Bu çalışma araştırma için insan dokuları kullanılabilir hale İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı tarafından mümkün olmuştur. Ve Hepacult GmbH bu iş için finansal destek Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (: Sanal Karaciğer Ağ, hibe sayısı 0.315.759 hibe adı) alındı. Bizim sayesinde de karaciğer perfüzyon ve hepatosit izolasyonu yapılması için karaciğer örnekleri ve Hücre İzolasyon Çekirdek Tesisinden teknik asistanların koleksiyonu için Grosshadern Hastanesi Doku bankası teknik asistanlar gidin. Özellikle, biz video Bu prosedürü göstermek için Natalja Löwen teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, videonun şematik genel Şekil 1 için illüstrasyonlar ve şekiller oluşturma için Natalja Löwen ve Edeltraud Hanesch teşekkür etmek istiyorum.

1.. Perfüzyon ve Yalıtım Çözümleri hazırlanması <ol><li> Karaciğer parçası ve Tablo 1 &#39;e göre hepatositlerin izolasyon perfüzyon için gerekli olan çözümler hazırlayın. Çözümler, kullanılana kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Steril filtre 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm çözümler. </li><li> Karaciğer ile temas eden bütün çözeltiler steril olmalıdır. </li></ol> 2. Perfüzyon Ekipman ve Çözümleri hazırlanması <ol><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, karaciğer parçanın perfüzyon için donatım kadar ayarlanmalıdır. </li><li> Su banyosu her bir deneysel kurulum farklıdır uygun bir sıcaklıkta, en ayarlanmalıdır da karaciğer parça ulaştıklarında çözeltiler 37 ° C sıcaklıkta şekildedir. Bu durumda, su banyosu Çözümleri 1, 2 ve 3 ile kaplanmış cam soğutucu ısınmaya 41 ° C&#39;de ayarlanır. Çözüm 4 ısındı edilmelidirKollajenaz aktivite kaybını azaltmak için kullanım için ayrı bir su banyosu içinde 37 ° C. </li><li> Kısa bir süre karaciğer perfüzyon önce,% 95 O 2 /% 5 CO 2 oksijenlenme aparatı (Şekil 1E) gaz içeren gaz tankı regülatör açın. </li></ol> 3. Karaciğer Perfüzyon <ol><li> Sadece 1 kesme yüzeyi ile ideal mümkün ve olduğunca sağlam Glisson kapsülü ile bir karaciğer parçası perfüzyon için bir patolog elde edilmelidir. </li><li> Delikli bir filtre diski (Şekil 1 B) içeren bir Büchner hunisi üzerinde, bu parça karaciğer yerleştirin. </li><li> Perfüzyon sistemi Çözüm 1 ile astarlanmalıdır. </li><li> Düşük bir akış oranı ile, zeytin uçları eğri bir sulama kanüller karaciğer parçasının kesme yüzeyi üzerinde daha büyük kan damarlarının içine yerleştirilmelidir. Kan karaciğerden dışarı basması gibi, doku perfüzyonu iyi olan yerlerde hafif olur. Çeşitli boyutlarda için kullanılan kanül sayısıkaraciğerinin Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. Seçilen göstergesi boyutu yerinde kanüller yapacak oturması sonuçlanmalıdır. Küçük kan damarları, karaciğer parçasının dışarı boşaltmak için perfüzyon tamponu için açık bırakılmalıdır. </li><li> Karaciğer (Şekil 2B) büyüklüğüne bağlı olarak, ml / dak 110-460 arasına peristaltik pompa ile ilgili akış hızını artırır. Bu, 44 ± 16 arasında bir ortalama akış oranında ml / dak kanül başına (Şekil 2C) ile sonuçlanır. Seçilen hızı karaciğer parça bağlıdır ve karaciğer parçasının hafif plumping kadar sonuçlanmalıdır. Bazı durumlarda, yukarıda