Bu çalışma, Fen Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve DWA için Yenilik Kanada Vakfı (CFI) hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Hazırlık ve Diseksiyon <ol><li> Sylgard ile kaplı diseksiyon çanak hazırlayın. TEFE (Sarasota, Florida, ABD; Tedarikçiler Tablo 2&#39;de listelenmiştir) itibaren kayıt odaları (Şekil 1) yemekleri diseksiyon olarak kullanılır. Odaları cam slaytlar barındıracak şekilde tasarlanmıştır ve küçük plastik pullar Sylgard için kalıp olarak kullanılır. Birinci çamaşır yağ ve sıvı Sylgard yıkama merkezine eklenir ile slayt sabitlenir. Sylgard gecede tedavi edecek ve bunu yaptığı gibi, bu diseksiyon çanak taban olur cam slayt, küçük, yuvarlak bir yatak oluşturur. Kayıcı kayıt odasına yerleştirilir ve preparat yapıştırılmış olduğu için bölmenin (Şekil 1) temel olarak hizmet vermektedir. </li><li> Tablo 3&#39;te listelenen çözümler hazırlayın. Hücre içi çözeltiler steril tutulması gereken süre Hücre dışı çözelti oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Bir de Lu ekleyebilirsinizM-hücre morfolojisi bu görselleştirme Deneyin sonunda gerçekleştirilebilir, böylece, hücre içi çözeltisine Cifer sarı (% 0.1). Bu hücre kimliğini (Şekil 2) onaylamak için hizmet vermektedir. </li><li> 28.5 ° C&#39;de yumurta su yabani tip Zebra balığı embriyolar yükseltmek ve Kimmel ve ark. 10&#39;a göre toplamak ve sahne. Disseksiyonlarıyla için ayrıca kayıt odası olarak hizmet vermektedir diseksiyon çanak embriyolar transfer. Yakın fizyolojik tuzlu yaklaşmaktadır; bir anestezi tuz çözeltisi (çözelti 1, Tablo 3% 0.02 tricaine) içinde 7-10 dakika boyunca anestezisi. Yeterince hafif bir kuyruk tutam yanıt inceleyerek anestezi ise bir belirleyebilirsiniz. </li><li> Notokordun boyunca ve 0.001 &quot;bir mikroskop (Şekil 1) 25X büyütme kullanarak tungsten tel (Bilimsel Instrument Services. A.Ş., Ringoes, NJ, ABD). Tungsten tel rahatlıkla kesim ile Sylgard kaplı çanak üzerine embriyolar Pin içindeince diseksiyon makas ile küçük segmentlere. </li><li> Diseksiyon 40-50X diseksiyon kapsamı üzerinde büyütmeyi ayarlayın. Embriyo çanak, çene, göz ve ön beyin tutturulmuş sonra forseps iyi bir çift (Dumont # 5) kullanılarak kaldırılır. </li><li> Beyin hafifçe dikkatle notokord ve beyin arasındaki forseps çalışarak uzakta yatan Notokordun soyulur. Ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde arka beyin yavaşça ters çevrilir. Bu konumlandırma yaşlı larva 20-50 mikron (Şekil 2A) genç embriyoların ventral yüzeyinin 5-10 mikron içinde genellikle ve ~ M-hücreleri, iyi erişim sağlar. </li><li> Dikkatlice yama kelepçe deney yapılabilir kayıt kurulum için hazırlık hareket ettirin. M-hücreleri, Nomarski Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) ile görüntülendi rağmen görüntüleme diğer modları (yani Hoffman modülasyon kontrast veya Dodt Degrade Kontrast Görüntüleme itibarenLuigs ve Neumann, Almanya) de kullanılabilir. </li></ol> 2. Patch Kelepçe Kaydı (Tüm Hücre Modu) <ol><li> Tüm kayıtlar Tam hücre yama kenetleme modunda 11 yapılmaktadır. Kayıt odaları elektrofizyoloji kurulumunda bir mikroskop sahneye yerleştirilir. Bizim aşamaları sabit ve dik yama kelepçe mikroskop hareketli bir mikroskop platform ya da bir mikroskop çevirmen cıvatalı. </li><li> TEFE elde edilen ince duvarlı, borosilikat cam, yama kelepçe pipetlerinin yatay çektirmesi (Sutter Instruments Co P-97) üzerinde çekilir. Pipet ucu çapları pürüzsüz bir kenarına alev parlatma sonra 0,2-0,4 mikron mertebesindedir, ve sap konik uzunluğunda ~ 4 mm. </li><li> Elektrofizyoloji kurulumunda amplifikatör kafa aşamasına pipet takın. Bu conta, yüksek direnç oluşumu için uygun olan bir pipet için bir giriş açısı sağlar olarak yatay eksene yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile baş sahne tutmak için önemlidirMauthner hücre üzerine s. </li><li> Sadece banyo çözümü girmeden önce, ucu kirletme olasılığını azaltmak için pipet pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır. MEPSCs kaydederken, banyo çözümleri glisin reseptörleri ve 10 mcM Bicuculline veya GABA A reseptörleri bloke etmek için 100 mcM pikrotoksin engellemek için aksiyon potansiyelleri, 5 mcM striknin engellemek için 1 mcM TTX içerir. MIPSCs kaydederken, banyo çözümleri 1 mcM TTX, Kynurenic asit ve ilgi reseptör aktivitesine bağlı Bicuculline ya zehir ya içerir. </li><li> Pipet pozitif basınç küçük bir miktar ile M-hücre Yaklaşım. Pozitif basınç yavaşça bir taraftan diğer tarafa iter hücre ve hücre hemen üzerinde yer alan zaman, hücre zarı üzerinde küçük bir çukur meydana getirir. Pipet ile membran arasında güçlü bir sızdırmazlık meydana getirilebilir, böylece hafifçe hücre yüzeyi temizlemek için birkaç saniye yerinde pipet bırakın. Pipet pozitif basıncı serbest bırakmakConta başlatılabilir ve negatif pipet potansiyelleri ile birlikte bir negatif basınç küçük bir miktar birkaç saniye içinde oluşan GigaΩ mühürler ile sonuçlanır sağlar. </li><li> -60 MV amplifikatör tutma potansiyeli değiştirin. Emme kısa bir pals serisi ile hücre zarı yırtılabilir. Hemen membran potansiyelleri kayıt ve kapasitans eserler en aza indirmek. % 70-85, hücre kapasitansı (C m) ve erişimi (serisi) direnç (R a) dengeleyin. Ra, rutin, bir dakika 30 saniye izlenir ve% 20 veya daha fazla bir değişiklik varsa, deney iptal edilmelidir. </li><li> Deney sona erdi ve yeterli veri elde edildikten sonra, preparat forseps bir çift arka beyin kaldırarak feda edilmektedir. Bu noktada, veri analizi başlayabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+half+a+century+later:+a+neurobiological+model+for+decision-making.">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li><li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish.">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li><li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo.">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development.">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1.">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).</li><li>Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphants:+a+new+systematic+vertebrate+functional+genomics+approach.">Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.</a> Yeast. 17, 302-306 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Tallafuss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+gene+function+ON+and+OFF+using+sense+and+antisense+photo-morpholinos+in+zebrafish.">Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish.</a> Development. 139, 1691-1699 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development.">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, (2007).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1.">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).</li><li>Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics.">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li><li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish.">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Yukarıda tarif edilen protokol tek M-hücreleri ve kendi homologlarını ikinci kelepçe kayıt yama sağlar. Tekniğin zor ve bakım prosedürü boyunca birçok kilit alanda alınmalıdır. Biz şimdi bu alanların bazı tartışacağız ve başarı sağlamak için yararlı ipuçları sunacak. Diseksiyon / kayıt odasının inşaatı deney önemli bir yönüdür. M-hücreleri, diferansiyel-interferans-kontrast kullanılmadıkça görmek zordur. Nomarski DIC temiz bir cam kapak slipleri ile iyi çalışır, ancak Sylgard (~ 1-2 mm) çok ince bir tabakası, M-hücrelerinin