaktır. </li><li> Inci filtre kağıdı dokunarak fazla çözeltiyi almak(karbon tarafının aksi) E tüm kılavuz arka. Sağ filtre kağıdına bir emici çözelti gözlemleyerek, oda sıcaklığında bir azot gazı akışı altında hafif bir ızgara kurutun. </li><li> Bir petri çanağı içine bir filtre kağıdı tabakası üzerine ızgara yerleştirin ve oda sıcaklığına altında en az 30 dakika süre ile kurumaya bir kapakla kısmen çanak kapsamaktadır. Bazı örneklerde, bir saat süre ile pişirme, 40 ° C inkübatör kılavuz getirin. </li><li> Inceleyerek gelecekteki EM için bir EM ızgara kutusu içine ızgara saklayın. </li></ol> Incelenmesi 4. EM <ol><li> Düzgün ızgara üzerinde küçük proteinlerin EM sınavdan önce TEM hizalayın. <ol><li> TEM düzgün hizalanmış olup olmadığını belirlemek için bir amorf karbon film güç spektrumu en yüksek görünür Thon-halkasının çözünürlüğünü kontrol edin. TEM birçok farklı kullanıcılar tarafından paylaşılan olduğundan, TEM genellikle düzgün hizalanmış değildi. </li><li> Dikkatli bir şekilde hizalama conditio ayarlamak için numunenin karbon film alanı güç spektrumunun kontrolMakinenin: n. Yüksek görünür Rica-halkaları hedeflenen çözünürlükten daha iyidir. Not: 120 kV yüksek gerilim altında işletilen bir LaB6 filaman TEM uygun bir uyum bir örnek olarak, en fazla 20 Rica-ring, görselleştirilebilir eder, karşılık gelen 5,0 Â çözünürlük daha iyi olabilir. Bu Rica halkası 1.6 um&#39;lik bir defokusta ~ 20,4 e / A2 (Şekil 5) bir dozun altında görüntülenmiştir şekilsiz karbon film Fourier transferi ile elde edilmiştir. NOT: Yüksek çözünürlüklü Thon-halkasının Gözlem gerekli bir şart değil, düzgün hizalama için yeterli bir durumdur. Aslında, yüksek çözünürlükte resimler elde etmek için, pek çok diğer parametreleri, örnek kalite, radyasyonun yol açtığı zarar ve şarj sürüklenen hem de aydınlatma doz oranı olarak da önemlidir. </li></ol></li><li> Bir ideal lekeli alana küçük proteinlerin görüntülenmesi için yakın Scherzer&#39;in odak geri bulanıklaştırma getirin. </li><li> Imag için &quot;clear&quot; alanında araör. Bir ideal lekeli alanı genellikle leke kalınlığı normal eşit karbon kaplı ızgara (Şekil 6) üzerine dağıtılmış olmadığından ızgara üzerinde bir &quot;clear&quot; alanı gibi görünen bir kalın leke alanının kenarına yakın yer almaktadır. Genellikle düşük bir büyütme (&lt;100x) ilk görüntüleme için yakınlaştırma önce bu bulutlu alanları bulmak için yardımcı oldu. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Geleneksel NS teknikleriyle kıyaslandığında OPN&#39;ler rouleaux eserler (Şekil 1 ve 9), güvenilir ve makul yüksek çözünürlük (~ 1 nm) küçük proteinlerin yapısal ayrıntıları veren (Şekil 2) önleyebilir. Krio-EM ile karşılaştırıldığında, yüksek bir verim OPN&#39;ler yöntem sağlar ve protein ve protein-protein etkileşimleri 6 çeşitli inceleyebilir. Bununla birlikte, yine de OPN&#39;ler dezavantajları vardır. Geleneksel NS ile karşılaştırıldığında, OPN&#39;ler gerektirir: numune hazırlama i) daha karmaşık adımlar; ii) bir radyoaktif madde, UF kullanarak; iii) nedeniyle nedeniyle ışık duyarlılığı UF leke kısa gücüne taze leke tutmak; iv) çöktürme UF çözelti, -80 ° C&#39;de saklanır ve kullanılmadan önce çözünmesi gerekmektedir gerekir önlemek; v) ve nihayet tüm UF tehlikeli atık olarak ele alınması gerekir. Cryo-EM karşılaştırıldığında, OPN&#39;ler nispeten daha düşük çözünürlüklü görüntüleri ve herhangi henüz keşfedilmiş değil dışlayıcı hiçbir garanti sağlarGelecekte. Lipoprotein rulo oluşumu NS işlem usul etkisi Ile damla damla 16 ve yıkama prosedürlerinde 29, 55 karıştırılması için muayene 16,29-36,55 proteinlerinin hazırlanması için yöntemler 50 NS protokoller arasında üç ana grupta sınıflandırılabilir. i) karıştırma protokolü belli bir oranda, leke ve protein örneğinin ön karıştırma gerektirir ve son olarak da EM incelemeleri 55 hava kurutma işleminden önce filtre kağıdı ile fazla alınarak, bir ızgara üzerinde kaplı karbon filmi üzerine karışık çözeltinin uygulanması aşamaları ile. ii) açılan-by-damla protokol sonradan leke bir damla (~ 4 ul) uygulamasından önce fazla numune çözüm çıkarmadan, ~ 1 dakika boyunca karbon icar oturup kaplı bir EM ızgara doğrudan (~ 4 ul) örnek damla uygulayarak içerir Izgara aynı tarafında çözeltisi. Inkübasyondan ~ 1 dakika sonra, excès kaldırmatemiz filtre kağıdı ile temas yoluyla s leke, nihayet hava kurutma 16,56-58 için göndererek. iii) yıkama protokolü (Şekil 7) daha sonra doğru filtre kağıdı ile 3,29,30 Solüsyonun aşırı olan miktarı her zaman çıkarılmasından sonra, iyonu giderilmiş su ile üç kez yıkanarak, 1 dakika boyunca karbon ile kaplanmış bir EM ızgara numune çözeltisi uygulama gerektirir. OPN&#39;ler protokolü bu yıkama prosedürü modifiye edilmiştir. NS leke türleri ve lipoprotein rouleaux oluşumu üzerine etkileri NS nedeniyle ağır metal lekeleri için güçlü elektron saçılması proteinlerden 17-20,59 gelen kontrast sağlar. NS örnekleri ayrıca daha fazla radyasyon dozları acı ve keskin bir negatif kontrast 8,9,60 protein özelliklerini artırabilirsiniz. Ağır metallerin lekeleri gibi sınıflandırılabilir: fosfotungstik asit (PTA) 16 de dahil olmak üzere, anyonik, metilamin tungstat 14 ve 61 silikon tungstat; ve katyonBöyle Uranil asetat (UA) 62, UF 3,29,30, ve Uranil nitrat (BM) 63 gibi ic. En yaygın olarak kullanılan anyonik NS lekelerin bir PTA 33,64-67 olduğunu. 