bahsedilen hafif plumping elde etmek için mikro vasküler kıskaçlar ile açık kapların bir kapalı sıkıştırılması için gerekli olabilir. Karaciğer parçası boyunca açık renk olduğunda iyi bir perfüzyon görülebilir. </li><li> Fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bez parçası ile kaplayıp perfüzyon sırasında nemli karaciğer parçasını tutun. </li><li> Herhangi r dışarı atılması için Çözüm 1 1 L serpmekkaraciğer parça kan emaining. </li><li> Çözüm 2 perfüzyon sıvısı değiştirin ve 10 dakika boyunca perfüze. </li><li> Çözüm 3 perfüzyon sıvısı açın ve 0,5 L. ile serpmek </li><li> Kollajenaz (Tablo 2) 0.1-0.15% içerir Çözüm 4&#39;e perfüzyon sıvısını değiştirin. </li><li> Karaciğer yeterli sindirilir kadar bu adım için, perfüzyon 9-12 dakika boyunca, bir devri daim şekilde gerçekleştirilebilir veya olmalıdır; karaciğer dokusu Glisson kapsülü altında ayrı hafif kırmak ve bir de kör tarafı ile problanmıştır zaman yumuşatılmış hissetmek görünmelidir neşter. </li></ol> 4. Hepatositlerin izolasyonu <ol><li> Peristaltik pompayı kapatın ve karaciğer parça kanüller kaldırın. </li><li> Çözüm 5 100-200 ml ihtiva eden bir kristalizasyon çanağında karaciğer parça yerleştirin. </li><li> Dikkatle Glisson kapsülü kaldırın ve yavaşça hücreleri silkelemek. De perfüze olmayan bölgeler yoksa, bir neşter kesmek için kullanılabilirBu bölgeler içinde bulunan hücreleri serbest bırakmak için. Gibi sürecinde ihtiyaç duyulan daha Çözüm 5 ekleyin. </li><li> 500 ml&#39;lik bir nihai hacim elde edilene kadar daha fazla Çözüm 5 ekleyin. </li><li> Iki hücre süspansiyonu filtre, ilk önce bir 70 mikron naylon elek, ardından bir 210 um naylon elekle. Daha sonra, 200 ml santrifüj tüplerine hücre süspansiyonu dökün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 72 g hücre süspansiyonu santrifüj Aspire edilen süpernatan ve yavaşça Çözüm 5 200 ml yavaşça tekrar süspansiyon hücre topağı. </li><li> Yıkama adım numarasını 4.6 üç kez tekrarlayın. Son santrifüj adım, soğuk depolama çözümü tekrar süspansiyon hücreleri (malzemelerin listesine bakınız). Hücreler, bir hemositometre tabanlı bir tripan mavi dışlama tahlili kullanılarak verim ve canlılığı değerlendirilmesi için mililitre başına yaklaşık 2-5000000 hepatositler olmalıdır. </li><li> Bir tripan mavi dışlama tahlili gerçekleştirmek için, tripan mavi soluti, 0.5 ml ihtiva eden bir mikrofüj tüpüne (≈ 2-5000000 / ml), uygun şekilde seyreltilmiş 0.1 ml hücre eklemekon (% 0.4 tripan mavi fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş) ve 0.4 ml PBS. İyice karıştırdıktan sonra hücre süspansiyonu, süspansiyon ile bir hemasitometre yük ve 100X büyütme ile mikroskop altında incelenmiştir. Canlı hücreler boyanmamış görünür iken mikroskobu altında, ölü hücreleri mavi boyanmış olacaktır. Menositometrede işaretli 1 mm 2 bloğun her birinde canlı ve toplam hücre sayısını. Canlılık (%), canlı hücre verimi (ml soğuk depolama çözümü (CSS) başına milyon hepatositler veya g karaciğer başına milyon hepatositler) aşağıdaki formüller kullanılarak hesaplanabilir. </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> Not: Bu durumda, tripan mavi seyreltme faktörü 10 ve hemositometre faktör 10.000 &#39;dir.

