Biz bu çalışmada ve USDA kullanılan kargalar sağlamak için S. Werner teşekkür etmek istiyorum, APHIS, hayvan bakımı ve izlenmesi için WS, NWRC hayvan bakım personeli. Mansiyon veya bir ürünün kullanımı USDA onaylandığı anlamına gelmez. Bu çalışma için fon USDA, APHIS, Veteriner Hizmetleri tarafından sağlanmıştır.

Bizim protokol daha önce 7 yayınlanmış bir uyarlanmıştır. Hayvanları içeren tüm işlemler Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA), Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi (Aphis), Yaban Hayatı Hizmetleri (WS), Ulusal Yaban Hayatı Araştırma Merkezi (NWRC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1.. Crow Gavaging <ol><li> Amerikan karga sindirim sistemi yoluyla &#39;sahte beyin malzemenin&#39; geçişi zamanı tahmin. <ol><li> Pişmiş ve (Şekil 1) gavaj iğne bir 2 kullanarak mavi boya ve sonda 1 karga ile tam pişmiş yumurta 5 ml karıştırın. </li><li> Mavi / yeşil-lekeli dışkı atılır ediliyor artık kadar Crow her 30 dakikada bir kontrol edin. </li></ol></li><li> Bulaşmamış ve ölümcül hasta RML (Chandler suşu) enfekte C57BL / 6 fare beyinleri edinin. </li><li> 1x bir kurşun blender homojenleştiricide normal bir% 20 ağırlık / hacim ve enfekte fare beyin Homojenat oluşturmakfosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve cam boncuklar, daha sonra daha büyük bir parçacık maddenin ayrılması için 1 dakika için 3000 x g &#39;de santrifüj. Süpernatantı ve steril PBS içinde bir% 10 ağırlık / hacim üretmek için 1x PBS eşit hacmi ile seyreltilir. Ihtiyaç kadar -80 ° C&#39;de dondurun. </li><li> Önce sonda 17 saat karga kalemler dışında, su değil gıda kaldırmak, ancak. </li><li> , Tedavi gruplarına rastgele tahsis karga ve oral gavaj iğnesi bir 2 kullanılarak, normal ya da enfekte ya da fare beyin homojenatının, 5 ml her karga sonda. </li><li> Transferi bireysel kafeslere kargalar ve 4 saat sonrası gavaj (Şekil 2) için her bir kafes içinde tüm dışkısını toplamak ve havuz. </li><li> Homojen bir doku elde edene kadar cam boncuk ile bir mermi blender homojenleştiricisinde her karga için toplandı dışkı homojenize. * Crow dışkı daha çok sıvı ve kolayca karıştırılabilir. </li><li> Her karga için, 10 ml&#39;lik toplam hacim 9.5 ml 1 x PBS içine dışkı homojenat 500 ul seyreltik. </li><li> Fekal homogena santrifüj1,400 x g&#39;de 15 dakika boyunca te ve süpernatant ekstrakte edin. </li><li> , Ikinci bir mikrobiyal enfeksiyon tehlikesini en aza indirmek homojenat 100 ul başına 100 birim 1 ul / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin (Invitrogen, NY) ile tedavi edilmesi için daha sonra süpernatant azaltmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında, UV ışığı altında yer viral ve bakteriyel kontaminasyon riski. UV maruz kaldıktan sonra, herhangi bir geri kalan mikropların membran bozulması için 30 saniye boyunca 70 ayar bir 3000 Mp sonikatör sonikasyon örnekleri. </li></ol> 2. Fare aşılama <ol><li> Şu tedavi gruplarında (Tablo 1) için fareler tahsis: <ol><li> Grup 1 - Tedavi ile farenin ağızdan 5 ml enfekte Fare beyinleri ile zorla ağız yolundan verilmiştir karga dışkı homojenat, 1 ml (IP) intraperitonal olarak aşılandı. </li><li> Grup 2 - negatif bir tedavi farenin ağızdan 5 ml normal fare beyinleri ile zorla ağız yolundan verilmiştir karga dışkı Homojenat 1 ml IP aşılandı. </li><li> Enfeksiyonlandı sulandırmak1:100 w / v 1x PBS için Grup 3 ve 4 için d ve normal fare beyni homojenatı. </li><li> Grup 3 - pozitif kontrol fareleri enfekte fare beyni homojenatından 1 ml IP olarak aşılanmıştır. </li><li> Grup 4 - Negatif kontrol fareleri, normal fare beyni homojenatından 1 ml IP olarak aşılanmıştır. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tedavi Grubu </td><td> Hayvanların sayısı </td></tr><tr><td> Grup 1 </td><td> Scrapie + Crow Dışkı </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Grup 2 </td><td> Scrapie - Crow Dışkı </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Grup 3 </td><td> Scrapie + Fare Beyin </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Grup 4 </td><td> Scrapie - Fare Beyin </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> . Tablo 1 Scrapie inokülumunun durumu (negatif pozitif +, -) ve hayvan sayısı 7 kullanılır. <ol start="2"><li> Periton fareyi aşılamak: <ol><li> Nazikçe Scruff başparmak ve işaret parmağı ile sırt boyun kürk fare ve ventral yüzü ortaya çıkarmak için döndürün. </li><li> Kafası biraz daha düşük, bu nedenle fare arka ucunu yükseltin. </li><li> 1 cm deri, orta hatta 1 cm lateraline aracılığıyla 25 G iğne yerleştirin ve 1-2 cm anterior sakroiliak eklem iğne kilitleme şırınga kullanarak. </li><li> 1 ml fare vücut boşluğuna yavaş inoküle enjekte edilir. </li></ol></li></ol> 3. Fare İzleme <ol><li> Onlar fare skrapinin klinik belirtilerini ifade kadar günlük fareler izleyin. Klinik bulgular içerebilir: kifoz, ataksi, sert kuyruk, bakım eksikliği, zayıflatma, ve uyuşukluk. </li><li> 0 görünür = yok, 1 = orta, 2 = şiddetli nerede görünür işaretler, belirgin olduğunda 6 klinik bulguların her biri için fareler skor. </li><li> Her oturum için günlük toplam puanları için 1 gün ≥ 8 ulaştığınızda fareler Euthanize, ≥ 6 sürekli olarak 3 gün boyunca, ya da 365 gün aşılama (dpi) göndermek. </li><li> Hasat beyinleri hemen aşağıdaki euthan-70 ° C&#39;de asya ve mağaza </li><li> , Bir scrapie teşhisi doğrulamak aşağıdaki gibi seyreltilmiş proteinaz-K çözeltisi (PK) içindeki bir 50 ug / ml &#39;lik 3 ul beyin örnekleri sindirimi için: 3.1. PK ul, 500 mM EDTA, 12.5 ul, pH 8, 45 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1x PBS 109,39 ul, daha sonra 8 ul yükleme tamponu ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edilerek örnekleri PK etkisiz hale getirirler. Bir% 12 SDS-PAGE jeli, Electrophorese ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 0.2 Tween-20 içerisinde Immobilon PVDF membran ve% 5 yağsız süt ile bloğuna transfer üzerine yük örnekleri. Daha sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Superblock içerisinde seyreltilmiş Horseradish peroksidaz, konjuge edilmiş anti-PrP Bar224 monoklonal antikoru ile prob. PBS-% 0.2 Tween 20 ile, 1 saat boyunca membran durulayın. , Görselleştirmek bir G-box jel dokümantasyon sistemi üzerinde kemolüminesans ve görüntü ile Western Blot 5 dakika inkübe. </li></ol>