7.5 - FTA ise tipik olarak yaklaşık 7.0 bir pH değerine kullanılan bir Hetero-poli asit, bir. PTA da pozitif boyanma 3,16,68 için kullanılabilir. PTA olumsuz ücretleri hem lipoprotein ve lipozom yüzeylerde olumlu POPC gibi, baş gruplarını ücret doymamış yağların, elektrostatik etkileşimler aracılık edebilir. PTA hatta normal tampon tuzluluk 29,30 (Şekil 1) altında, bu etkileşimin 29,30 vasıtasıyla bir rulo oluşumuna neden olabilir. Bu UA, UF ve BM gibi Uranil lekeler, özellikle sık biyolojik örneklerin 62,69,70 çeşitli NS için kullanılan katyonik ağır metaller lekeleri ve UA alternatif seçenekler vardır. Deneyler, örneğin UF POPC gibi doymamış yağ asidi lipidler içeren lipoproteinlerin hiç bir rulo neden bulunamadı. Bununla birlikte, yine de UF roule indükleyebilirBu dimiristoil fosfatidilkolin (DMPC) ve 1-heksadekanoil-2-oktadekanol-sn-glisero-3-fosfokolin (PSPC) gibi doymuş yağlı asit lipidler içeren lipoprotein aux oluşumu. Bu etkileşimin ayrıntılı mekanizması bilinmemektedir. UA / UF / BM düşük pH değerlerinde tüm iş 3,5-4,6 arasında değişen olabilir. Bu gibi düşük bir pH değeri pH 14,71 duyarlı olan belirli biyolojik makro moleküller için uygun olmayabilir. İlginçtir, UA / UF bilinmeyen bir mekanizma 72 ile birkaç milisaniye içinde protein yapısını çözebilirsiniz. PTA farklı olarak, UA / UF bir asit tuzuna daha fazla benzemektedir. (: 0.3 nm, BM: ~ 0.5 nm UF) 3,74 UF bildirildi hangi, UF ve BM lekeleri UA daha küçük tane boyutları var, UA 73 daha iyi sonuçlar sağlayabilir. UF uygulayarak negatif leke reaktifi olarak kullanıldığında ilginç bir örneği, küçük bir proteini (53 kDa KETP) ikincil yapı gibi bilgileri doğrudan ham mikrograflar görselleştirilebilirDaha önce kriyo-pozitif-boyanma (cryo-PS) yöntemi (Şekil 8) 6 bildirdi. Kriyo-PS, lekeli örnek l&#39;de ikincil yapısal çöküşüne neden olabilir OPN&#39;ler protokolü olarak kriyo-EM numune hazırlama prosedürü yerine kurutulması prosedürüyle dondurulmuş flaş oldu. Kriyo-PS küçük proteinlerle 75 yüksek kontrast ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir yöntemdir. Cryo-PS görüntüleri bildirdi cryo-NS protokol 22&#39;den kıyaslandığında kontrast tersine, fakat geleneksel cryo-EM görüntüleri gelenler için tutarlı görüntü kontrastını sahip olduğundan dolayı, böylece cryo-PS yöntemi seçildi. Cryo-PS görüntüleri boyama reaktif, Uranil format, boyama sadece dış yüzey yapısını görselleştirmek ki geleneksel bakış açısına meydan okuyan, moleküler yüzeye nüfuz olduğunu göstermektedir. Uranil format moleküler yüzeye nüfuz nasıl mekanizması bilinmemektedir. Bir olasılık Uranil katyon mevcut bir protein karboksil gruplarına bağlanır ve böylece olmasıdırcamsı buz çevreleyen ve böylece pozitif bir leke olarak hareket eden protein ve Uranil gruplarının boyama daha düşük bir yoğunluğa sahiptir. Cryo-PS yöntemi X-ışını kristalografisi 76-78 faz sorunu çözmek için ortak bir yaklaşım oldu birden isomorf yedek (MIR) yöntemine benzer. MIR olarak, kristal gibi, kendisine ait yerel biçimiyle izomorfik bir formunu elde etmek için, uranyum içeren bir ağır atom çözeltisi ile ıslatılır. Ağır atomunun eklenmesinin bazen kristal oluşumu ya da birim hücre boyutları ise fakat kristal yapı tayini 76-78 arasında ek bilgi sağlar değildir. UF küçük tahıl yararlanarak, cryo-PS özellikle neredeyse tüm proteinler çözümü doğal olarak, dinamik ve heterojen olduğu göz önüne alındığında, protein yapı çalışmaları için önemli olan tek bir proteinin, yüksek kontrast ve yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayabilir. Bu cryo-PS yönteminin doğrulanması için, EM alanının herhangi bir kör test için açın. </p&gt; Lipoproteinlerde rouleaux oluşumu üzerine tuz konsantrasyonu etkiler PTA negatif boyama geleneksel bir reaktif kullanılarak, gözlenen bir rulo oluşması daha olası yerine protein etkileşiminin lipit etkileşimi ile ilgilidir. Önemli bir tuzluluk (0,5 M NaCl), orta tuzluluk (0.25 M NaCI) nispeten zayıf tuzluluk (0.1 M NaCI) ve saf su (Şekil 9) göre hazırlanmıştır POPC, lipozom keseciklerinin örnekleri görüntüleme, elektron mikroskop rulo oluşumu olmadığını göstermek tuz konsantrasyonu (- D Şekil 9A) korelasyon. UF negatif boyama reaktif kullanılarak, hiç bir rulo hızlı bir şekilde boyanması, gerekli olan hemen önce, tuz konsantrasyonunu azaltmak için yıkama işlemini göstermektedir, POPC lipozom vezikül örnek 30 (Şekil 2 lt) içinde görülebilir, fakat edildi ilgili POPC içinde bir rulo önlemek için yeterli değildir, bağımsız olarak adım örnekler. TEM görüntüleme küçük protein yakın bir Scherzer&#39;in odak koşul gerektirir. Yüksek çözünürlükte küçük proteinlerin Başarılı TEM görüntüleme iki kritik durum, uygun bir ışın hizalama ve yakın bir Scherzer&#39;in odak edinim durumunu gerektirir. i) Uygun bir ışın hizalama nispeten yüksek flulaştırmayla kapsamında edinilen bir karbon film görüntünün Fourier transferi görünür Thon halkalar (güç spektrumu) sayısı ile karar olabilir. Kirişin daha iyi hizalama durumu, daha Rica halkalar görülebilir ve yakın-Scherzer odak altında ölçülebilir .. ii) sahip olmak görüntü bir başka önemli bir durumdur. Biyolojik numune görüntü kontrastını 79 artırabilir - (2 mikron ve daha 1), biyolojik örneklerin görüntülenmesi için geleneksel bir standart strateji genellikle yüksek bulanıklaştırma kullanır. Bu strateji, hangi sıklıkla, sert malzemelerin atomik çözünürlükte yapısını görüntüleme için tipik stratejisi farklıdır önemliyakın bir Scherzer&#39;in odak (~ 50 nm bulanıklaştırma) kullanır. , Daha