<ol>
	<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase.">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li><li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells.">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li><li>Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mass+Isolation+of+Whole+Cells+from+Rat+Liver.">The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver.</a> Science. 117, 627-628 (1953).</li><li>Jacob, S. T., Bhargava, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Method+for+Preparation+of+Liver+Cell+Suspensions.">New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions.</a> Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).</li><li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver.">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li><li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells.">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion.">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li><li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research:+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany.">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li><li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver.">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Pure+Hepatocytes+and+Reticuloendothelial+Cells+in+High-Yield+from+a+Single-Rat+Liver+by+Means+of+Percoll+Centrifugation+and+Selective+Adherence.">Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence.</a> J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li><li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver.">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li><li>Weiskirchen, R., Gressner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of hepatic stellate cells.</a> Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation.">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li><li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation.">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation:+a+single-center+multivariate+analysis.">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li><li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pre-,+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes.">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+review:+Hemostats,+sealants,+and+adhesives+II:+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox.">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostats,+sealants,+and+adhesives+III:+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox.">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li><li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study.">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head &amp; neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li><li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review.">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li><li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue:+a+one+hundred+liver+experience.">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222 (2011).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li><li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices.">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The principles of humane experimental technique. , (1959).</li></ol>

Bu protokolün optimizasyonu kısmen Hepacult GmbH bir hibe ile finanse edildi. Dr Wolfgang THASLER Hepacult GmbH kurucularından biri olan ve bu şirkette yönetim kurulu üyelerinden biri olmaya devam etmektedir. Maresa Demmel istihdam Hepacult tarafından kısmen. Maria Hauner Hepacult GmbH tarafından istihdam edilmektedir. Hepacult rızası ve araştırma amaçlı açık erişimli insan hepatositleri sunmaktadır Üniversitesi&#39;nden bir spin-off biyoteknolojik firmadır.

