Yazarlar Mona Herold destek Paaqua Grant ve GWU Luther Rice Fellowship destek GWU Harlan Kardeşliği kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibe MCB-1121711 tarafından desteklenmiştir.

1. Aletler, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması <ol><li> Alümina aşındırıcı film kullanarak dört forseps Sharpen. Ucu boyutunu izlemek için bir diseksiyon mikroskobu altında yapın. Forseps Bir çift bir back-up durumda bir ipucu işlem sırasında hasarlı olarak hizmet vermektedir. Dört forseps otoklav ve steril bir kap içinde saklayın. </li><li> Ve filtre sterilize; 500 ml 0,1 X ve 1.0X kültür ortamı her (15 tarifler ya Marc Modifiye Zil [MMR] veya Modifiye Barth&#39;ın Salin [MBS]) olun. Biz rutin MBS (; 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3 1X = 88 mM NaCI) kullanın. Ay boyunca 14-18 ° C&#39;de depolayın. </li><li> Kültür ortamı (bir vidalı kapak cam şişede 100 ml 1X besiyerine 2 g elektroforez dereceli agaroz)% 2&#39;lik agaroz çözüm olun. Agaroz çözmek için otoklav. Bu ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanır ve sonraki gerektiğinde agaroz sıvılaştırmak için mikro dalgada edilebilir. </li><li> Agaroz sıvı iken, bir steril 24 oyuklu kültür plakanın her alt üzerine yaklaşık 0.5 ml dökün. Bu plastik yapışmasını eksplantlar engeller. </li><li> Agaroz sıvı iken, 02:58 60 mm Petri kapları alt üzerine yaklaşık 2-3 ml dökün ve girdap yavaşça alt kapalı olduğundan emin olun. Bu diseksiyon yemekleri olarak hizmet verecek ve onların membranlar kaldırıldıktan sonra agaroz plastik yapışmasını embriyolar önler. </li><li> Agaroz soğutuldu ve sertleştikten sonra, alev 6 &quot;Pasteur pipet ucu bir top haline erir ve hafifçe kültür plakasının her bir kuyu içinde agaroz bir yüzey üzerine temas edene dek. Bu sığ bir oyuk oluşturur içine eksplant alınacaktır. </li><li> 1X steril besiyeri ile kültür plakanın her doldurun. </li><li> Agaroz soğutulur ve sertleşmiş olduğunda, blastomer ayrılmasını kolaylaştırmak için seyreltilmiş kültür ortamı (0,1 X 0,1 X MMR veya MBS) ile diseksiyon çanak doldurun. </li&gt; </ol> 2. Embriyolar Seçimi <ol><li> Döllenmiş yumurta elde edilir ve standart protokoller 15&#39;e göre jöle kat çıkarın. 100 mm Petri kabındaki 0.5x kültür ortamına aktarabilirsiniz. </li><li> Embriyoların 2-hücreli aşamaya ulaşmak zaman, ilk bölünme karık ayrı bir çanak içine hayvan yarımkürede hafifçe pigmentli alanı (Şekil 1) bisects o hangi sıralayabilirsiniz. Bu eksplantlar için donör olacaktır. Eksplantlar sahnelemeye kardeş denetimleri olarak hizmet prosedür boyunca donör embriyolar yanında ayrı bir çanak içinde kalan 2 hücreli embriyolar tutun. </li></ol> 3. Eksplant Hazırlanması <ol><li> Bir diseksiyon çanak 5-10 embriyolar yerleştirin, ancak bir kerede yalnızca tek bir embriyo üzerinde çalışmak. </li><li> Şeffaf zar vitellin görülebilir, böylece ilk embriyo yerleştirin; o embriyonun hayvan kutup yüzeyi üzerinde bir açıklık (boşluk perivitelline) ile ayrılır. Bilenmiş bir kuvvet kullanmaKişinin subdominant taraftan (biri sağ elini ise sol) ps, perivitelline alanın üstünde vitellin membran kavramak. Öte yandan bir bilenmiş forseps kullanarak, ilk forseps ucu yakın membran tutup, yavaşça uzakta membran soyma ters yönde çekin. Hedef hücre zarı çıkarılması sırasında hasar görmesini şekilde kesilerek edilecek olan hücre belli bir mesafede ilk kavrama edin. Bir embriyo dümdüz olacak, çünkü membran kaldırıldı söyleyebilirim. </li><li> Subdominant el forseps ile bir komşu