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie.">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li><li>Miller, M. W., Williams, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epizootiology+of+chronic+wasting+disease+in+free-ranging+cervids+in+Colorado+and+Wyoming.">Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming.</a> Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).</li><li>Miller, M. W., Williams, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+prion+transmission+in+mule+deer.">Horizontal prion transmission in mule deer.</a> Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).</li><li>Sigurdson, C. J., Adriano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Wasting+Disease.">Chronic Wasting Disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).</li><li>Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+sources+of+prion+transmission+in+mule+deer.">Environmental sources of prion transmission in mule deer.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).</li><li>Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+prions+in+pre-clinical+deer+and+transmission+of+chronic+wasting+disease+solely+by+environmental+exposure.">Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure.</a> PLoS ONE. 4 (6), e5916 (2009).</li><li>VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+remains+infectious+after+passage+through+digestive+system+of+American+crows+(Corvus+crachyrhunchos).">Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos).</a> PLoS ONE. 7 (10), e45774 (2012).</li><li>Imran, M., Mahmood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+animal+prion+diseases.">An overview of animal prion diseases.</a> Virology Journal. 8 (493), (2011).</li><li>Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+prion+disease.">The expanding universe of prion disease.</a> PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26 (2006).</li><li>Bruce, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmissions+to+mice+indicate+that+'new+variant'+CJD+is+caused+by+the+BSE+agent.">Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent.</a> Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).</li><li>Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+lateral+transmission+of+scrapie+between+sheep+kept+under+natural+conditions+using+lymphoid+tissue+biopsy.">Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy.</a> Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).</li><li>Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+risk+of+prion+zoonoses.">The risk of prion zoonoses.</a> Science. 335 (6067), 411-413 (2012).</li><li>Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+agent+diversity+and+species+barrier.">Prion agent diversity and species barrier.</a> Veterinary Research. 39 (47), (2008).</li><li>Harrington, R. D., Baszler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+barrier+limits+transmission+of+chronic+wasting+disease+to+mink+(Mustela+vison).">A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison).</a> The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).</li><li>Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mites+as+vectors+for+scrapie.">Mites as vectors for scrapie.</a> Lancet. 347 (9008), 1114 (1996).</li><li>Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+larvae+and+pupae+as+vectors+for+scrapie.">Fly larvae and pupae as vectors for scrapie.</a> Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).</li><li>Matthews, D., Cooke, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+for+transmissible+spongiform+encephalopathies+in+non-ruminant+livestock+and+fish.">The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish.</a> Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).</li><li>Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deer+carcass+decomposition+and+potential+scavenger+exposure+to+chronic+wasting+disease.">Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).</li><li>Scherbel, C., Pichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+scrapie+associated+prion+protein+(PrPSc)+by+the+gastrointestinal+microbiota+of+cattle.">Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle.</a> Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).</li><li>Jeffrey, M., Gonza&#225;lez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapie+susceptible+and+scrapie-resistant+sheep.">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).</li><li>Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+sheep+scrapie+brain+homogenate+to+rumen-simulating+conditions+does+not+result+in+a+reduction+of+PrP(Sc)+levels.">Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels.</a> Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).</li><li>Motes C, M. a. l. u. q. u. e. r. d. e., Grassi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+of+BSE+and+scrapie+prions+in+stools+from+murine+models.">Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models.</a> Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).</li><li>Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+shedding,+alimentary+clearance+and+intestinal+spread+of+prions+in+hamsters+fed+with+scrapie.">Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie.</a> Veterinary Research. 40 (1), 4 (2009).</li><li>Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Bjorndal, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+of+digestive+responses+in+two+generalist+herbivores,+the+tortoises+Geochelone+carbonaria+and+Geochelone+denticulate.">Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate.</a> Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).</li><li>Clark, R. G., Gentle, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+grain+passage+time+in+captive+mallards.">Estimates of grain passage time in captive mallards.</a> Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).</li><li>Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+intake,+digestion+and+passage+of+proboscis+monkey+(Nasalis+larvatus)+in+captivity.">Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity.</a> Primates. 33 (3), 399-405 (1992).</li><li>Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+feeding+strategies+and+potential+disease+transmission+in+Wisconsin+white-tailed+deer.">Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer.</a> Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).</li><li>Pulford, B., Spraker, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+PrPCWD+in+feces+from+naturally+exposed+Rocky+Mountain+elk+(Cervus+elaphus+nelsoni)+using+protein+misfolding+cyclic+amplification.">Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification.</a> Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).</li><li>Hicks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guano+deposition+in+an+Oklahoma+crow+roost.">Guano deposition in an Oklahoma crow roost.</a> Condor. 81 (3), 247-250 (1979).</li><li>Aldous, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Winter+habits+of+crows+in+Oklahoma.">Winter habits of crows in Oklahoma.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz karga sindirim sistemi yoluyla PrP Res malzemenin geçişini belgelemek için bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz kargalar hastalıksız coğrafi bölgelere PrP Res malzeme translokasyonunda yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için geleneksel yöntemleri kullanılır. Diğerleri bunu ortadan kaldırmak için başarısız ikisi de 19-21 ve kemirgen 22,23 sindirim sıvıları, geviş PrP Res direncini değerlendirdik. Onlar da potansiyel leş PrP Res malzeme karşılaşma ve prion hastalıklarının yayılmasını kolaylaştıran manzara karşısında bu malzemeyi taşıyabilecek olarak bu tekniklerin gelecekteki uygulama diğer etobur 24 uygulanmalıdır. Biz karga sindirim sistemi yoluyla homojenize fare beyninin yaklaşık geçiş zamanını değerlendirmek için basit bir yol sağlayarak, karıştırılmış yumurta &#39;sahte beyin&#39; malzeme mavi gıda boyası eklenir. Biz ilk ins bu tekniği dikkate başkalarına tavsiyeçalışmada, hayvanlarda mevcut dışkı rengini PECT ve sonra en zıt olan gıda boyası kullanabilirsiniz. Bu çalışma hayvanlar geçti gıda renk lekeli malzeme kolay tanımlanması için izin verecektir. Biz geçiş zamanı tahmin etmek için gıda boyası kullanmayı seçti, ama diğerleri floresan pigment 25, demir oksit 26, renkli plastik işaretleri 27 ve renkli metalik pullar (yani parıltı) 28 kullandık. Karga dışkı ikincil bir mikrobik enfeksiyon tehdidi en aza indirmek ve doğru aşılayarak fareler uzun kuluçka dönemleri gerektiren fare prion çalışmalar için önemli başlangıç ​​noktalarıdır. Bu düşünceler birini ihlal edilirse, erken fare ölüm ile sonuçlanabilir. Soruşturma için başka bir olası aracı ağızdan sonda kargalar ile, bulaşıcı malzeme geçmesi ne kadar süre sonra kurmayı zamanla karga dışkı örneklerini değerlendirmek için siklik büyütme veya sPMCA hatalı katlanması seri proteindirBir fare bioassay için ihtiyaç var. Pulford tarafından PMCA dışkı analizinde son gelişmeler, vd. PMCA de kuş dışkısı değerlendirmek için yararlı bir araç olabileceğini düşündüren, prionların dakika düzeylerinin büyütme memeli dışkı 29. tespit edilebilir olduğunu göstermektedir. Fare biyodeney ve sPMCA yaklaşım CWD bulaşmış malzeme ile zorla ağız yolundan kargalar dışkılarında artık bulaşıcılığının değerlendirmek için kullanılan olabilir. Bir cervidized transgenik fare hattı gerekli ve aşılanarak karşı intraserebral olacağını daha hızlı sonuç verecek. Böyle karga, akbaba ve kartal gibi kuş toplayıcılar, yani CWD Kuzey Amerika&#39;da, TSE hastalıkların yayılmasında rol oynayabilir. Bu türler (avcı-öldürülen cervids durumunda) hastalıklı leşleri veya bağırsaklarına gelen CWD-pozitif doku tüketmek ve CWD-serbest bölgelerde veya cervids popülasyonlarının kendi dışkılarıyla bulaşıcı malzeme translocate olabilir. In, cervids tahıl besleme pratiği olarak vahşi veya esirayarları, besin kaynağına arınmak ve yanlışlıkla cervids tarafından tüketilen karga çekiyor, böylece yüksek riskli bir uygulama (Vercauteren kişisel gözlem) &#39;dir. Rastgele dışkı birikimi yoluyla PrP Res malzeme ile buluşmasının CWD-serbest hayvanların oran düşük olabilir ama Dahası, kargalar ve böylece dışkı yoğunlaştığı alanlar, ortak roosting siteleri aşağıda gibi, prions beri hastalık iletimi için yüksek risk alanları haline gelebilir 30,31 ortamında çok kalıcı.

Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati (TSE) yaban hayatı etkileyen ölümcül bulaşıcı nörodejeneratif hastalıklar, evcil hayvanlar ve insanlar vardır. TSE hastalıkları, bulaşıcı madde prion proteinlerinin 1 yanlış katlanmış veya patojenik izoformu (PrP S) olduğu görülmektedir. Koyun ve keçilerde scrapie;; sığır süngersi ensefalopati (TSE Hayvan hastalıkları karaca (Odocoileus hemionus), beyaz kuyruklu geyik (Odocoileus virginianus), geyik (Cervus elaphus) ve geyik (Alces alces) kronik israf hastalığı (CWD) içerir yerli sığırlarda BSE); Yetiştirilmiş vizon transmissible vizon ensefalopati; kedilerde feline süngerimsi ensefalopati; primatlarla 8 ve süngerimsi ensefalopati; egzotik hayvanat bahçesinde egzotik toynaklı süngerimsi ensefalopati aile Bovidae ruminates. Tek bir insan TSE hastalığı, Creutzfeldt-Jakob hastalığı, nadir ve PrP Res-Kirlenmiş alıcı tarafından satın alınması için düşünülmüşated gıda 9. Kontamine sığır 10 tüketilen Benzer şekilde, eğer BSE insanları enfekte edebilir. Tüm TSE hastalıkları, scrapie ve CWD hayvandan hayvana 2,3,11 yanı sıra çevresel kaynaklardan 4-6 olduğu tahmin edilmektedir kendini idame ettiren ve salgın enfeksiyon kaynakları ile sadece iki tanesi. Araştırma çoğu TSE hastalıkları klinik bulguların tezahürü PrP Res malzemenin doğal maruz olaylardan önemli uzun kuluçka dönemleri gerektiren 2-4,6,8 ve belirgin tür engelleri en aza indirmek, ancak, türler arası iletim 12-14 potansiyelini ortadan kaldırmak olmadığını göstermektedir . Bulaşıcı prion (PrP Res) malzeme yayılması için mekanizmalar belirlenmesi TSE hastalıkları manzara karşısında nasıl hareket hakkında soruları yanıtlayan için son derece önemlidir. Deneysel araştırmalar 15,16, kümes hayvanları ve domuz 17, ve Amerikan kargaları (Corvus eşyaları böcekler düşündürmektedirhyrhynchos) 7,18 PrP Res malzemenin pasif taşıyıcılar veya dağıtıcılar bulunmaktadır. Karga sindirim sistemi yoluyla PrP Res malzemenin geçişi geçenlerde TSE hastalıkları 7 dağılması oynayabileceği rolü göstererek, belgelenmiştir. Bu sonuçlar, kargalar, bir çöpçü, karşılaşma olabilir o akla yatkın hale tüketmek, ve hastalıksız bölgelere, dışkı biriktirme yoluyla bulaşıcı malzeme taşımak. Burada göstermek prosedürler kargalar sindirim sistemi yoluyla PrP Res malzemenin geçişini belgelemek için kullanılan ve büyük ölçüde gelecekteki ilgili araştırmalarda diğer çöpçü ve etobur türe özgü modeller için bu yöntemlerin uygulanmasını kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada, geleneksel yöntemler PrP Res malzemenin yayılması ve genel yüküne katkıda bulunabilecek PrP ​​Res malzeme kaçakçılığı bir alışılmamış araçlar araştırmak için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="545">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">RML Chandler strain mouse-adapted scrapie</td>
			<td style="width:112px;">Rocky Mountain Laboratories</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">RC57BL/6 mice</td>
			<td style="width:112px;">Hilltop Lab Animals</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">American crows</td>
			<td style="width:112px;">wild captured</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15140-122</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Phosphate buffered Saline</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Proteinase-K solution</td>
			<td style="width:112px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:137px;">3115887001</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Loading buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">NP0007 and 0009</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Bis-tris SDS PAGE 12% gel</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">NP0342</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Immobilon PVDF membrane</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">1SEQ00010</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">Tween 20</td>
			<td style="width:112px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P2287</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">Bullet blender homogenizer</td>
			<td style="width:112px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:137px;">BBX24B</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">2.3 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td style="width:112px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:137px;">11079125Z</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">Bar224 anti-PrP monoclonal antibody</td>
			<td style="width:112px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:137px;">10009035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">Superblock</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:137px;">37517</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:217px;">chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">WBKLS0500</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:217px;">G-box gel documentation system</td>
			<td style="width:112px;">Syngene</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedures for identifying infectious prions after passage through the digestive system of an avian species