tanımlanması müdahale böyle bir ölçüde DIC deforme olmaz bulduk. Bu nedenle, küçük plastik bir çamaşır makinesi (~ 5 mm çapında) yerleştirilir edildiği altındaki ince bir cam lamel sahip olan bir kayıt odası kullanın. Bir petri tabağına Sylgard 184 karıştırmak ve dikkatli bir Pasteur pipeti ile yıkama içine sıvı Sylgard ekleyin. Sylgard bir kaç gün boyunca oda sıcaklığında tedavi edilebilir ya da hızlı sertleşmesi için ısıtılabilir. Bu gerekli değildir, ancak yıkama, Sylgard kürlendikten sonra uzaklaştırılabilir. Diseksiyon / kayıt odası yapıldıktan sonra taze Sylgard kaplı cam slayt gerekli önce, birkaç hafta için kullanılabilir. Prosedürü bir sonraki adım deney (Tablo 3) gününde ilgili çözümleri her telafi etmektir. ATP ve GTP ancak her ihtiva eden hücre-içi çözeltiler -20 ° C&#39;de önceden yapılan ve 5 ml alikotlar içinde muhafaza edilirler Kayıt günde bir tümbölen oda sıcaklığında ve taze ATP&#39;ye çözülmüş ve GTP ilave edilir. Çözelti, 280 mOsm ile pH 7.4 &#39;e ayarlanır. Bizim ellerde, biz bulmak iyi kayıtları günlük olarak sonuçlar üzerinde taze ATP ve GTP eklenmesi. Tüm çözümler başarı iyi şans için steril tutulması gerekir. Hücre içi çözeltiler throug süzüldü olmalıdırha 0.22 mikron filtre (Sigma) kaydını etkileyebilecek küçük parçacıklar ve enkaz kaldırmak için. Bunu yapmak için, ilk olarak, bir 1 ml şırınga içine hücre içi çözelti çizmek şırınganın ucuna filtre iliştirerek ısıtıldı ve filtrenin sonuna kadar, ince ucuna çekilmiş plastik bir pipet ekleyin. Bu bize cam yama pipet içine doğrudan süzülür hücre içi bir çözüm uygulamak için izin verir. Çözeltiler hazırlanır sonra, embriyo anestezi uygulandı ve kesilmiş olabilir. Önceki diseksiyon için, yeterli bakım organizmanın yaşına değerlendirmek için alınmalıdır. Biraz daha farklı bir hızda bir kavrama yaşları içinde her embriyo. Organizmanın yaşına değerlendirilmesi Bu nedenle bu tür Somitlerin sayısı, vücudun genel şekli ve yumurta döllenme zaman olarak fenotipik işaretler aracılığı ile tespit edilmiş işlemler 10,13 göre bunu yapmak için önemlidir. Tüm diseksiyonlar bir Dumont # 5 ince çifti ile yapılırforseps. Bu keskin olması ve iyi çalışır durumda aksi takdirde arka beyin ventral yüzeyinde arka beyin ve herhangi bir bağ dokusu kaplayan deri kaldırmak için çok zor olacaktır gerekir. Biz sık sık kullanım birkaç hafta sonra forseps keskinleştirmek ve bileme taşı ile bu kendimiz yapmak zorundayız. Sylgard ince tabaka balık pin, biz ince tungsten tel çapı 0.001 inç gelen moda işaretçilerine kullanın. Pimleri bir mikroskop altında bir eski, mikro diseksiyon makas ile kesilmiş ve sağ Notokordun aracılığıyla sığacak kadar küçük vardır. Başka noktada embriyolar iğneleme onları hareketsiz ve gerçekleştirmek için diseksiyon neredeyse imkansız hale getirir. İlk kayıtları gerçekleştirmek için öğrenme, bu onun homologları kimlik M-hücreye zor olabilir (komşu rhombomere bulunan özellikle Ort2 cm - rhombomere 5). Bazı embriyonlar, bu iki çift boyutunda benzer görünür. Otolitler proM-hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olması için uygun bir işareti sunabilir. 48 de M-hücreleri hemen yanında otolit için bulunan HPF ve otolitler diseksiyonu sırasında kaldırılır olsa bile, kendi orijinal pozisyon için bir belirteç olarak hizmet arka beyin bir hafif hasarlı yan bölge, geride bırakmak. M-hücresi ya da başka bir GFP floresan markörü eksprese eden transjenik balık, yeni deneyi için mükemmel preparatlar sağlar. Küçük homologlar pF 12-14 yakın iken bizim ellerde M-hücreleri, 48 hpf yaklaşık 18-24 pF bir membran kapasitans var. Daha büyük bir yüzey alanına sahip küçük hücreler hücrelere kıyasla (pico farad (pF) cinsinden ölçülen) daha büyük bir membran kapasitans değerleri vardır. Bu nedenle, daha büyük bir membran kapasitans hücreleri daha büyük kapasitans değerleri, hücre boyutu, kaba bir göstergesi olarak da kullanılabilir. Bu elektrofizyolojik karakteristik M-hücre türdeşlerini tespit edilebilir hangi başka bir özellik olarak hizmet vermektedir. Son olarak, sık sık Lu kullanınBizim kayıt bize kayıtları tamamlandıktan sonra floresan görüntüleme kullanarak soruşturma altında hücre tipi sağlam bir tanımlama yapmak için izin verir (hücre içi) çözümleri, sarı Cifer. 