hücre tut ve disseke edilecek hücrenin doğrudan temas etmeyecek şekilde bir &quot;kol&quot; olarak bu hücre kullanın. Diğer yandan da forseps ile hafifçe istenen blastomerli uzak kalan komşu hücreler çekin. Aynı kaderi paylaşıyoruz midline hücreleri, hedef varsa, onlar bir çift olarak birlikte çıkartılabilir. Son olarak, &quot;sap&quot; hücreyi teşrih. </li><li> Steril olan blastomer (veya blastomer çifti), Pick up, Cam Pasteur pipeti, hava kabarcıkları ve aşırı emme kaçınarak. Pipet hücrenin zarar verebilir keskin kenarları kaldırmak için yangın cilalanmış olabilir, ama rutin olarak bunu yapmayın. Eksplant kültürünü çanak bir çukurda kültür ortamı yüzeyinin altında Pasteur pipet ucu yerleştirin, yavaşça blastomerli çıkarmak. Bu yerçekimi tarafından sığ bir depresyon içine girmelidir. Birden fazla embriyo aynı blastomerli tek bir eksplant olarak kombine edilebilir. </li><li> Diseksiyon çanak, tek-tek kalan embriyolar ile bu işlemi tekrarlayın. 10 embriyolar hakkında sonra, diseksiyon çanak hücresel enkaz dolu olacak. Bu durumda, yeni bir diseksiyon çanak değiştirin. </li><li> Tüm diseksiyonlar yapıldıktan sonra eksplantlar sığ çöküntü olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yavaşça% 70 etanol ile kurutuldu ve hava içinde sterilize edilmiş bir saç döngü ile depresyon içine itilebilir. </li><li> Son diseksiyonu yaklaşık bir saat sonra, enkaz kaldırma surrousteril, cam Pasteur pipeti ile iyileşti eksplantlar nding. </li><li> 14-20, Kültür eksplant plaka ° C kardeş, kontrol embriyoları içeren Petri kabı yanında. Kardeş embriyoların blastomer eksplant gelişme aşamasında gösterecektir. </li></ol> 4. Analiz için Hasat eksplantlar <ol><li> Kardeşler istenilen gelişim aşaması ulaştığınızda eksplantlar Hasat. Bazı hücreler parçalanır bile bu eksplantlar oldukça iyi hayatta. Kültür bulutlu bir kitle de var ise, bu nedenle, sağlıklı bir eksplant içinde gömülü olup olmadığını belirlemek için bir saç döngüsü veya forseps ile keşfedebilirsiniz. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti ile kültür çözeltisi küçük bir hacimde eksplantlar Pick up ve hafifçe yapılacak test için uygun bir sabitleştirici veya lizis tamponu içine atmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bireysel blastomer başarılı yetiştiricilik için en kritik adımlar şunlardır: 1) doğru ilgi blastomer belirlemek; gerekli manuel geliştirilmesi ve 4), steril, sağlıklı kültürü koruyarak 2), 3) hücre döngüsünün doğru kısmında diseksiyon hücreleri Diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek ve iyi kültürünü aktarmak becerisi. Belirli blastomer işlemek için, kardinal eksenler tespit edebilmek için gereklidir. Xenopus embriyolarda, sırt tarafında üç yöntem ile belirlenebilir:, (2) in vitro boşaltma döllenmiş yumurta ve bir taraftan 18, 19 işaretleme, (1) bir boya hayati 18, 19 ile sperm giriş noktası işaretleme ya da (3) birinci bölünme karık hayvan yarımküre 20, 21 içinde hafif renkli bölge ikiye böler olan 2-hücre aşaması sırasında embriyolar seçilmesi. Biz doğru doğal fertiliz gelen blastomer tanımlayan üçüncü yöntemini kullanabilirsinized 16-hücreli durumlarda 20, 21 yaklaşık% 90&#39;ında embriyo. Döllenme anda, hayvan yarımkürede pigmentasyon dorsal hayvan bölgenin embriyoların çoğunluğu (Şekil 1) daha az pigmente olmasına neden olan ventral tarafta sperm giriş noktasına doğru kasılmaya başlar. Kavramalar genelinde ve hatta Xenopus yumurta kavramalar içinde bu hafifçe pigmentli bölgenin ölçüde önemli