Bu protokol, yüksek sağlamlık ve saflıkta insan hepatositlerinin izolasyonu ile sonuçlanır. Bu sonuçları elde etmek için, bu karaciğer uygun bir parça ile başlamak önemlidir. Karaciğer parçası 1 kesme yüzeyi hariç tüm yüzeylerde bozulmadan Glisson kapsülü olmalıdır. Bir diğer önemli faktör farklı partisi sindirim 11 sonra hepatositlerin canlılığında belirgin farklılıklara neden olabilir olarak, kullanılan kolajenazın belirli bir küme olduğu. Bu nedenle, kolajenaz, farklı gruplar halinde test edilmelidir ve en canlılığı ile hepatositleri üreten toplu büyük miktarlarda elde edilmelidir. Son olarak, uygun bir sindirim süresi elde hücrelerinin verimi ve canlılığı göre seçilmelidir. Örneğin, düşük verimle yüksek canlılığı yetersiz sindirim süresini gösterebilir ve düşük canlılığı ile yüksek verim sindirim süresi çok uzun olduğunu gösteriyor olabilir. Bu yöntem, t uyarlanabiliro, aynı parça karaciğer olmayan parankimal hücreler ve hepatositlerde izole eder. Bunu yapmanın bir yolu, non-parenkimal hücreli izolasyonu 12 direkt olarak (adım 4.6), birinci santrifüj aşamasından gelen süpernatan kullanmaktır. Ikinci bir yöntem, hepatosit izolasyonundan (adım 4.5) için naylon elekle filtrelenmiştir sonra hücre süspansiyonu gerekli kısım çıkarın ve verimini artırmak amacıyla olmayan parenkimal hücreli izolasyonundan önce ilave bir Pronaz sindirim aşamasından kalan hücre süspansiyonu tabi tutulmasıdır non-parankimal hücreler 13. Hepatositlerin pahasına olmayan parankimal hücrelerin daha yüksek bir verim için, bu yöntem, Pronaz ve kolajenaz için (adım 3.10), tek başına kolajenaz ikame olmayan parankimal hücre izolasyonu 14 için elde edilen hücre süspansiyonu kullanılarak modifiye edilebilir. İnsan hepatositleri izole ek olarak, bu yöntem, aynı zamanda ileri geri toplanan sunulan karaciğer hepatositleri parçalarından izole etmek için uyarlanabilirkıyaslanabilir boyutlarda veya benzer damar boyutları ile m diğer türler. Bu, domuz, köpek veya primat modeller gibi alternatif modelleri kullanmak araştırmacılar için önemli olabilir. İnsan hepatositlerinin İzolasyonlar genellikle iki kaynaktan karaciğerleri kullanılarak yapılır: Bütün ciğeri rezeksiyon marjları nakli veya morfolojik normal karaciğer dokusu için uygun sayılır. Bu yöntemde kullanılan ikinci kaynağının avantajı karaciğer parçaları daha önce laboratuara hazır olmasıdır. Hemen rezeksiyon sonrası, rezeke karaciğer tanı için gerekli olan ne kaldırır bir patolog getirilir. Patolog sonra atılması hedefleniyor ne hepatosit izolasyonu için morfolojik olarak normal karaciğer uygun bir parça çıkarmak olacaktır. Genel olarak, bir karaciğer parçası 56 ± 29 dakika boyunca (N = 103) arasında bir ortalama süre içinde perfüzyon için hazır laboratuarda gelir. Buna karşılık, transplantasyon için uygun değildir, bütün karaciğer tek rel olacak13 ± 2 saat ve 16 ± 12 saat 15 arasındaki laboratuvara hafifletti. Buna ek olarak, nedeniyle etik kaygılar ve donör karaciğerinin sıkıntısı, nakli için tüm kriterleri uymayan bütün karaciğerlerinden hepatositlerin izolasyon Eurotransplant bölgede önlenir. Bu ciğeri yine uzatılmış verici kriterlere nakli için kullanılabilir olmasıdır. Bazı çalışmalar seçilen alıcılara 16,17 geriledi bekleme listesi mortalite ve tatmin edici sonuçlara transplantasyon sonuçlarına hasta erişimi maksimize olduğunu göstermiştir. Diğer bir avantajı nakli için uygun karaciğer, yağlanmış fibrotik veya siroz olabilir iken karaciğer rezeksiyonu parçalarından elde edilen hücreler, morfolojik olarak sağlıklı bir karaciğer izole olmasıdır. Bu nedenle, burada yöntem, et al Baccarani ile elde gram karaciğer başına 0.7 ± 0300000 ya da 3 ± 2000000 hepatosit ile karşılaştırıldığında gram karaciğer başına 13 ± 11000000 hepatositlerin yüksek bir verimle sonuçlanır. 15. sırasıyla siroz veya yağlanmış karaciğerleri kullanarak. Ancak, karaciğer rezeksiyonu adet mevcuttur parçasının boyutu olarak hepatositlerin daha düşük bir toplam verimle sonuçlanır 2-250 g aralığında ve 37 ± 29 g (N = 648) bir ortalama ile, genellikle küçüktür. , Diğer gruplara kıyasla, bu protokol, siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılmasını önler. Alexandre, et al. 18 etil siyanoakrilat, yaygın olarak kullanılan bir çok amaçlı yapıştırıcı kullanımıdır gramı başına 3,5 ± 0,7-6,0 ± 1600000 hepatositlerden hepatositlerin artan verimle karaciğer, sonuçların kesme yüzeyleri kaplamak için bulundu vasıtalarının değerler ile karaciğer ortalamanın standart hatası ±. Buna karşılık, bu protokol, siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılmadan (ortalama ± standart hata olarak ifade aracı) g karaciğer başına 13.5 ± 0400000 hepatositlerin bir verim elde edebilmektedir. Siyanoakrilat yapıştırıcılar yara kapanması için kullanılmış olsa da &lt;sup&gt; gibi octyl siyanoakrilatın ve butil siyanoakrilatın olarak 19,20, medikal siyanakrilat yapıştırıcılar