3.5-4.5 MQ aralığında pipet dirençler genellikle 8 ila 15 MQ değişmektedir uç boyutu ve düşük erişim direnci arasındaki en iyi uzlaşma vardır. ~ 0.1 msn (% 20-80) kez yükselecek ve ~ 0.5 msn üstel 12,14,15 bozunur (Şekil 3A ve 3B); Bu hızlı kinetik olaylar için özellikle önemlidir. Veriler, 50-100 kHz sayısallaştırılması oranında alınan ve 5-10 KHz&#39;lik bir düşük geçiş frekansı ile süzülür. Yama pipetler ile ilgili olarak, biz onlar yangın cilalı bir kayıt elde etmek olması gerekmez bulduk, ama anekdotal, cilasız pipet ile karşılaştırıldığında iyi mühürler elde biraz daha iyi bir şans sunmak için görünür. Pipet uçları nispeten büyük olduğundan, biz ver katmayançözüm girmeden önce pipet y çok pozitif basınç. Bu basınç fazlalığı olarak uygulamak için pozitif basınç, uygun miktarı konusunda karar vermede bir uygulama çok hücre hareket edecek alır ve conta oluşumunu engeller. Hücre yavaşça eski yerinden olduğu gibi aynı zamanda sinaptik temas zarar verebilir. Diğer taraftan, çok az basınç kirli ipuçları sonuçları ve iyi bir conta oluşturmak için yeterince hücre yüzeyini temizlemek değildir. Orta bir tek önemli uygulama ve deneyim yoluyla elde edilir. Seal formasyonu pipet negatif gerilimlerden uygulamaları ile geliştirilebilir. Biz genellikle tüm hücre moduna devrimler için mükemmel 1.2-2 GΩ mühürleri var. Farmakolojik maddeler, hücre sitoplazması uygulanacak gerektiğinde, önceden pipet doldurulmadan hücre içi çözelti içinde içerir. Ajanların kaybını önlemek için pipet çözüm hazırlanırken dikkat edilmelidirBu 0.22 mikron filtre bağlanan alarak. Bu nedenle, ilk olarak hücre-içi filtre ortamı, ve daha sonra dikkatli bir şekilde filtre edilmiş çözelti için bir farmakolojik madde ekleyin. Hücre içi bölmeye bileşiklerin uygulama zorlukları kendi benzersiz belirledi. Örneğin, hücre içi ortamı için ilaçların eklenmesi genellikle bir conta oluşturan GΩ şansını azaltır, ancak noktasına bu deney için önemli bir engel değildir burada. Bir bu şekilde farmakolojik maddelerin bu uygulama madde, tam hücre konfigürasyonu başlangıcından itibaren hücreye anında erişim yana deneyi en uygun kontrol kayıt izin vermez gerçekleştirmek gerekir. Bu deney, bu tip boyunca veri kayıt sırasında, bu nedenle, bir sonraki en iyi kontrol maddesinin etkin olmayan bir formunun hücre içi bir uygulamadır farkında olmalıdır. Birçok durumda, bu, ısı ile inaktive edilmiş bileşiğin form, karıştırılmış peptid o alırtedarikçiden temin inaktif izomeri r. Biz sinaptik akımlar (mPSCs), voltaj-kapılı akımları ve aksiyon potansiyelleri şeklinde veri kazanır. Biz Axograph X (John Clements) kullanmayı tercih rağmen Minyatür akımlar, birkaç mükemmel programlar (pClamp, Axograph, vb) ile analiz edilebilir. Axograph X hem Windows hem de Macintosh platformlarında çalışır ve elektrofizyolojik veri toplama ve analiz hem de kullanılabilir. mEPCs kaydın kendisi elde deneycinin tercih edilen bir şablon yardımıyla elde edilir. Bireysel olaylar Biz Axograph X&#39;den olay izleri kopyaları da dahil olmak üzere rakamlar, üretebilir KaleidaGraph (Synergy Software) veri tabloyu dışa böyle yükselme zamanı, genlik, yarım genişlik ve çürüme süresi, vb gibi özellikleri için analiz edilebilir Deneyin daha zor yönlerinden biri, kayıt temiz sağlamak için yeterince gerçekleştirilmiştir belirleyen