farklılıklar vardır. Birinci bölünme karık eşit olarak iki yavru hücreleri arasındaki bu açık alan ikiye böler, daha sonra daha açık bir alan sırt tarafında bir göstergesi olarak kullanılabilir, ve birinci bölünme karık orta sagital gösterir ki. İlk bölünme karık bir karanlık hücre ve bir ışık hücreye kızları ayıran ise daha sonraki aşamalarda pigmentasyon doğru dorsal tarafına tespit olmaz çünkü, eksplant için bunu kullanmıyorum. Önceki çalışmalar, embriyolar, bu tür bir ilk bölünme karık t için bir işaretleyici den az olduğu görüldühafifçe pigmentli bölgede ise o mid-sagital düzlemde artık sırt tarafında 20, 21 gösterilir. Birinci ve ikinci bitkisel kutupta oluklar zaman embriyolar aynı zamanda hücre bölünme 4-(Şekil 2B, sol embriyo) &#39;nin ilk bölümünde seçilebilir yine de ayırt edici olabilir; birinci tam karık olması ve ikinci karık değil Henüz tamamlayın. Bununla birlikte, bir embriyolar (Şekil 2B&#39;de doğru embriyo) seçmek üzere 4-hücreli evre sonuna kadar bekler ise, birinci ve ikinci yarılma artık ayırt edilebilen çizilerde ve yaklaşık olarak hafifçe pigmentli hücrelere sırt de görülebilir embriyolar, 20, 21 ve 70%. Bu çok daha az hassas belirli blastomer hedefleme verecek. Bu, ilk olarak bölünme karık hafif renkli bölge ikiye böler olan embriyoların yüzde kavramalar arasında büyük bir farklılık olduğunu belirtmek gerekir. Bizim tecrübelerimize göre onlar 80 &lt;bir debriyaj yumurtaların% 50&gt; açıklayabilirizBurada bir kavrama olarak yumurtaların%. Ne olursa olsun, hemen her zaman bir eksplant denemeyi desteklemek için bu ölçütü karşılayacak sağlıklı yumurtası içinde yeterli yumurta vardır. Önerilen iki kültür ortamı (MMR, MBS) neredeyse birbirinin yerine, farklı laboratuvarları tercihleri ​​çok tarihsel vardır. MMR bir yıl veya daha uzun bir 10X çözüm olarak saklanabilir. Bu bikarbonat ile tamponlanmış olmasıdır MBS kısa bir raf ömrüne sahiptir. Embriyo ve eksplantlar koruyucu jöle ve vitellin zarı olmadan bakteriyel enfeksiyon yenik düşer Çünkü, forseps ve kültür ortamı steril olmalıdır. Eksplantlar iyi hayatta yoksa, antibiyotik kültür ortamı (örneğin,% 0.1 gentamisin) ilave edilebilir. Gentamisin ve böylelikle kısa depolama ömrü var ve içeren Çözümleri onlar kullanılacak gün taze yapılmalıdır. Hücresel enkaz korumasız eksplantlar zarar verecektir proteazlar içeren ve bakteriyel büyümeyi destekler. Bu nedenle, bu remo olmalıdıreksplantlar iyileşmek için bir şans vardı sonra kültür kuyulardan ved. Blastomerlerin diseksiyonlar hücre-hücre adezyon gücünü azaltmak için seyreltilmiş kültür vasatı (0,1 X MBS ya da 0,1 X KKK) içinde gerçekleştirilir. Xenopus bölünme aşamalar sırasında, hücre yapışma çoğunlukla calcium-/magnesium-dependent kaderinler gerçekleştirilir. Bu nedenle, enzimatik ayrışma kullanmak gerekli değildir, kader tayin olaylarda önemli olabilir yüzey proteinleri kaldırır çünkü aslında bu kaçınılmalıdır. Yumurta farklı serilerden embriyonik hücreler farklı güçleri ile bağlı olduğundan, diseksiyon orta seyreltme ad hoc olarak ayarlanması gerekebilir. Hücreleri onları yırtmadan teşrih için çok yapışık ise, 0,1 X dan aşamalı diseksiyon orta konsantrasyonunu düşürmektedir. Hücreler vitellin zar çıkarıldığında çökmeye ve çok sızdıran ise tersine, dissectio konsantrasyonunu arttırmakkademeli n orta. Hücre kültürü kuyuları aktarmak için çok kırılgan hale Ancak, calcium-/magnesium-free ortam kullanmayın. Hücre döngüsü sırasında bir teşrih gerçekleştirdiğinde blastomerlerin başarılı bir