Bulaşıcı prion (PrP Res) malzeme olasılıkla ölümcül, nörodejeneratif Bulaşıcı süngerimsi ensefalopati (TSE) hastalıklar 1 nedenidir. Bu tür kronik halsizlik hastalığı (CWD) ve TSE hastalıkları, Transmission, hayvan 2,3 hayvana hem de çevresel kaynaklarından 4-6 olduğu tahmin edilmektedir. Süpürücüleri ve etobur tüketim ve CWD kirlenmiş leş boşaltım yoluyla PrP Res malzemeyi translokasyonunda potansiyele sahiptir. Son çalışma Amerikan kargalar sindirim sistemi (Corvus brachyrhynchos), ortak bir Kuzey Amerika çöpçü 7 ile PrP Res malzemenin geçişini belgelemiştir. Biz Amerikan kargalar aracılığıyla PrP Res malzemenin geçişini belgelemek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Kargalar RML-deformasyon fare adapte skrapili zorla ağız yolundan ve onların dışkı 4 saat sonrası sonda toplandı. Crow dışkı içine daha sonra bir araya getirilmiş ve periton içine enjekte edildiC57BL / 6 fareleri. Bu fare skrapinin klinik belirtileri ifade edilmiş ve daha sonra kurban edilmiştir kadar Fareler, günlük olarak izlendi. Asemptomatik fareler 365 gün Aşıdan kadar takip edildi. Western Blot analizi hastalık durumunu teyit etmek için yapılmıştır. Sonuçlar prionların testi farelerde hastalığa neden kargalar sindirim sistemi yoluyla seyahat sonra bulaşıcı kalır ve dışkı mevcut olduğunu ortaya çıkarmıştır.