birgüvenilir veri. Büyük akson ve geniş dendritik süreçleri var M-hücrelerinden mPSCs kaydederken Örneğin, uzay-sıkma sorunlar ortaya çıkabilir. Ne zaman gerilim sıkma, bir genel (erişim direnci (R a) düşük olup özellikle) oldukça iyi bir pipet ucundaki gerilimi kontrol edebilirsiniz, ama çok dendritik süreçleri veya akson zar potansiyelinin uygun şekilde kontrole sahip olmayabilir uzakta pipet ucundan. Hücre doğru sıkıştırılmış alanı olup olmadığını belirlemek için bir yöntem kaydedildi mPSCs genliği vs yükselme süresi bir dağılım grafiği üretmektir. Veriler arasında bir korelasyon yetersiz alan sıkma düşündürür. Uzay kelepçe kötü ise diğer bir deyişle, daha sonra pipet yakın meydana mPSCs hızlı uzak pipetle bazı mesafe meydana gelen olaylar daha kat ve daha fazla genliklere yükselecek olacaktır. Bir korelasyon mevcut ise, o zaman veri sorunludur ve kullanılamaz. Başka bir görünümü,ele alınması gereken elektrofizyolojik kayıtları sızıntı akımlarının olmasıdır. Voltaj, Na + ya da K + gibi akımlar voltaj bağımlı akımları kayıt etmek için bir hücre bağlama olduğunda bu durum özellikle geçerlidir. Zar potansiyeli dinlenme sapma olduğunda, kaçak akımlar voltaj bağımlı aktivite ile birlikte kaydedilebilir. Kaçak akım (I L), potasyum bir kombinasyonu (I K), sodyum (Na I) ve non-voltaj kapılı kanallar vasıtasıyla klorid (I Cl) mevcut ilgi aktivitesini belirsiz ve kayıt çıkarılması gerekmektedir. Amplifikatör, tipik olarak P / N protokolü olarak adlandırılan çalıştırarak, kayıt sırasında çevrimiçi Bu fonksiyonu gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. P / N protokol sırasında amplifikatör diğerlerinden birkaç küçük kutupsallık giderilişlerini (veya hiperpolarizasyonu) çalışacak ve ortaya çıkan kaçak akımı kaydeder. Bu voltaj-kapılı kanalları etkinleştirmek yok yeterince küçük darbeleri kullanmak önemlidir. MevcutBu darbeler sırasında meydana s kaydedildi ve bu kaçak akımlar voltaj kapılı kanal aktivitesi çıkarılır böylece ortalaması alınır. Son olarak, bir hesaba hücre içi ve hücre dışı çözümler arasında bir elektrodun ucunda oluşur birleşme potansiyeli almak gerekir. Hücre içi ve hücre dışı çözümler genellikle farklı etkinlikler ve hareketlilik ile, farklı iyonlarının oluşmaktadır. Alt mobilitelerde büyük iyonları küçük olanlardan daha iyon hareketine daha büyük bir rezistivitesi sunacak ve bu çözümleri kavşakta küçük ama önemli bir potansiyel farkı neden olabilir. Hücre tarafından yaşanan uygun gerilimler belirlenmesi, bu birleşme olası dikkate alınmalıdır. Burada sunulan tekniği yıllardır bizim laboratuvarda tarafından kullanılan biridir. Bununla birlikte, M-hücre kayıt alternatif yöntem vardır. En önemlisi, Joseph Fetcho ve arkadaşları geliştirmek vared biri burada, M-hücresi dorsal yüzeyi 16 yaklaşılır burada sunulan daha az invaziv bir şekilde (4-5 günlük) büyük larvalarının M-hücrelerinden kayıt hangi mükemmel hazırlanması. Benzer bir teknik denedik ama daha kolay hücre, özellikle, genç balıklar (örneğin, 24 HPF HPF 72) olarak, beyin yüzeyine yakın olan arka beyin, ventral taraftan M-hücre yaklaşım buldu. Bundan başka, sırt yüzeyinden bir yaklaşım genellikle kayıt içine ek değişkenler tanıtmak için bir potansiyele sahip olan M-hücre, bir floresan etiket eksprese eden bir transgenik hattın kullanımını gerektirir. Yabani tip balık kullanırken bu sorun mevcut değil. Ancak burada sunulan tekniği ile, biz genç hayvanları (72 hpf 24 hpf) okuyan sınırlıdır. Böylece, her bir yaklaşım, yararları ve sınırlamaları vardır. Varian bir analiz student t-testi, iki veri gruplarını karşılaştırmak için kullanılabilirce (ANOVA), birden fazla grubu karşılaştırmak için kullanılabilir. Bakım non-parametrik veriler vs parametrik için uygun post-hoc testi seçmek için alınmalıdır.