yüksek bir bulanıklaştırma biyolojik numune kontrastı güçlendirmek rağmen, yüksek çözünürlüklü sinyalleri kısmen ortadan kaldırılabilir. Bunun bir sonucu olarak, yüksek çözünürlüklü bir sinyalin daha yüksek bir odaksızlık suç görüntüleme durumda daha düşük olacaktır. Bunun nedeni, bir TEM görüntüsü örnek yapının evrişim ve gösterge CTF olduğu yönündedir. CTF eğrisi sık sık yüksek sıklıkta sıfır geçiş salınım amplitüdü, frekans karşı bir salınım eğrisidir. Her zaman CTF sıfıra karşısında, bu özel frekanstaki örnek yapısal sinyal (sıfır kere herhangi bir sayı sıfır olacaktır) ortadan kalkacaktır zaman. Bu frekansta elendiği sinyal herhangi bir CTF düzeltme algoritması (yerine orijinal yapısal sinyalin herhangi rastgele bir sayı olabilir bir sıfır bölü sıfır) tarafından kurtarıldı asla. Daha yüksek bir odaksızlık görüntüleme altında, CTF, daha agresif ve böylece CTF bir sonucu olarak, daha sık olarak sıfır genliği geçer salınmadığıbelirli frekanslarda daha fazla sayıda yapısal sinyalleri ortadan kalkacaktır. Elimine edilir daha sinyaller, daha az suç görüntü olacaktır. Özellikle, görüntünün suç kurtarılan veya herhangi bir CTF düzeltme tarafından düzeltilemez. Bununla birlikte, farklı odak dışı ile elde edilen görüntü tamamlanmamış bir sayısı daha bir atomik çözünürlükte 9-12 elde edilebildiği bir ortalama alma yöntemi vasıtasıyla, örnek yapının elde tamamlanmış bir yapısal sinyaline birbirlerine boşlukları doldurmak için kullanılabilir. Ortalama yöntemi, bazı çok simetrik proteinler ve yapısal olarak ilgili sert proteinlerin yapısını elde etmek için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak yine de özellikle antikorlar ve HDL gibi yapısal dinamikleri ve esnek proteinler, için, küçük ve asimetrik proteinlerin yapısal çalışmada zorlu kalır. Ortalama protein parçacıklarının yapısı ve biçimi, ancak di özdeş olduğu varsayımına dayanmaktadırfferent yönlerde Ancak birçok protein çözeltisi içinde termodinamik dalgalanma geçtiği bilinmektedir. Daha önce protein termodinamik dalgalanma dalgalanmaları bilmeden ortalama yöntemi uygulayarak, ortalama yapısı genellikle etki 10,80 veya cryo-EM rekonstrüksiyonlarında çözünürlükte 81 yerel varyasyon eksik neden olabilir. Tek bir proteinin, küçük protein 3 boyutlu rekonstrüksiyon ulaşmada başarı gibi 53 kDa CETP ve 3D yapısı gibi 160 kDa lgG1 antikor, uygun bir hizalama koşul altında yakın Scherzer&#39;in odak görüntüleme durumu kullanarak yararlanır. Görüntü kontrastı yakın-Scherzer odak görüntülerde düşük görünse de, kontrast, kolayca arka yüksek frekanslı sesleri azaltmak için bir düşük geçiş filtresi uygulayarak artırılabilir. Biz inanıyoruz, yakın-Scherzer&#39;in görüntüler maksimum yapısal sinyallerini taşıyan odak, ve parçacık uyum doğruluğunu artırmak ve kate artırabilirtek parçacık 3D rekonstrüksiyon ve bireysel parçacık elektron tomografi rekonstrüksiyonu Verimliliği.

Protein işlevini anlama protein yapısının bilinmesini gerektirir. 200 kDa - Yapısal tayini, moleküler kütleleri 40 içinde olan proteinler için meydan okuyor. X-ışını kristalografisi, protein kristalleştirme ile sınırlıdır; kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) molekül kütleleri daha az olan, her ikisi de görüntü elde etme ve küçük proteinlerin üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon, zorluk vardır ise nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, 40 KDa daha az moleküler kitlelere sınırlıdır 200 kDa&#39;dan. Özellikle, en fazla% 50 protein, 40 aralığında bir moleküler kütleye sahiptir - mevcut yöntemler bu boyutta proteinleri meydan okuyan gibi, 200 kDa 1,2, yeni bir yöntem gereklidir. En transmisyon elektron mikroskopları (dardı) atomik çözünürlükte, yani daha iyi 3 Å çözünürlük yeteneğine sahip olmasına rağmen, bir biyolojik örneklerden bile yakın bir nanometre çözünürlük yapıya ulaşmak yerine challen olduğunuretlendirici 7. Radyasyon hasarı, düşük kontrastlı, yapısal sapmalar yanı sıra dehidrasyon gibi eserler tüm yüksek-çözünürlüklü TEM görüntüleme 3,8 engellemektedir. Çeşitli TEM yaklaşımlar arasında, cryo-EM yakın fizyolojik koşullar altında 9-12 derece simetrik büyük moleküllerin atomik çözünürlükte yapıları başarmak için gelişmiş ve kesme kenarı yöntemdir. Krio-EM numune daha sonra, sıvı azot veya helyum sıcaklık 13 olarak çok düşük sıcaklık derecelerinde görüntülü camsı buz içinde gömme makromolekülleri, örnek çözeltinin dondurulması flaş hazırlanır. Bu örnekler hiçbir eserler sunmak ve yapıda 8-12 neredeyse yerli şunlardır cryo-EM avantajlıdır. Ek cihazlar takılı veya cryo-EM yeteneği için bir standart TEM araç yükseltmek için satın gerekmektedir: i) cryo-EM dezavantajları var. Cihazlar şunlardır: Anti-contaminator cryo tutucu, düşük doz şekli yazılım ve düşük doz sensitif CCD kamera, bu cihazların fiyatları TEM enstrümanın kendi fiyat çok daha düşük olmasına rağmen; ii) cryo-EM operasyon NS operasyon daha uzun zamana ihtiyacı var. Cryo-EM örneği incelenirken sık sık NS daha TEM enstrüman örneklerini hazırlamak ve işletmek için daha uzun zaman gerektirir cryo-EM gibi ek zorluklar, adresleme gerektirir çünkü: sıvı azot sıcaklığı çalışma, örnek şarj, görüntüleme sürüklenme, sıcaklık değişimleri, düşük doz Model çalışması, örnek radyasyon duyarlılıkları ve dozaj kısıtlamaları. Birkaç cryo-EM görüntülerin kesinlikle dengeli bir sıcaklık gradyanı ile hazırlanan cihaz ile cryo-EM uzmanları tarafından 1 saat veya