Kullanılan prosedürler karga sindirim sistemi scrapie beyin homojenatı 7 arasında oral gavaj sonrası PrP Res enfekte 4 saat ortadan etmediğini göstermektedir. PrP Res malzeme ile zorla ağız yolundan verilmiştir olan tüm yirmi karga, daha sonra farelere dışkı yoluyla PrP Res malzeme aktarılır. Hastalıklı farelerin fare klinik işaretler ve scrapie hastalık onay Western blot analizi ile tamamlandı tezahürü ile belirlenmiştir. Karga tarafından yutulur malzemenin tutma süresi incelenmesi dışkılarında boya varlığında, (Şekil 1) göre 4 saat, olduğu bir zorla ağız yolundan verilmiştir karga için, beslenme sistemi geçiş süresini ortaya çıkardı. Tüm dışkı tek kullanımlık pipetler ile toplanmış ve her karga (Şekil 2) için bir araya toplanmıştır. Işlenmemiş karga dışkı Akut toksisite ham dışkı yüzer pilot test farelere IP enjekte edildiğinde oluştu. Penisilin ve stre ile dışkı aşılamak tedavi ileptomycin, UV ışığı ve sonikasyon biz bu sorunu ortadan kalkar. Her iki tane skrapi pozitif fare beyin (9/9) veya skrapi aşılanmış karga dışkılar ile aşılanmış tüm fareler (66 * / 84) klinik belirtileri görülmüştür (Şekil 3) Western blot analizi ile pozitif test kolayca geçirilir ki scrapie görüntüleyen kargalar ve neden olduğu hastalığın sindirim sistemi. * Onsekiz fareler olasılığı nedeniyle toksisite, aşılamadan 3 gün içinde öldü. Tüm ancak bir (1/23) skrapi-negatif aşılanmış farenin Western blot analizi ile negatifti. Biz bu fare yanlışlıkla skrapi-negatif karga gelen skrapi pozitif karga dışkı yerine dışkı ile aşılanmıştır varsayımında. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50853/50853fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. Crow mavi boya (A) ve b ile karıştırılmış bütün yumurta, 5 ml el ile kısıtlanır ve oral yoldan zorla ağız yolundan verilmiştirLue / dışkı 4 saat sonrası sonda (B) yeşil-boyandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50853/50853fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50853/50853fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2. Homojenleştirmeden önce pipet ile karga dışkı toplama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50853/50853fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50853/50853fig3.jpg" width="500px" /> Şekil 3,. . Bioassay gelen fare beyninin Temsilcisi SDS-Page Western Blot NBH-fare normal homojen beyin, skrapi-negatif, Teksas kafesi 4 - Bir skrapi aşılanmış karga dışkı ile aşılanmış bir fare beyin. (+) Ve ezelî ilet (-). PK (proteinaz K) sindirim <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50853/50853fig3highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species at JoVE.com