Gelişimsel nörobiyoloji seçkin sorulardan biri sinaptik olgunlaşması sırasında sinaptik plastisite olayların rolü ile ilgilidir. Bizim araştırma sinaptik gelişme bağlamında hayvan davranışlarını anlamanın bir genel hedefi ile sinaptik gelişmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak plastisite üzerinde duruluyor. Bunu yapmak için, biz 1990&#39;ların sonlarında gelişimsel çalışmalar için önemli bir çekiş kazanmış bir organizmanın (Zebra balığı, Br.rerio) bir ölçüde sağlam hazırlık geliştirdi. Zebra balığı nörogelişimsel çalışmalar için birçok avantaj sunar. Örneğin, genom dizilimi ve bir gen aktivite ve protein ifadesi susturulur morfolino knockdowns ve çinko-parmak tırnakları nükleaz gerçekleştirebilir. Bir de aşırı ekspresyonu çalışmalarını gerçekleştirmek ve transjenik 7-9 yapılabilir. Embriyolar elde etmek nispeten kolay ve bol veembriyonun şeffaf doğası iyi görüntüleme ve opto-genetik çalışmaların kendisini ödünç. Ayrıca, davranış analizi yapılabilir, ve elektrofizyolojik deneyler, in vivo olarak bir hücre fonksiyonunu incelemek sağlayan, büyük ölçüde sağlam organizmalarda kas lifleri, omurilik nöronları ve arka beyin nöronları üzerinde yapılabilir. Daha da önemlisi, hazırlama hazırlanması için, hücrenin sadece aynı sınıfta sinaptik aktivitenin tetkiki, ancak nöronların aynı çift edebiliyoruz. Diğer bir deyişle, bu gelişimini incelemek için, yerinde, aynı nöron geri hangi nadir omurgalı hazırlıkları biridir. Mümkün olduğu kadar canlı nöronal devre korumak için, biz, arka beyin ve omurilik değişmeden kalır edildiği bir preparasyon geliştirilen M-hücrelerinden yama sıkıştırma sırasında. Bu hazırlıkta, beyni kaplayan gözler, çene ve deri hafifçe kaldırılır ve arka beyin Peele olduğunu vardıruzaklıkta Notokordun D, ​​arka beyin ventral yüzeyine erişim sağlar. Reticulospinal nöronlar birkaç mikrometre derin bulunan ve nispeten kolay erişilebilir. 48 saat sonra döllenme (hpf; bazı kısaltmalar Tablo 1&#39;de listelenen) de hücreleri elektrik kompakt ve bir sadakatle, (eksitatör ve inhibitör akımları hem de) onlardan voltaj-kapılı akımları ve aksiyon potansiyelleri, sinaptik aktivite kaydedebilirsiniz. Bulgularımız sinaptik gelişme ve olgunlaşma birçok yönleri önce kuluçka için 24 saat içinde meydana düşündürmektedir ve dikkatimizi bu nedenle kadar 72 hpf 24 hpf yaş arasında değişen organizmalar odaklanmıştır. Bununla birlikte, 72 ile HPF, M-hücreleri daha az elektrik kompakt ve uygun şekilde yer kelepçe zordur. Bu teknik, M-hücreleri, aynı zamanda onun homologları, Ort2 cm ve MiD3 cm sadece kaydetmek için kullanılabilir. Teorik olarak, bir de sp, çift kayıtları yapabilirinal kord böyle bir primer motor nöron olarak ve M-hücreden nöron, ama bu zor ve böyle bir zor tekniği elde faydaları gerekli olağanüstü çabaya değer olmayabilir savundu olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Equipment Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting Dish</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.001" Tungsten Wire</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>MF-900</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Upright Patch clamp microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

patch clamp recordings from embryonic zebrafish mauthner cells

Mauthner hücreleri (M-hücreleri) teleost balık arka beyin bulunan büyük reticulospinal nöronlardır. Onlar organizma bir tehdit algıladığı oluşur C-başlatmak veya kaçış tepkisi olarak bilinen karakteristik bir davranış kilit rol oynayan nöronlar vardır. M-hücre yaygın bu eksitatör geniş bir yelpazede, önleyici ve nöromodülatör sinyalleri almak 1 gösterilmiştir yetişkin balığı olarak incelenmiştir. Biz omurgalı bir hazırlık sinaptik gelişme yönlerini incelemek amacıyla embriyonik zebrabalıkları M-hücre aktivitesini inceleyen edilmiştir. 1990&#39;ların sonlarında Ali ve arkadaşları CNS büyük ölçüde sağlam 2,3,4 edildiği Zebra balığı embriyolarının, M-hücrelerinden kayıt yama kelepçe için bir hazırlık geliştirdi. O zaman amaç bir bozulmamış beyin-omurilik hazırlık içinde fonksiyonel sinaptik bağlantıları korurken Beyin nöronların, spinal kord nöronları ve gövde iskelet kası sinaptik aktivite kayıt oldu.Bu preparat, bugün laboratuarımızda kullanılmıştır. Mekanizmalar gelişimsel sinaptik plastisite incelemek için, eksitatör (AMPA ve NMDA-aracılı) ve 5,6-M hücrelerinin gelişmekte olan inhibitör (GABA ve glisin) sinaptik akımları kayıt. Önemlisi, bu benzersiz hazırlanması bizi dikkatle embriyonik organizmada sinaptik plastisite ve nöro-gelişimini incelemek için hazırlık hazırlık aynı hücrede (M-hücre) geri dönmek için izin verir. Bu karışımda sağladığı faydalar 1) gibi sağlam, M-hücre üzerine fonksiyonel sinaptik bağlantıları, 2) göreceli olarak pahalı olmayan preparatları, hazır embriyo 3), büyük bir kaynağı aynı hücre tipine dönmek için 4) yeteneği (örneğin M- Her hazırlanmasında hücre), tek bir hücrenin seviyede sinaptik geliştirme balık balık incelendi ve böylece 5) embriyoların saydam olmasından dolayı, bütün preparatları görüntüleme.