daha az elde edilebilir, ancak bu ekstra adımlar, NS veri toplama oranla yararlı verilerin elde hızını yavaşlatacaktır; iii) kullanıcıların görüntüleme proc, cryo-EM ızgaraları, düşük doz operasyon, doz ölçümü dondurma, sıvı azot taşıma şarj taşıma, sürüklenen ve bilgi gibi ek eğitim gerektirmektediressing; Farklı TEM oturumları sırasında aynı cryo-numune için tekrarlanabilir görüntüleme iv) eksikliği. Cryo-EM örnekleri kolayca TEM enstrüman için / örnek yükleme ve boşaltma sırasında buz kirlenme zarar görür. Bu hasar numuneler izole edilmesi zor olan, özellikle bir husustur / 14 saflaştırılmış; v) küçük proteinler (&lt;200 kDa molekül kütlesi) meydan çünkü kontrast düşük yansıması için; vi) cryo-EM görüntülerin düşük kontrastlı ve yüksek gürültü özellikle yapısal esnek olan proteinler için protein yönelimleri, konformasyonlarına ve sınıflandırılması, belirlenmesi genel doğruluk azalan, bu nedenle, görüntüler arasında çapraz korelasyon değerini azaltır ve doğal çözelti içinde dalgalanma 4,5. Negatif boyama (NS), herhangi bir laboratuvar, herhangi bir tür EM ile protein yapısını incelemek için kullanabileceği nispeten &quot;eski&quot; ve tarihsel yöntemdir. Brenner ve Horne birinci kavram o gelişmişf virüsleri 15 incelenmesi için bir buçuk asır önce negatif boyama. NS şarj ağır metal tuzları ile örnek kaplanması ile gerçekleştirilir. Bu kavram aslında ışık mikroskobu ve olumsuz imajını 16 görüntülerken daha yüksek görüntü kontrastı sağlayan, örneklerin etrafında karanlığı veren bir leke solüsyonu içine bakterilerin gömme uygulama geliyor. Bahsedilen ağır metal iyonları, proteinlerin 17-20 daha az yoğun atomuna göre elektron dağıtmak için daha büyük bir yeteneğe sahip ve kaplama ağır metal lekesi olan gelişmiş kontrast ile daha yüksek bir doz sınırlama olanak tanıdığından. NS örnek kolay parçacık yönelim belirleme ve cryo-EM görüntülerin daha 3 boyutlu rekonstrüksiyon için yüksek kontrastlı görüntüler 8 sağlayabilir. Geleneksel NS, ne yazık ki, düzleştirme ve istifleme 8,21,22, genel agregasyonu, moleküler ayrılma gibi leke-protein etkileşimleri, neden eserler üretebilir. Lipit ilgili koruma içinlipoproteinler 16,23-30 gibi ins, yığılmış ve bir Rouleaux bir araya (Şekil 1) 31-36 paketlenir parçacıkların ortak bir artefakt sonuçları. Bu nondenaturing poliakrilamid gradyan jel elektroforezi gibi birçok lipoprotein çalışmaları, cryo-EM tüm göstermek lipoprotein partikülleri izole edilmiş parçacıklar yerine doğal olarak yığılmış olan kütle spektrometrisi 39,41 ve küçük açı X-ışını difraksiyon bulguları, 42, 13,29,37-40 çalışmaları birlikte bir rulo 21,29,30,35,42-45 oluşturulması. Geleneksel NS tarafından bir rulo oluşumunun gözlenmesi muhtemelen standart protokole NS çözeltisi 13,29,30,46-49 ve hassasiyet, yapısal olarak esnek apolipoproteinler (APO) ve fosfolipidlerin oluşan lipoproteinler arasında dinamik etkileşimin yol açtığına. Bu objeyi tanımlamak için, apolipoprotein E4 (ApoE4) palmitoil-oleoylphosphatidylcholine (POPC) vb, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) bir numunesi, bir deney numunesinde kriyo olarak kullanılmıştırKoşulları bir dizi altında hazırlanmış NS örneklerin taranması bir artifaktsız standardı 29, EM görüntüler. NS Krio-EM ile elde edilen parçacık boyut ve şekillerde karşılaştırarak, boyama maddesi ve tuz konsantrasyonunun spesifik bir tipi, iyi bilinen bir rulo durumu meydana iki temel parametre olduğu bulunmuştur. Bu durumda, optimize edilmiş bir negatif boyama (OPN) protokolü bildirilmiştir. OPN&#39;ler tarafından, ApoE4 HDL iyi bilinen bir olgudur OPN&#39;ler bir rulo (Şekil 2A) ile ayırt edildi. İstatistiksel analiz cryo-EM gelenler karşılaştırıldığında OPN&#39;ler verimlerle boyutu ve şekli çok benzer görüntüleri az (% 5 sapma) gösterdi, ancak kontrast elendi. OPN&#39;ler arasında doğrulamaları neredeyse tüm sınıfları ya da apoA-I 7,8 nm (Şekil 2B), 8.4 nm gibi lipoprotein örneklerinin 6,29,30,50,51, alt-sınıfı bir rulo artefaktının ortadan kaldırılması incelenerek yapılmıştır (Şekil 2C) , 9.6 nm discoidal HDL (rHDL) (Şekil 2B), 9.3 nm küresel rHDL (Şekil 2E), insan plazma HDL (Şekil 2F), lipit serbest apoA-I (Şekil 2G), plazma HDL (Şekil 2H), düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL yeniden ) (Şekil 2I), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL) (Şekil 2J), çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) (Şekil 2K) ve POPC lipozom (Şekil 2 L) 30. (Şekil 4A ve B) 4,5,29 6,29 ve oldukça esnek 160 kDa&#39;lık bir IgG antikorunu - İlave doğrulamaları küçük ve asimetrik proteinleri görüntüleme 53 kDa, kolesteril ester transfer protein (CETP) (Cı Şekil 3A) verilen gerçekleştirildi , 52, ve iki yapısal olarak iyi bilinen proteinler, GroEL ve proteazom (Şekil 2 M ve N). C herhangi bir ek doğrulama gerektirenolleagues, bu OPN&#39;ler yöntem herhangi bir kör test açıktır. OPN&#39;ler yüksek verimli bir protokol, CETP, lipoproteinlerin 4 sınıflarına yeniden birleştirildi HDL etkileşim de dahil olmak üzere, bir dizi şartlar altında değişik proteinlerin (örneğin bağlanma edildi CETP gibi küçük proteinlerin örnekleri, yüzlerce incelenmesi ile, protein mekanizma üzerinde çalışmak için kullanılan gibi, HDL, LDL ve VLDL, / 3 dakika, 20 dakika, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 8 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat dahil olmak üzere 9 inkübasyon süreleri altında 2 antikorları, H300 