etil siyanoakrilatın göre pahalı olabilir. Bununla birlikte, örneğin etil siyanoakrilat gibi daha kısa zincirli türevler uzun zincir türevlerini 21,22 daha histotoxic olduğu tespit edilmiştir. Bu metot, zeytin uçları eğri sulama kanül kullanımına zaman etkili basit ve daha fazlasıdır. Uygun boyutta bir kanül kullanılması tutkal 18 ya da 23 dikiş kullanılmadan yerinde tutan bir kanül sıkı bir uyum ile sonuçlanır. Kullanılan kanüller 1.25-4.5 mm ila boyutlu uç çapları 1-2 mm arasında değişen çaplara sahip. Bir parça karaciğer kanülasyon için hazır olduğunda, ekteki videonun gösterildiği gibi, belirli bir kan damarı için uygun büyüklükte bir kanül seçilebilir, böylece kanül çeşitli boyutlarda bir çeşit, hazır olmalıdır. Bu yöntem, aynı zamanda, genel olarak daha kanül (Şekil kullanır2A) 2 23 veya 2-4 18 kanüller kullanılmaktadır, diğer çalışmalara kıyasla. Bu yüksek canlılığı ve daha kısa bir sindirim sürede verime yol açan karaciğer parçası boyunca daha iyi perfüzyon ulaşmak için yardımcı olabilir. Sonuç olarak, bu protokol hücre metabolizmasını, farmakokinetik ve Ksenobiyotiklerin toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve öteleme araştırma eğitim için önemli bir model olan insan hepatositler, izole eder. İnsan zehirlenmeye neden 150 uyuşturucu bir önceki anket klinik pratikte gözlenen hayvan çalışmalarında bulundu toksisite arasında ve uyum% 70 24 olduğunu gösterdi. Bu nedenle, insan hepatositler klinik denemelere gitmeden önce advers için neden hayvan modellerinde yapılan araştırma doğrulamak için ve uyuşturucu testi için önemli bir model kalır. Bir model olarak Ayrıca, numune kalan karaciğer ya da karaciğer izole İnsan hepatositlerinin kullanımı mezbaha hayvanlardan izole edilen 253R etik çerçeve 26 doğrultusunda olası araştırma hayvanların kullanımı yerine.

A correction was made to: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Bir karaciğer hücre süspansiyonu, mekanik ya da enzimatik yöntemlerle karaciğer hazırlanabilir. Bütün karaciğer hücreleri hazırlamak için kullanılan mekanik yöntemler, tülbentten 2 vasıtasıyla karaciğeri zorlayan bir Kahn çalkalayıcı 3 cam boncuklar ile bir karaciğer parçası sallayarak, yılda vb gevşek havan elleri 4,5 ile cam homohenizatörlerin kullanarak dahil, mekanik yöntemler dışına düşmüş nedeniyle hücre zarlarına hasar ve izole edilmiş hepatositlerin 6,7 fonksiyon kaybına lehine. Sonuç olarak, bir enzimatik yöntem şu anda kullanımı hepatositlerin izolasyonu için ana yöntem. Berry ve Friend 8 sıçanlarda portal ven aracılığıyla karaciğerden kolajenaz ve hiyalüronidaz perfüze zaman, bir enzimatik yöntem ile hepatositlerin izolasyonu büyük ölçüde geliştirilmiştir. Bu perfüzyon işlemi yol açan, enzimler, hücrelerin çoğunluğu ile yakın temas için izin vermek üzere damarsal kullanılanhepatositlerin 8 veriminde 6-katlık bir artış. Bundan başka, bu yöntem, hemen hemen izole vezikülleri içine endoplazmik retikulum hiçbir dönüşüm ve hiçbir zarar mitokondriyal 8, yapısal bütünlüğünü muhafaza hücreleri elde edildi. Bu yöntem, karaciğer hücre izolasyonu için iki aşamalı bir prosedür perfüzyon öncülük Seglen 1, modifiye edilmiştir. Bu prosedürde, sıçan karaciğer Ca 2 + 1 ihtiva eden bir kolajenaz perfüzyon tampon maddesi ile, ardından bir Ca2 + serbest tamponu ile perfüze edilmiştir. Ikinci aşamada Ca 2 + eklenmesinin uygun kolajenaz aktivitesi 1.9 için gerekli iken, birinci aşamada Ca 2 + kaldırılması, dezmozomlar bozmak için yardımcı olur. Yukarıda tarif edilen yayınlanmış çalışma sıçanlarda gerçekleştirildi olduğu göz önüne alındığında, bu makalede yüksek uğultu canlılığı ile hepatositlerin izolasyonu için kullanılabilecek modifiye edilmiş bir prosedürü ortaya koymayı amaçlamaktadırBir ciğeri. İnsan hepatositlerinin kullanılması translasyonel araştırma için ve hayvan modelleri kullanılarak deneyler doğrulamak için önemli olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada kullanılan insan karaciğer parçaları İnsan Doku ve Hücre Araştırma Vakfı, bir devlet kontrolündeki kâr amacı gütmeyen vakfın 10 ile yönetişim için rıza ile elde edildi. Bir patolog tanı için gerekli ne uzaklaştırıldıktan sonra, karaciğer parçaları ve geri kalan dokulardan toplanmıştır. Patolog tarafından kapalı kesitli doku morfolojik karaciğer rezeksiyonu sonrası rezeksiyon marjları elde edilen sağlıklı doku oldu.