Bu yazıda biz özellikle M-hücre odaklanarak, zebrabalıkları reticulospinal nöronlardan gelen bütün hücre modunda yama kelepçe kayıt için bir yöntem mevcut. Tabii ki, bu tür dışarı dışarıda hücre bağlı, iç-out ve diğer yama kelepçe modlarda kaydetmek de mümkün. Bir elde bir veri tipi burada sunduğumuz ne sınırlı, ama biz de sinaptik gerilim-kelepçe modunda aktivite (eksitatör ve inhibitör) yanı sıra güncel kelepçe aksiyon potansiyelleri bir örnek vermeye çalışacağız değildir. Organizma yaş ve M-hücreleri daha kapsamlı ve ayrıntılı dendrite geliştirmek gibi, yeterli hücre kelepçe kelepçe ve uzay voltaj yeteneği tehlikeye ve güncel kelepçe modu tercih kayıt haline gelir. Şekil 3, (1 uM) ve farmakolojik maddeler için TTX mevcudiyetinde 48 HPF embriyolardan elde uyarıcı AMPA ve NMDA reseptörü akımları için temsili kayıtlarını gösterirGABA ve glisin reseptörleri bloke eder. M-hücreler -60 mV&#39;de voltaj kenetlenmiş olduğunda, akımları sinaptik AMPA reseptörlerinin aktivasyonu (Şekil 3A) kaynaklanmaktadır. Toplama ve bu olayların analizi, böyle bir yükselme zamanı, çürüme zaman, genlik ve frekans gibi parametreleri kaydetmenize olanak verir. AMPA olaylar genelde bir hızlı yükselme zamanı (~ 0.1 msn% 20-80 yükselme zamanı) ve çürüme süresi (~ 0.5 msn), ve yaklaşık 25 PA ortalama genliği sergilerler. M-hücreleri 40 mV&#39;de tespit edildiği zaman, elde edilen dışa doğru akımlar ve AMPA NMDA reseptör aktivitesi (Şekil 3C ve 3D) kaynaklanmaktadır. NMDA reseptör akımları AMPA alıcısı akımlarının daha uzun zaman süreçleri gösterirler ve 2,6 reseptörleri NMDA Mg blok çıkarmak için pozitif potansiyel ya da Mg içermeyen solüsyon içinde kayıtlı olması gerekir. Şekil 3D gösterilen ortalama mEPSC +40 mV kaydedildi karışık AMPA ve NMDA akımları temsil eder. FiMauthner hücrelerden mIPSCs kaydederken Güre 4 temsilci sonuçlarını gösterir. Bu olaylar, AMPA ve NMDA reseptörlerini bloke etmek için TTX mevcudiyetinde (1 uM) ve Kynurenic asit (1 mM) oluştu. Bu olaylar 48 hpf göre oldukça hızlı artış ve eksilme kinetiği gösterirler ve 2-3 dk kayıt üzerinde 3 çoğu elde etmek için yeterince sık. Hücreye depolarize akımını enjekte sonucunda kaydedilen 5 gösterileri aksiyon potansiyelleri Şekil. Suprathreshold uyaranlara (Şekil 5A) ile birlikte enjekte edildiği zaman, bazen çok AP ateş, ancak 48 HPF embriyoların M-hücreleri, genellikle, tek bir eylem potansiyeli (Şekil 5B) yangın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Kısaltma </td><td> Tam adı </td></tr><tr><td> 1.. </td><td> MPSC </td><td> Minyatür postsinaptik akım </td></tr><tr><td> 2. </td><td> mEPSC </td><td> Minyatür uyancı postsinaptik akım </td></tr><tr><td> 2 </td><td> mIPSC </td><td> Minyatür inhibe edici postsinaptik akım </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MQ </td><td> Mega Ohm (direnci birimi, 10 6 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> GΩ </td><td> Giga Ohm (direnci birimi, 10 9 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> MOsm </td><td> Milli osmolar (ozmolaritenin ünitesi; 10 -3 osmoles) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> TTX </td><td> tetrodotoxin </td></tr><tr><td> 5. </td><td> ATP </td><td> adenozintrifosfat </td></tr><tr><td> 6. </td><td> GTP </td><td> guanosin trifosfat </td></tr><tr><td> 7. </td><td> GFP </td><td> Yeşil floresan proteini </td></tr></tbody></table> Tablo 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> 1.. </td><td> Bulaşık Diseksiyon </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0291 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 0.001 &quot;Volfram teller </td><td> Scientific Instruments Hizmetleri A.Ş. </td><td> W406 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ9.5 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Pipet Çektirme </td><td> Sutter Aletleri A.Ş. </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Microforge </td><td> Narishige Grubu </td><td> MF-900 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Dik Patch kelepçe mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMLFSA </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Mikromanipülatör </td><td> Siskiyou A.