ve N13, olmadan dahil olmak üzere, 4 ve 3 dilüsyonlar, yani 0.1 mg / ml, 0.01 mg / ml ve 0.001 mg / ml, ve ek kontrol örnekleri, 4 altındaki mol oranları, yani, 1: 0.5, 1: 1: 1, 2, 1 farklı kişiler tarafından Yukarıdaki deneylerin) 6,29 üçlü testleri ile, tek başına, CETP, tek başına, LDL ve VLDL,. OPN&#39;ler CETP&#39;nin görüntüleri makul ince yapı detayları ile yüksek kontrastlı görüntüler sağlanan; bize izin başarıyla 53 kDa sma bir 3D yoğunluk haritası yenidenll protein CETP (Şekil 3D - F) tek parçacık yeniden tarafından. Bize ara madde çözünürlüğü tek bir (± 1.5 mil) (bir nesne, bir ortalama) IgG antikoru 3D yapısı elde etmek için izin - Ayrıca, yüksek kontrastlı OPN&#39;ler görsel bize bağımsız bir protein (C Şekil 4A) için yeterli bir sinyal sağlamak 5 - bireysel parçacık elektron tomografi (Ipet) yöntemi (J Şekil 4E) aracılığıyla. Ipet yeniden strateji, yöntem, adım adım süreçleri ve yapısal varyasyon analizi ayrıntılı bir açıklama, daha önce 4 bildirilmiştir. YouTube&#39;a 5 yüklenen tarafından ham görüntüleri ve ara sonuçları, 3D yoğunluk haritası ve yapısal yerleştirme dahil Ipet antikor rekonstrüksiyon prosedürleri hakkında bir film halka da kullanılabilir. Farklı bireysel antikor parçacıklardan 3D rekonstrüksiyon karşılaştırılması protein dinamikleri ve c ortaya olabilirkimyasal reaksiyonlar sırasında 4,5 onformational değişir. KDa 1,2 200, bu küçük proteinlerin görüntülenmesinde başarı OPN&#39;ler yöntem, küçük ve asimetrik yapısal belirlemeler ve mekanizma keşifler doğru geleneksel EM sınırı itmek için yararlı bir araç olduğunu kanıtladığı - proteinlerin% 50 üzerinde 40 arasında değişen moleküler kütleye sahip olduğunu düşünüyor . Bu nedenle, ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Stain: Uranyl Formate</td><td>The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td><td>02545-AA</td><td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td></tr><tr><td>Syringe: 1 ml NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td></tr><tr><td>Syringe filter: 0.2 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-487</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td></tr><tr><td>Syringe filter: 0.02 &amp;mu;m filter (Anotop 10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td></tr><tr><td>Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>Tweezer: Dumont Tweezer L5</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>72882-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td><td>EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td></tr><tr><td>Filter Paper: Grade 1 circles</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td></td><td></td><td>Any type</td></tr><tr><td>Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&amp;micro;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Glow Discharge Unit</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td></tr><tr><td>Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&amp;micro;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-524</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td></tr><tr><td>Filter Tips: VWR Signature 200 &amp;micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>37001-528</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F161201 and F167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

200 kDa - proteinlerin yapısal belirlenmesi yerine 40 arasında, molekül kütlesi proteinler için meydan okuyor. Doğal proteinlerin yarıdan fazlası 40 arasında bir moleküler kütleye sahip olduğu göz önüne alındığında - 200 kDa 1,2, bir nanometre çözünürlük kapasitesi ile sağlam ve yüksek verimli bir yöntem gereklidir. Negatif boyama (NS) elektron mikroskopisi (EM) sık sık protein yapısı ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için araştırma laboratuarlarında kullanılan bir, kolay, hızlı ve nicel bir yaklaşımdır. Ne yazık ki, geleneksel NS protokolleri çoğunlukla, özellikle genelde rouleaux eserler sunan oluşturacak lipoproteinler ile, proteinler yapısal eserler üretmek. Bir standart olarak kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) için lipoprotein görüntüleri kullanarak NS numune hazırlama şartlarında önemli parametreler son tarandı ve optimize NS protokolü (OPN), değiştirilmiş bir protokol 3 NS ​​olarak bildirildi. Ro gibi eserleruleaux ölçüde ek (1 nm yakınında) oldukça yüksek çözünürlük ile birlikte yüksek kontrast küçük ve asimetrik proteinlerin görüntüler sağlayarak, OPN&#39;ler ile sınırlı olabilir. Bu yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntüler elektron tomografisi 4,5 yöntemi ile, böyle bir 160 kDa antikoru gibi bireysel bir protein (tek bir nesne, hiçbir ortalama) 3 boyutlu rekonstrüksiyon, hatta elverişli. Ayrıca, OPN&#39;ler küçük proteinlerin örnekleri yüzlerce incelemek için yüksek verimli bir araç olabilir. Örneğin, 53 kDa&#39;lık bir kolesteril ester transfer proteini daha önce yayınlanmış mekanizması (CETP) örnekleri 6 yüzlerce taranması ve görüntüleme içeriyordu. Düşünüldüğünde cryo-EM nadiren başarıyla görüntüleri proteinler az 200 kDa üzerinde yüz örnek koşullarını eleme ilgili herhangi bir çalışma yayınlamaya henüz, o OPN&#39;ler küçük proteinleri eğitim için yüksek verimli bir yöntemi çağırmak için adil. Umarım burada sunulan OPN&#39;ler protokol E sınırlarını zorlamaya yararlı bir araç olabilirM küçük protein yapısı, dinamikleri ve mekanizmaları içine EM çalışmaları hızlandırmak ve.