<table><tbody><tr><td>Bubble trap</td><td>Ga&amp;szlig;ner Glastechnik</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass jacketed condenser</td><td>Ga&amp;szlig;ner Glastechnik</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>41 &amp;deg;C Water bath</td><td>Julabo</td><td>35723-H24/EG</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Water bath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compressed gas cylinder (95 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Linde</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gas permeable tubing</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>320010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Omnilab</td><td>5171014</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Conical flasks 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Conical flasks 5 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Beakers</td><td>Schott Duran</td><td>2110654</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 ml centrifuge tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352075</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Omnilab</td><td>5144063</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved irrigation cannulae with ball tips</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro vascular clamps</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chner funnel</td><td>Carl Roth</td><td>HT38.1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nylon mesh 210 &amp;mu;m</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nylon mesh 70 &amp;mu;m</td><td>Neolab</td><td>4-1419</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m sterile filters</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml bottles</td><td>Schott Duran</td><td>2180144</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 L bottles</td><td>Schott Duran</td><td>2180154</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Neolab</td><td>1508454</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile Pasteur pipettes</td><td>Brand</td><td>747715</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Motorised pipette filler (Pipette boy acu)</td><td>Integra</td><td>155017</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Refridgerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Laminar flow</td><td>Kendro</td><td>Hera safe-KS9</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Aspirator (Low-flow surgical suction pump)</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Laboratory Gas Burner</td><td>Integra</td><td>Fire Boy eco</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable laboratory coat</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Surgical mask with visor</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Surgical hood</td><td>Barrier</td><td>42072</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase (Batch number NB 4G)</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Merck</td><td>2382</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth</td><td>9105.3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Serva</td><td>26868</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Biomol</td><td>01400-2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Serva</td><td>22700</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Serva</td><td>30180</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.4% Trypan blue solution</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cold storage solution</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure

Karaciğer, istisnai bir rejenerasyon kapasitesine sahip bir organ, örneğin detoks, metabolizma ve homeostasis gibi işlevleri geniş bir yelpazede, yürütmektedir. Gibi, hepatositler araştırma soruları büyük bir çeşitlilik için önemli bir model vardır. Özellikle, insan hepatosit kullanımı farmakokinetik, toksikoloji, karaciğer rejenerasyonu ve translasyonel araştırma alanlarında özellikle önemlidir. Bu yüzden, bu yöntem, Seglen 1 tarafından tarif edildiği gibi hepatositleri izole etmek için iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedürünün modifiye edilmiş bir versiyonunu göstermektedir. Daha önce, hepatositler, mekanik yöntemlerle izole edilmiştir. Bununla birlikte, enzimatik yöntemler hepatosit izolasyonundan sonra, yapısal bütünlüğü ve işlevi muhafaza üstün olduğu gösterilmiştir. Burada yer Bu yöntem, 77 ±% 10 arasında bir canlılığı ile hepatosit büyük bir verimle insan karaciğer parçaları ve sonuçlar sıçan karaciğer için daha önce tasarlanmış yöntemini uyarlar. AnaBu prosedürde fark kan damarlarının kanülasyon işlemidir. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, ayrıca, karaciğer karşılaştırılabilir veya kan damarı boyutları ile diğer türlerden elde edilen karaciğer uygulanabilir.