Ş. </td><td> MX7500 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> 1322A </td&gt; </tr><tr><td> 8. </td><td> Amplifikatör </td><td> Molecular Devices </td><td> 200B </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Kazanım yazılım </td><td> Molecular Devices </td><td> pClamp9 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Axograph X </td><td> Axograph </td><td> Axograph X </td></tr></tbody></table> Tablo 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Çözüm adı </td><td> Reaktif ve konsantrasyonu (mM) </td></tr><tr><td> 1.. </td><td> Çözüm Diseksiyon </td><td> 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glikoz ve% 0.02 Tricaine </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Hücre dışı çözelti MPSC </td><td> 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz ve 0.001 TTX </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MPSC Hücre içi çözümtion </td><td> 134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 2 Na-ATP, 0.4 Li-GTP </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Aksiyon potansiyeli Hücre dışı çözelti </td><td> 137 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES ve (10 uM D-tubokurarin) ile 10 Glukoz </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Aksiyon potansiyeli Hücre içi çözelti </td><td> 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4 mg-ATP ve 0.4 Li-GTP. </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Tüm hücre dışı çözeltiler 290 mOsm ve pH 7.8 &#39;e ayarlanır. Tüm hücre içi çözeltiler 280 mOsm ile pH 7.4&#39; e ayarlanır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" /> Şekil 1. Çanak ve sağlam arka beyin-omurilik hazırlık Diseksiyon. (A) TEFE elde edilen çanak Diseksiyon ve kayıt. Ince bir yıkama dikkatle t üzerine kapatılıro yemeğin altındaki cam slayt ve Slygard iyi uygulanır. (B) 48 hpf Beyin-omurilik hazırlık. Arka beyin ve ventral yüzeyi yukarı bakacak ve M-hücresi sadece bir ok ucu seviyesinde doku yüzeyinin altında yer almaktadır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" /> Şekil 2. Kısa bir süre sonra, kuluçka 2 dpf embriyo elde edilen M-hücrenin (A) Nomarski, farklılık belirleyici kontrast image. Görüntü M-hücreden spontan harekete geçiren sinaptik etkinliği kayıt sonra çekilmiştir. (B), hücre boyunca Lucifer sarı ile dolduruldu deney. Izni ile 12 uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" /> Şekil 3,. (A) Kendiliğinden AMPA mEPSCs bir M-hücresinden kaydedilen<html> -60 mV bir tutma potansiyelinde. (B) (A) kayıt elde edilen ortalama mEPSCs. (C) Kendiliğinden AMPA ve NMDA (ok uçları) +40 mV bir tutma potansiyelinden bir M-hücresinden kaydedilen mEPSCs. (D) &#39;de elde edilen kayıt Ortalama mEPSCs (C). Glutamat mEPSCs glisin ve GABA akımları engellemek için TTX varlığında aksiyon potansiyelleri engellemek için (1 uM), striknin (5 uM) ve pikrotoksin (100 uM) kaydedildi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" /> Şekil 4. (A) -60 mV bir tutma potansiyelinden bir M-hücresinden kaydedilen spontan mIPSCs. (B) (A) kayıt elde edilen ortalama mEPSCs. mIPSCs GABA akımları engellemek için glutamat reseptör aktivitesi ve Bicuculline (10 uM) engellemeye aksiyon potansiyelleri, Kynurenic asit (1 mM) engellemek için TTX mevcudiyetinde (1 uM) kaydedildi. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" /> Şekil 5,. Aksiyon potansiyeli, bu özel hücrenin bir eşik üstü uyarıcı (0.48 nA) birçok aksiyon potansiyelleri (A) ortaya çıkardı. Bir M-hücreden kaydedilmiş, ancak eşik için bir uyarıcı, sadece tek bir hareket potansiyelini (B) &#39;nin üretimi ile sonuçlanır. A ve B de gösterilen izleri için (C) Current protocols.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells at JoVE.com

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

patch-clamp-recordings-from-embryonic-zebrafish-mauthner-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Görüntüleme.  University of Alberta.  Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz. 

Video: Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial veziküllü Membranların Patch Kelepçe Kayıtlar Sahne&gt; ATPaz veziküllü Hazırlık ve Tekniği

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.