OPN&#39;ler ait uygulamalar gibi çeşitli lipoprotein türlerinin yapısal ve morfolojik inceleme,: oluşmakta olan yeniden birleştirici HDL (rHDL), küresel HDL yeniden birleştirici, plazma HDL, LDL ve VLDL IDL (Şekil 2) 30; Bu 53 kDa&#39;lık CETP (EM ile başarılı bir şekilde görüntülenmiş olan en küçük proteinler arasında) (Şekil 3) ve 6 160kDa IgG antikorlarının yanı sıra küçük proteinler (en dinamik ve heterojen proteinlerden biri) (Şekil 4) 4,5,29,52 , hatta 28 kDa lipit ücretsiz apolipoprotein A-1 (Şekil 2L) ve GroEL ve protozomları (Şekil 2M ve N). Yüksek verimli bir yöntem olarak OPN&#39;ler diğer örnekleri, 53 kDa protein olarak, CETP mekanizmaları ortaya çıkardığı için, protein-protein etkileşimleri incelenmektedir. Investıgatıon Giriş kısmında tarif edildiği gibi, ne CETP lipoproteinlerin farklı alt sınıfları ile etkileşim olduğuted Bildiğimiz gibi 400&#39;den fazla EM örneklerini 6 inceleniyor, TARAMA yaklaşık yüz farklı koşullar içeren cryo-EM çalışmanın böyle bir durum yoktu. OPN&#39;ler küçük ve asimetrik protein 3D yapısını incelemek ve hatta 3D yapısı (ortalama olmadan) tek ve bireysel proteini oluşturmak ulaşmak için genişletmek EM sınırlarını genişletebilirsiniz. Örneğin IgG antikor ara çözünürlükte 3D yeniden elde edilmesi zor olduğu son derece esnek bir yapıya sahip olan 160 kDa&#39;lık bir moleküldür. OPN&#39;ler yöntem eğilme açısında (Şekil 4E ve h) bir dizi görüntü için tek bir IgG antikoru kullanılmıştır. 4,5 - bireysel parçacık elektron tomografisi (Ipet) (J Şekil 4E) tek bir proteinin başarılı inşası için izin OPN&#39;ler gelen makul yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı protein görüntüler. Ipet 3D rekonstrüksiyonu <sup&gt; 4, hedef antikorun 2B eğim dizi yavaş yavaş 14.1 ~ çözünürlüğe (Şekil 4F ve G) bir 3B yoğunluğu elde etmek için, daha sonra tekrar eden yeniden yoluyla hesaplanan küresel merkezi ile aynı hizada olarak 4. Aynı yolla, bir tek antikor-peptit kompleksi yeniden inşa edildi ve peptit (çözünürlük ~ 16.6 a Şekil 4I ve J) 4,5 keşfedilen bir tek antikor ya da bir parçacığın iç alanı, yapısal bir değişikliğe neden oldu. Farklı bireysel parçacıklardan 3 boyutlu rekonstrüksiyon karşılaştırılması, yapısal analiz, bir kimyasal reaksiyon 4,5,29,53,54 bir ara aşamalar &quot;-shot ek&quot; bile bize protein termodinamik dalgalanmaları ortaya çıkarmak için izin olabilir ve. Özetle, 40 kDa arasındaki moleküler kütleye sahip proteinler - 200 kDa standart EM yapısal muayene ve rekonstrüksiyon için zorlu. Düşünülürse% 50 üzerindeproteinler 40 arasında değişen moleküler kütleye sahip E - kDa 1,2 200, küçük ve asimetrik yapısal belirlemeler ve hatta mekanik çalışmalar doğru geleneksel EM sınırı itmek için sağlam ve yüksek verimli bir araç olarak bir OPN&#39;ler yöntem rapor. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" width="500" /> Konvansiyonel negatif boyama (NS) EM ile lipoproteinlerin 1. Rouleau dışlayıcı Şekil. (Panel aşağıda) Elektron (panel ile elde edilmiş) ve mikrograflan seçilen parçacıklar standart karışımı prosedürü altında fosfotungstik asit (PTA) sonra bir rulo ile NS çeşitli lipoproteinler göstermektedir. ApoE4 (A) yeniden oluşturulmuş HDL&#39;nin, (rHDL), (B) apoA-l-ihtiva eden 9.6 mil diskoidal rHDL, (C), plazma LDL (D)-olmayan apolipoprotein içeren lipozomlar ihtiva eden POPC apo. Barlar: 50 nm. Pencere boyutu: A ve C, 20 Km; B, 30 nm. Lipid Research Dergisi başlangıçta bu işi 29,30 yayınladı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" width="500" /> . (OPN) üzerinde EM elektron mikroskobu OPN&#39;ler göre bir rulo artefaktsız farklı lipoproteinleri ve lipozomlar göstermektedir optimum negatif lekeleme ile Şekil 2. Protein yapı (A) &#39;rHDL ApoE4 içeren;. (B), 7.8 nm rHDL, (C) 8,4 nm rHDL ( D) 9,6 nm rHDL, (E) 9,3 nm küresel rHDL, (F), insan plazma HDL-α, (G), plazma HDL (H) İnsan plazma LDL (I) insan plazma IDL, (J), insan plazma VLDL; <strong&gt; (K), POPC lipozom gibi (L) lipit serbest apoA-I. Ek doğrulama (M) Groel ve (N) Proteazom örnekleri kullanılarak yapıldı. Mikrograflan (yukarıda paneller) ve (panel aşağıda) seçilen parçacıklar. Barlar: 50 nm. Pencere büyüklüğü: A - D, 20 nm; E ve F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J ve K, 100 nm; L, 80 nm., Lipit serbest apoA-I, GroEL ve proteasome dışında, Bu araştırma aslında Lipid Research 29,30 Dergisi&#39;nde yayınlandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil CETP 3. OPN&#39;ler elektron mikroskop. (A) CETP (kesik daireler) ile Genel Bakış mikrografıdır muz şekilli parçacıklar. (B) Windoweham partikülleri seçmek d. (C) Üç tek ham CETP parçacık görüntüleri net diğer küçük, hafif ve dar ucu (sol panel) de dahil olmak üzere bir büyük, daha ağır ve daha büyük küresel ucu gösteren, üst görünüşünü daha az genel eğrilik benzer terminal bölgelerini gösteren (orta CETP (sağ panel) uzun ekseni aşağı panel) ve bir uç görünüşüdür (D) kristal yapısına (PDB üst üste konması,:. bu ham KETP parçacık görüntü üzerine 2OBD) olabilir oryantasyonunu gösteren, hem yapısal etki şekli ve boyutu iyi bir uyum sağlar yaklaşık olarak doğru da bilgisayar ((C) karşılık gelen paneller) ile yardım almadan tanımlanabilir. (E), bu rasgele bir şekilde yerleştirilen parçacıkların benzerlik (çapraz-korelasyon hesaplama) hesaplamak için serbest 2B sınıf ortalamaları (ab initio bir süreç, bir referans olan parçacıklar birbirine yüksek benzerlik, gruplandırılmış hizalanmış ve sonra arka plan gürültüsünü azaltmak için ortalama ve partikül görüntü con arttırılmıştırkontrast. Referans ücretsiz 2D sınıfı ortalamalar hangi, hiçbir insan yapımı ilk modeli bu sınıf ortalamasının karıştığı, EMAN pakette refine2D.py yazılım tarafından hesaplanır. Referans sınıf ortalamaları) tek parçacık yeniden gelen 3 boyutlu rekonstrüksiyon doğrulamak için bağımsız bir yöntem olarak kullanılabilir. (F) Seçilen referans ücretsiz 2D sınıfı ortalamaları diğer kıyasla daha büyük bir uzak ucunu göstermektedir. (G) Binen kristal yapısı (PDB :, bindirme görüntüleri yapısı şekil ve alan boyutu (düşük paneli) hem kristal yapısı ve referans ücretsiz sınıf ortalamasının arasındaki yakın mükemmel eşleşmeleri referans serbest ortalamalara 2OBD) karşılaştırma göstermek (F) en CETP&#39;nin 3D yoğunluğu haritası. 