Perfüzyon Kur Karaciğer perfüzyon için gerekli ekipman, Şekil 1&#39;e göre ayarlanmış olmalıdır. Canlılık ve İzole İnsan Hepatositlerin Verim Izole edilmiş insan hepatositlerinin ortalama canlılığı, 77 ±% 10 ve hepatositlerin ortalama verim ± standart sapma olarak ifade edilen değerler ile, 13 ± 11000000 hepatositler / g karaciğer idi. Hepatosit izolasyonların sayısı bu ortalama 648 izolasyonların Aralık 2012 Ocak 1999 yürütülen oldu elde etmek için yapılmıştır. Uygun Perfüzyon Parametreler Başarılı bir yıkama ve karaciğer perfüzyon gerçekleştirmek amacıyla, kullanılan kanül sayısı karaciğer (Şekil 2A) &#39;nin ağırlığına göre değişmelidir. Genel olarak, 4-8 kanül 20 g aşağıdaki üzerinde 80 g arasında değişen karaciğer için kullanılmalıdır. Perfüzyon oranı, uygun bir, Karaciğer ağırlığına bağlı olduğu, karaciğer (Şekil 2B ve C) başarılı bir perfüzyon için seçilmelidir. Bu, 44 ml / min -1 kanül arasında bir ortalama perfüzyon hızı farklı karaciğer ağırlıkları aralığında idealdir ve daha kanül kullanıldığı takdirde, bu nedenle perfüzyon hızı uygun şekilde ayarlanması gerektiği bulunmuştur. Perfüzyon başarılı olursa, karaciğer renk soluk olabilir ve hafifçe dolgun gerekir. Hepatositlerin Saflık Imuno olarak, bu pozitif albümin için, 94 ±% 1 arasında bir saflığa sahip izole edilmiş bir leke hepatositler, (5-N = 4, her çoğaltır) (Şekil 3A ve B). Şekil 3C temsil eden bir faz kontrast görüntü olduğu bulundu Bu tür büyük hücre boyutu ve çok kenarlı-hücreleri gibi hepatositlerin morfolojik özelliklerini gösteren. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615fig1.jpg" /> Şekil 1. Bir Büchner, (C) cam ceketli kondansatör, (D) su banyosu, (E) oksijenlenme aparat kan damarlarının takılı zeytin ipuçları, (kavisli sulama kanüller ile perfüzyon kurulum. (A) kabarcık tuzak, (B) karaciğer parçası F)% 95 O 2 /% 5 CO 2 gaz tankı ve (G) peristaltik pompa. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615fig2.jpg" /> Şekil 2,. Kullanılan kanül (A) sayısı, (B) perfüzyon oranı (ml / dak) ya da (C) perfüzyon hızı (ml / dakika. </sup&gt; karaciğer (g) çeşitli boyutları için kanül). Değerleri standart = 25 N, 41, 18, ​​14 sapma ve 9 0-20 için g, 20-40 g, 40-60 g, 60-80 g ve sırasıyla&gt; 80 gr karaciğer ± ortalamaları temsil eder. Bir Anlamlı farklı 0-20 g durum, p &lt;0.05. 20-40 g, 40-60 g ve 60-80 g durumda, P &lt;0.05 önemli biçimde farklı ab. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50615/50615fig3.jpg" /> Şekil 3,. (Yeşil lekeli) (A) albümin için pozitif izole edilmiş hücreleri ve (B) karşılık gelen negatif kontrol (200 X büyütme) Immunofluorescent görüntüler. Çekirdekler DAPI kullanılarak mavi ile lekelenir. Izole edilmiş hücre (C) Faz kontrast görüntüsü (100 x büyütme). <table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Kurucu </td><td> Final Konsantrasyon</td></tr><tr><td> Çözüm 1 </td><td> Sodyum klorür </td><td> 154 mM </td></tr><tr><td></td><td> Hepes </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td> Potasyum klorür </td><td> 5.6 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glikoz </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum hidrojen karbonat </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Çözüm 2 </td><td> Sodyum klorür </td><td> 152.5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Hepes </td><td> 19.8 mM </td></tr><tr><td></td><td> Potasyum klorür </td><td> 5.5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glikoz </td><td> 5.0 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum hidrojen karbonat </td><td> 24.8 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td colspan="3"> Çözüm 2 hazırlamak için, Çözüm 1 990 ml 100 mM EGTA 10 ml ekleyin. </td></tr&gt; <tr><td> Çözüm 3 </td><td> Sodyum klorür </td><td> 152.5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Hepes </td><td> 19.8 mM </td></tr><tr><td></td><td> Potasyum klorür </td><td> 5.5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glikoz </td><td> 5.0 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum hidrojen karbonat </td><td> 24.8 mM </td></tr><tr><td></td><td> Kalsiyum