şekilde ayrılması da bağlıdır. Şekil 2 &#39;de gösterildiği üzere, ilk olarak hücre döngüsü bölünme oluklar sığ ve blastomerlerin düzleştirilir. Daha sonra döngüsünde dilinim oluklar derin ve hücreler daha yuvarlanır. Erken hücre döngüsü, kırık varsa sitoplazmik sızıntıya neden olur sitoplazmik köprüler vardır. Bu yüzden, hücreler daha kolay bir şekilde hücre döngüsünün sonunda disseke edilir. Her aşamasında 4 hücreli embriyo 8 hücreli embriyo ve bitkisel hücrelerin sitoplazmik köprüler uzun sürüyorsa, çünkü incelemek zordur. Bir makul bir örneklem büyüklüğü kurtarmak daha diseksiyonları gerçekleştirmek için bir ihtiyaç, yani bu eksplantlar için yüksek bir ölüm oranı tahmin edebilirsiniz. Bir disse başlamak için sonraki bölünme karık başlangıcına kadar bekleyebilirsitoplazmik köprüler kapalı olmasını sağlamak için bu hücreler şeklinde gösterilmektedir. Tek blastomer 8 alınan ederken - ve 16-hücreli embriyo bizim deneyim, kültür de hayatta yaşlı blastomer az iyi tek hücre şeklinde geridedir. Biz bunun nedenini bilmiyorum rağmen, eski blastomer eksplant hayatta tek bir kültürü de 10, 13, 14, farklı embriyolar ve kültür onlardan aynı blastomer arasında (2-6) birkaç diseksiyon tarafından geliştirilebilir. Bu prosedür, uygulama ve bazı el becerisi gerektirir. Dilinimleri arasındaki zaman sıcaklığa bağlı olduğundan, bölünme yavaşlatmak ve daha fazla zaman diseksiyonları gerçekleştirmesine izin vermek için 14-16 ° C&#39;de embriyo saklamak için uygundur. Ancak, embriyo 14 ° C&#39;den düşük sıcaklıklarda tolere etmeyeceğini Bu prosedürde ilk zorluk vitellin membran kaldırıyor. Bunun ilk adımı hakim kadar blastomer diseksiyonu geçmek için iyi değildir. Diseksiyon zamanblastomer dışarı, &quot;sap&quot; hücre sızıntısı ve çökmeye muhtemeldir. Kez tüm diğer hücrelere istenilen hücreden soyulur, çünkü bu bir endişe değil, &quot;sap&quot; hücre forseps ile kaldırılabilir. Blastomerli (Şekil 3B) da kültür transfer olduğunda sap hücre kalıntıları gibi diğer artıkları genellikle uzağa düşer. Blastomer plastik heyecanla sopa, bu yüzden onlara aktarmak için yalnızca cam pipetler kullanın. Bu pipet içinde kesme kuvvetlerinden parçalanır, çünkü hücre üzerinde minimal emme basıncı kullanın. Ayrıca, pipet içinde hava kabarcıkları önlemek ve bir hava-su ara temas halinde hücreleri patlar, çünkü eksplant atılır zaman pipet ucu altında kültür ortamı yüzeyinde olduğundan emin olun. Protokolü Burada yetiştiricilik için eksplantlar ve basit tuz medya için bağışçı olarak ayarlanmamış embriyolar kullanır nitelendirdi. Bunlar bir ifade için eksplant içsel yeteneğini test etmek için izinÖzellikle kaderi ess. Bu yöntem, deneysel olarak iki şekilde genişletilebilir. İlk olarak, kültür ortamı, bu moleküllerin eksplant alternatif kaderi ifade neden olup olmadığını test etmek için sinyal / büyüme faktörleri ile takviye edilebilir. İkincisi, donör embriyoların gen ekspresyonu önceki blastomer diseksiyon özgü öncülerine mRNA&#39;ların (kazanç fonksiyon-) veya anti-sense morfolino oligonükleotidler (kayıp fonksiyon-) ya da enjekte edilerek değiştirilebilir. Bu 1-hücreli aşamada, ya da öncesinde diseksiyonu 1-2 hücre bölünmeleri bir daha hedefli bir şekilde yapılabilir. Bu yaklaşımlar ile, bir belirli bir dışsal gen verilen alternatif bir kader elde etmek için bir blastomerli neden olan ya da belirli bir endojen gen (örn., Şekil 4B) otonom kader ifade etmek blastomerli için gerekli olup olmadığını olup olmadığını test edebilir. Onlar diğer hücrelerin karıştırıcı etkisini ortadan kaldırmak ve ce sinyalizasyon çünkü bu güçlü deneysel yaklaşımlar bulunmaktadırnters sağlam embriyonun mevcut.