13 Å çözünürlük OPN&#39;ler ve tek parçacık rekonstrüksiyon yöntemi (üst panel) ve kristal yapısı (düşük paneli) tarafından bu tek-parçacık yeniden içine yerleştirilmiş çıkıntılı-vücut tarafından görüntülendi 8.879 parçacıklardan yeniden inşa edildi. Detgörüntü ön işleme, başlangıç ​​modeli, arıtma işlemleri, açı dağıtımı ve Fourier Shell Korelasyonu (FSC) içeren tek parçacık rekonstrüksiyon ailed bilgi, yöntem bölümünde yayınlanan edildi ve orijinal kağıdın destekleyici bilgiler (H) tek parçacık yeniden Final karşılaştırılması ( panel) ve ek PDB uygun karşılaştırma (alt panel) üzerinde 6. Barlar: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Bu rakamların bazıları daha önce Doğa Kimya Biyoloji 6 yayınlandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. OPN&#39;ler görüntüleri ve İnsan IgG 1 antikor parçacıkların rekonstrüksiyon. (A) fazlainsan IgG1 antikoru OPN&#39;ler görüntülerin görünümü. Beyaz çevrelerinde gösterilen Parçacıklar açıkça 3 subdomainli parçacıkları görüntüler. (B) elle dokunma olmadan herhangi bir (ham parçacık kenarını çevreleyen gürültüyü azaltarak beş ayrı ankonjuge antikor parçacıklar ve (C) karşılık gelen gürültü azaltılmış görüntüleri yüksek çözünürlüklü ham görüntüleri Seçilmiş kolayca görselleştirmek üzere, parçacıklar içindeki yoğunluk). (D) aynı şekilde EM görüntülere bir görüntüleme yönlenmiştir IgG 1 antikor kristal yapısı (PDB girişi 1IGT). Karşılık gelen görüntü karşılaştırması EM görüntü ve etki pozisyonları ve şekilleri de dahil olmak üzere kristal yapısı arasında pek çok ortak özellikleri göstermektedir. (E), bir örneği, tek IgG 1 antikor bir ab initio 3D rekonstrüksiyonu için adım adım prosedürü (bir ortalama, Bir tek nesne) bireysel parçacık elektron tomografi (Ipet) yöntemini kullanarak. (F) si nihai 3D rekonstrüksiyon14.1 çözünürlüğünde ngle antikor parçacık üç halka biçimli alanları bir &quot;Y&quot; şeklinde oluşturulması göstermiştir. (G) alanı yoğunluğu, sırasıyla ilgili haritalar ve manuel olarak etki alanları arasından halkaları tekrar her birine etki kristal yapılarını bir yuva. (Y) Ipet tek bir IgG-peptid kompleksi (hayır ortalama bir birey nesne) 3D rekonstrüksiyon adım için adım prosedürü. (I) bir IgG peptid kompleksi son 3D rekonstrüksiyon 16.6 Å çözünürlükte görüntülenen üç çubuk gösterdi bir &quot;Y&quot; şeklinde oluşturulması şekilli alanları (J), sırasıyla, her bir IgG antikor etki kristal yapısını (PDB girişi: 1IGT) yerleştirme. her bir çubuk şekli yoğunluklarda içine, az bir iç alan, yapısal bir değişikliğe işaret alan kristal yapıları eşleşen gösterdi peptid birleştirmeden sonra. Ayrıntılı prosedür, çözünürlük analizi ve istatistik orijinal yazıda anlatılan edildi <s&gt; 5 Barlar onbirler: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Bu çalışma başlangıçta PLoS ONE 4 yayınlanan ve Bilimsel 5 Raporları. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" width="500" /> Amorf karbon film Şekil 5. Güç spektrumu bir Zeiss Terazi 120 LaB6 TEM ile 1.6 mikron flulaştırmayla altında görüntülenmiş. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme EM uygun hizalama ve yüksek çözünürlüklü yeteneğine sahip olduğunu göstermek için yeterli kanıt gerektirir. Izgara Yakın karbon alanının güç spektrumunun analizi öncesinde, veri toplama için ışın tutarlılık durumunu kontrol etmek için etkili bir yöntemdir. Amorf karbon alanın görüntüsünün Fourier transferi (C cihazla ilgili kontrast transfer fonksiyonunu göstermek<html> TF), yani Rica-halkaları denir. Uygun bir uyum ve tutarlılık görünür Rica-halkaları sayısı ve nispeten yüksek bir bulanıklaştırma koşul altında görünür Thon halkaların yüksek çözünürlük ile yansıtılabilir. / Å 2 - LaB6 lif donanımlı TEM yakın bir düzgün hizalama durum bir örnek olarak, 20 Thon halkalar (~ 5 Å) bir karbon film elde edilebilir ~ fazla 20.4 e doz kullanılarak 1.6 mikron defokusta görüntülenmiş. Düşük uç TEM elde Rica Halkalar, uygun bir hizalama koşulları altında işletilen bir alan emisyon gun (FEG) geliştirilmiş TEM gibi yüksek-uç TEM gelenle benzer sahiptir. Başlangıçta Bilimsel yayınlanan bu çalışma 5 Reports. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil OPN&#39;ler görüntüleme için &quot;ideal&quot; bir alanlarında 6 Örnek mikrograflan. Üç protein numuneleri (A) GroEL (B) &#39;Proteazom (C), küresel HDL, görüntüleme için ideal OPN&#39;ler göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Lekeleri düzensiz dağıtılan örnek olduğundan, numune, düşük büyütme genellikle &quot;bulutlu&quot; (en soldaki paneli) belirir. Görüntüleme için ideal bölgeleri normalde bu &quot;bulutlar&quot; ın sınırları içinde yer almaktadır. Bir örneği adım adım zoom-bir &quot;clear&quot; leke bölge (sol orta panel) parçacıkların yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntüler (sağ orta panel) ile başvuran yüksek büyütme görüntüleri gösterir. Parçacıkların Seçilen görüntüleri proteinlerin yapısı ayrıntıları (sağdaki panel) gösterir. Barlar:. 30nm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig6highres.jpg" target="_blank">büyük görüntülemek için tıklayınız</a>Bu rakamın r sürümü. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. OPN&#39;ler prosedürlerin şematik bir diyagramıdır. (A) EM ızgara inkübasyon istasyonu, parlayan taburcu ızgara üzerinde örnek çözümü kuluçkaya basit istasyonu. Işığa leke temasını en aza indirerek, bir buz yatağın üzerinde su damlacıkları yıkama ve leke damlacıkları korumak için tasarlanmış (B) Boyama iş istasyonu,. (C), boyama işlemi genel bakış gösteren: kurutma yönü, 3x su ile durulama, 3x UF leke maruz kalma, leke damlacıklarının ters örnek ızgara ile Boyama inkübasyon, ve son arka örnek edilerek kurutulmadan önce örnek boyalı çözeltinin ince bir tabaka sağlamak için lekeleme azot hava. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" target="_blank">th daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>rakamdır. <img alt="Şekil 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig8highres.jpg" width="500" /> Şekil 8. Yüksek - 53kDa küçük protein CETP&#39;nin çözünürlüklü görüntüler değiştirilmiş OPN&#39;ler yöntem, cryo-pozitif-boyama (cryo-PS) gelen ortaya Five yüksek çözünürlük ve dairesel şekli (ters kontrast) CETP parçacıkların yumuşak maskeli ham görüntüleri seçin. ve parçacık şekli kolaylıkla görselleştirmek için (ancak parçacıkların içinde herhangi bir değişiklik yapmadan ham yoğunluğu parçacık görsellerin kenarları çevresinde el ile düşük gürültü) ham parçacıkları maskeli. Tüm atom ve şerit kristal yapısı karşılaştırma EM görüntüleri her parçacığın benzer yönelimleri hizalanmış ham parçacıkları maskeli için. Tüm kristal yapı özellikleri ham veriden çözülebilir ise ham görüntü alanlarının yüksek çözünürlüklü detaylar, kristal yapısı ile bazı benzerlikler göstermektedir. Remarka<html> bly, bu ham görüntüleri Her iki terminalde benzerlik elle azaltılmış gürültü görüntüleri (üçgenler) görülen yakındaki küçük dairesel deliklere sahip bitiyor göstermektedir; Ayrıca, parçacık görüntü içindeki C-terminal bölgelerinde şeritler kristal yapısını tamamlayıcı β-tabakalar (oklar) ve son olarak, CETP C-terminal bölgesinde üzerine çıkıntı yapan döngüler kristal yapısı (karo) olarak benzer olan (A). beş seçim (ters kontrast ile) CETP parçacıkların yüksek çözünürlüklü ve dairesel yumuşak şekil maskeli ham görüntüleri. (B) 10a filtreleme Düşük geçiş. (C) 20a filtreleme Yüksek Düşük geçiş. (D) elle gürültü azaltılmış görüntüleri Maskeli. (E) Şerit yapısı ile kristal yapı karşılaştırması. tüm atom temsilciliği tarafından (F) Kristal yapı karşılaştırması. Bar: 5nm. Bu işin bir parçasıdır Doğa Kimya Biyoloji 6 yayımlandı.sıska &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" width="500" /> Şekil 9. tuzluluk farklı altında klasik NS protokolü (PTA leke) tarafından rouleau oluşumunu gösteren lipozom elektron mikroskobu. (A) Yüksek tuzluluk (~ 0.5 M NaCI). (B) &#39;Normal tuzluluk (~ 0.25 M NaCI). (C) Düşük tuzluluk (~ 0.1 M NaCI). (D) saf su. Mikrograflan (panelde yukarıda) ve gösterilen (panelinin altında) seçeneğini pencereli parçacıklar. Barlar: 100 nm. Pencere boyutu: 80 nm. Lipid Research Journal aslında bu işi 30 yayınladı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle &lt;200 kDa) &#39;dir. Optimize negatif boyama, yüksek kontrast ve nispeten yüksek çözünürlük (~ 1 nm) farklı fizyolojik koşullar altında, küçük, asimetrik proteinlerin ya da komplekslerin görüntüleri elde etmek için güçlü ve yüksek verimli bir protokoldür.

Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

optimized-negative-staining-high-throughput-protocol-for-examining

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

43.4K Görüntüleme.  The Molecular Foundry.  Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle 

Video: Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biyokimya

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Biyomühendislik

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of contrast enhancing stain reagent. Although limited in resolution to a maximum of ~18 - 20 &#197;, negative stain EM is useful for a variety of biological problems and also provides a rapid means of assessing samples for cryo-electron microscopy (cryo-EM). The negative stain workflow is straightforward method; the sample is adsorbed onto a substrate, then a stain is applied, blotted, and dried to produce a thin layer of electron dense stain in which the particles are embedded. Individual samples can, however, behave in markedly different ways under varying staining conditions. This has led to the development of a large variety of substrate preparation techniques, negative staining reagents, and grid washing and blotting techniques. Determining the most appropriate technique for each individual sample must be done on a case-by-case basis and a microscopist must have access to a variety of different techniques to achieve the highest-quality negative stain results. Detailed protocols for two different substrate preparation methods and three different blotting techniques are provided, and an example of a sample that shows markedly different results depending on the method used is shown. In addition, the preparation of some common negative staining reagents, and two novel Lanthanide-based stains, is described with discussion regarding the use of each.

Negative stain EM is a powerful technique for visualizing macromolecular structure, but different staining techniques can produce varying results in a sample dependent manner. Here several negative staining approaches are described in detail to provide an initial workflow for tackling the visualization of challenging systems.

Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Biyoloji

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...