klorür dihidrat </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td colspan="3"> Çözüm 3 hazırlamak için, Çözüm 1 990 ml 0.5 M kalsiyum klorür dihidrat, 10 ml. </td></tr><tr><td> Çözüm 4 </td><td> Sodyum klorür </td><td> 152.5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Hepes </td><td> 19.8 mM </td></tr><tr><td></td><td> Potasyum klorür </td><td> 5.5 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glikoz </td><td> 5.0 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum hydrogen karbonat </td><td> 24.8 mM </td></tr><tr><td></td><td> Kalsiyum klorür dihidrat </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td></td><td> Kolajenaz </td><td> Tablo 2&#39;ye bakınız </td></tr><tr><td colspan="3"> Çözüm 4 hazırlanması için, 3 Çözüm için kolajenazın uygun miktarda ekleyin. </td></tr><tr><td> Çözüm 5 </td><td> Sodyum klorür </td><td> 120 mM </td></tr><tr><td></td><td> Hepes </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Kalsiyum klorür dihidrat </td><td> 0.9 mM </td></tr><tr><td></td><td> Potasyum klorür </td><td> 6.2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Albümin </td><td> 0.1% w / v </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Perfüzyon ve izolasyon çözümleri. <table border="1"><tbody><tr><td> Karaciğer parçasının boyutu (g) </td><td> Kollajenaz konsantrasyonu(%) </td><td> Kolajenaz aktivitesi (U / ml) </td></tr><tr><td> &lt;25 </td><td> 0.10 </td><td> 250 </td></tr><tr><td> 25 - 40 </td><td> 0.11 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 41-80 </td><td> 0.13 </td><td> 350 </td></tr><tr><td> &gt; 80 </td><td> 0.15 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Kollajenaz konsantrasyonu (%) ve aktiviteler (U / ml), karaciğer parçaları (g) çeşitli boyutları için kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure at JoVE.com

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K Görüntüleme.  Grosshadern Hospital, Munich.  İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur. 

Video: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Biyokimya

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle toxicity testing in immortalized cell lines or primary cells have shown discrepancies, highlighting the need to extend the use of primary cells for in vitro assays. This protocol describes the isolation of mouse liver macrophages, named Kupffer cells, and their use to study nanoparticle toxicity. Kupffer cells are the most abundant macrophage population in the body and constitute part of the reticulo-endothelial system (RES), responsible for the capture of circulating nanoparticles. The Kupffer cell isolation method reported here is based on a 2-step perfusion method followed by purification on density gradient. The method, based on collagenase digestion and density centrifugation, is adapted from the original protocol developed by Smedsr&#248;d et al. designed for rat liver cell isolation and provides high yield (up to 14 x 106 cells per mouse) and high purity (&#62;95%) of Kupffer cells. This isolation method does not require sophisticated or expensive equipment and therefore represents an ideal compromise between complexity and cell yield. The use of heavier mice (35-45 g) improves the yield of the isolation method but also facilitates remarkably the procedure of portal vein cannulation. The toxicity of functionalized carbon nanotubes f-CNTs was measured in this model by the modified LDH assay. This method assesses cell viability by measuring the lack of structural integrity of Kupffer cell membrane after incubation with f-CNTs. Toxicity induced by f-CNTs can be measured consistently using this assay, highlighting that isolated Kupffer cells are useful for nanoparticle toxicity testing. The overall understanding of nanotoxicology could benefit from such models, making the nanoparticle selection for clinical translation more efficient.

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Biyoloji

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Tıp

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...