Xenopus laevis embriyoların yumurta mikrocerrahi yaklaşımları izin verecek kadar büyük olduğundan embriyonik hücreler kendilerine özgü kaderi elde hangi mekanizma tanımlamak için yaygın faydalanılmıştır. Her bir hücre, bir iç enerji deposu sağlayan sarısı trombosit açısından zengin hücre içi kaynağı ihtiva eder çünkü Ek olarak, kültür ortamı besin takviyesi için gerek kalmadan dıştan gelişir. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - kaderin hücre belirlenir hangi mekanizma ile çalışılması için önemli bir varlık (32-hücre aşamaları den 2) bölünme aşama blastomerlerin kader haritaları kapsamlı bir kümesidir. Bu haritalar, tek bir tanımlanabilir blastomer içine saptanabilir molekülü microinjecting ve dokuların etiketli soyu tarafından doldurulur hangi sonraki gelişimi izlenerek inşa edilmiştir. Embriyoların kardinal eksenleri güvenilir birçok Embry tespit edilebilir, çünkü tutarlı kaderi haritalar mümkündüros. Bitkisel yarımkürede değil iken Öncelikle, tüm yabani tip embriyolar hayvan yarımkürede, pigmentli olduğunu. İkincisi, döllenme de sperm girişini geleceğe ventral tarafta doğru hayvan yarımkürede pigmentasyon bir kasılma neden olur; birçok embriyo bir pigmentasyon farklılığı dolayısıyla dorsal ve ventral taraf arasında ayırımcılık kullanılabilir. Üçüncüsü, ilk bölünme karık böylece orta sagital en embriyolarında düzlem ve embriyonun sağ ve sol taraf tanımlamak için kullanılabilir yaklaşır. Kaderi haritaları da doğal embriyo büyük bir nüfus üzerinde her blastomer tanımlanabilir yapmak düzenli desenler yumurtaları sık çatlatma döllenmiş gerçeğine dayanmaktadır. Içinde tarif ve seçim yöntemleri kullanarak, pigmentasyon ve yarılma desen ile ilgili olarak yumurta kavramalar arasında değişkenlik olsa da, burada belirtilen akibetlerini hücrelerin yaklaşık% 90 doğruluk ile tespit edilmesini sağlar. Hücre kaderi caydırmak olabilirçeşitli mekanizmalarla embriyogenez sırasında mayınlı. Böyle ayirt kalıtsal sitoplazmik mRNA veya protein gibi içsel faktörler, erken desenlendirme çeşitli yönleri katkıda bulunur. Örneğin, belli mRNA&#39;ların anne hücreleri, mikrop hattı katkı endoderm olmak, ya da vücut dorsal eksen (7 te gözden geçirilmiştir) katkı olduğu. Embriyonik bir sinyalizasyon merkezine daha uzak komşu hücreler veya yerel olarak sağlanan dış faktörler, spesifik doku tipleri ve desenlendirme hemen her organ sistemini indükleyen sorumludur. Sinyalizasyon merkezleri örnekleri nöral ektoderm ve desenler mezoderm indükler gastrula içinde organizatör / düğüm ve aktivite kutuplaştırıcı bölgesini içeren ekstremite tomurcuğu modellerini ön-arka eksen. Kader haritalar farklı organların öncüleri belirlemek ve normal embriyo onların torunları tarafından alınan gelişimsel yolu açığa karşın, intrinsik ayırt edemezve bu hücreler üzerinde dışsal etkiler. Onlar da soyundan embriyonun karmaşık sinyal ortamında farklılaştırmak bir hücre, tam gelişim potansiyelini açığa vurmam. Kültür ardından embriyodan hücre alınması ya da 2), yeni bir embriyo konuma) 1 hücre transplantasyonu: İki deneysel yaklaşımlar, hücrenin kaderini intrensek faktörler tarafından belirlenir veya sonradan dış faktörden etkilenen olup olmadığını test edebilirsiniz eksojen sinyallerin yokluğunda. Hücreler elle ayrılması için yeterince büyük olduğundan hem deneysel yaklaşımlar Xenopus uygulanabilir