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Süpürücüleri hastalıksız bölgelere kendi dışkılarıyla bulaşıcı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati prionları translokasyonunda potansiyele sahiptir. Biz fare adapte skrapi prıonlar Amerikan kargalar sindirim sisteminde (Corvus brachyrhynchos), ölü hayvanların ortak bir tüketici olsa geçtikten sonra bulaşıcı kalırsa belirlemek için kullanılan ayrıntı yöntemleri.

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

procedures-for-identifying-infectious-prions-after-passage-through

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Görüntüleme.  USDA.  Süpürücüleri hastalıksız bölgelere kendi dışkılarıyla bulaşıcı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati prionları translokasyonunda potansiyele sahiptir. Biz fare adapte skrapi prıonlar Amerikan kargalar sindirim sisteminde (Corvus brachyrhynchos), ölü hayvanların ortak bir tüketici olsa geçtikten sonra bulaşıcı kalırsa belirlemek için kullanılan ayrıntı yöntemleri. 

Video: Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) Yol Açtığı düzensiz Genler belirlenmesi

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Negatif Seçilebilir Marker Geliştirme Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 1. Biyogüvenlik Seviye 4 Suit Laboratuvar Suite Giriş ve Çıkış İşlemleri

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory with non-high-consequence pathogens will take significantly longer in a BSL-4 setting. This increased time requirement is due to a multitude of factors that are aimed at protecting the researcher from laboratory-acquired infections, the work environment from potential contamination and the local community from possible release of high-consequence pathogens. Inside the laboratory, movement is restricted due to air hoses attached to the mandatory full-body safety suits. In addition, disinfection of every item that is removed from Class II biosafety cabinets (BSCs) is required. Laboratory specialists must be trained in the practices of the BSL-4 laboratory and must show high proficiency in the skills they are performing. The focus of this article is to outline proper procedures and techniques to ensure laboratory biosafety and experimental accuracy using a standard viral plaque assay as an example procedure. In particular, proper techniques to work safely in a BSL-4 environment when performing an experiment will be visually emphasized. These techniques include: setting up a Class II BSC for experiments, proper cleaning of the Class II BSC when finished working, waste management and safe disposal of waste generated inside a BSL-4 laboratory, and the removal of inactivated samples from inside a BSL-4 laboratory to the BSL-2 laboratory.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 2. Genel Uygulamalar

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 4. Medical Imaging Procedures

Medical imaging using animal models for human diseases has been utilized for decades; however, until recently, medical imaging of diseases induced by high-consequence pathogens has not been possible. In 2014, the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Integrated Research Facility at Fort Detrick opened an Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) facility to assess the clinical course and pathology of infectious diseases in experimentally infected animals. Multiple imaging modalities including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging, positron emission tomography, and single photon emission computed tomography are available to researchers for these evaluations. The focus of this article is to describe the workflow for safely obtaining a CT image of a live guinea pig in an ABSL-4 facility. These procedures include animal handling, anesthesia, and preparing and monitoring the animal until recovery from sedation. We will also discuss preparing the imaging equipment, performing quality checks, communication methods from "hot side" (containing pathogens) to "cold side," and moving the animal from the holding room to the imaging suite.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 4. Medical Imaging Procedures

Here, we present an overview of the preparation and animal handling procedures required to safely perform medical imaging in an animal biosafety level 4 laboratory. Computed tomography of a mock-infected guinea pig illustrates these procedures that may be used to evaluate the disease caused by a high consequence pathogen.

bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 4. Tıbbi Görüntüleme İşlemleri

Medical imaging using animal models for human diseases has been utilized for decades; however, until recently, medical imaging of diseases induced by ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol releases or unexpected natural aerosol transmission. Specific laboratories designed to perform these experiments require tremendous engineering controls to provide a safe and secure working environment and constant systems maintenance to sustain functionality. Class III biosafety cabinets, also referred to as gloveboxes, are gas-tight enclosures with non-opening windows. These cabinets are maintained under negative pressure by double high-efficiency-particulate-air (HEPA)-filtered exhaust systems and are the ideal primary containment for housing aerosolization equipment. A well planned workflow between staff members within high containment from, for instance, an animal biosafety level-4 (ABSL-4) suit laboratory to the ABSL-4 cabinet laboratory is a crucial component for successful experimentation. For smooth study execution, establishing a communication network, moving equipment and subjects, and setting up and placing equipment, requires staff members to meticulously plan procedures prior to study initiation. Here, we provide an overview and a visual representation of how aerobiology research is conducted at the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility at Fort Detrick, Maryland, USA, within an ABSL-4 environment.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

As high-consequence pathogens can potentially infect subjects through airborne particles, aerobiology has been increasingly applied in pathogenesis research and medical countermeasure development. We present a detailed visual demonstration of aerobiology procedures during an aerosol challenge in nonhuman primates in an animal biosafety level 4 maximum containment environment.

bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 3. Aerobiyoloji

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...