olmuştur. Örneğin, çok sayıda çalışmalar (7 yorumlanan 8, 9) kader değişiklikleri test etmek için ana embriyolarda romanı yerlere embriyolar (hücre-hücre etkileşimleri değiştirmek için) veya nakledilen hücrelerin tek hücre sildiniz. Buna ek olarak, embriyonun farklı bölgelerinde hücreleri az sayıda eksplante yılının ikinci yaklaşımı iXenopus embriyo hücrelerinin hücre içi bir besin deposu, yumurta sarısı trombosit ile doldurulmaktadır çünkü dış faktörler yokluğunda indüktif doku etkileşimlerinin aydınlatmak için nto kültür mümkündür. Bu nedenle, kültür ortamının veya besin takviyesi büyüme faktörü olmadan belirli bir tuz ortam içinde bir kaç gün kültive edilebilir. Biz dorsal hayvan blastomer maternal kalıtım mRNA&#39;ların 10, 11 bağlı sinir ve dorsal mezodermal dokular üretmek için özerk bir yeteneği var, ve diğerleri 32-hücreli blastomer bu mezoderm özellikleri içsel ve dışsal bilgiler 12 hem dayanmaktadır gösterdi göstermek için bu yaklaşımı kullanmış . Eksplant olarak kültür hücrelerinin bir avantajı da orta eksplante hücre 12, 13, 14 kaderi etkileyebilecek olan hücre-hücre iletişim yolu belirlemek için tanımlanmış sinyal faktörleri ile takviye edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, bir tane blastomerli pr enjekteendojen mRNA&#39;ların çevirisi önlemek için aşırı ekspres bir gen veya anti-sense oligonükleotidlerle için mRNA ile kültür IOR. Bunlar, kazanç ve kayıp fonksiyon-analizler molekülleri özerk ifade kaderi için gerekli olan belirleyebilirsiniz. Eksplant kaderini analiz etmek için, spesifik hücre tipleri kimlik standart gen ifadesi (örneğin, in situ hibridizasyon, RT-PCR) ve immünohistokimyasal analizleri ile gerçekleştirilebilir. Bu protokol bir embriyonik hücre spesifik dokularda gelişir nasıl düzenleyen içsel ve dışsal mekanizmalar arasındaki ayrım basit ama güçlü bir yol sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Alümina aşındırıcı filmi </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> # 6775E-38 </td><td> Forseps ipuçları büyük tamiratlar Kursu (12 mikron), </td></tr><tr><td> Alümina aşındırıcı filmi </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> # 6775E-46 </td><td> Forseps ipuçları keskinleşmesi ince için Orta (3 mikron), </td></tr><tr><td> Alümina aşındırıcı filmi </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> # 6775E-54 </td><td> Forseps ipuçları parlatma için Güzel (0.3 mikron), </td></tr><tr><td> Forseps: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> # 11252-30 </td><td> Bu ilk satın aldığınız bilenen gerekmez ince ipuçları var. Korozif dayanıklı onlar öylesineotoklavlanabilir. </td></tr><tr><td> Gentamisin çözümü </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Kullanımı gibi aynı gün orta ekle </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Embriyonun hücrelerinin tüm takip soyundan inşa Kader haritalar, dokuların embriyonun her hücre soyundan olduğunu ortaya. Kader haritaları bir organın öncüleri belirlenmesi için ve alt hücrelerinin, normal olarak embriyo bu organ doldurmak hangi gelişim yol ortaya çıkması için çok faydalı olmasına rağmen, bir öncü hücre tüm gelişim potansiyelinin veya göstermektedir mekanizmaları tespit olmayan hangi onun kaderi belirlenir. Hücre kaderinin bağlılığı test etmek için, tek bir deneysel manipülasyon sonrasında ifade olanlarla sağlam embriyonun (kaderi harita) in soyundan bir hücrenin normal repertuarı karşılaştırır. Hücrenin kaderini çevreleyen hücresel ortamı ne olursa olsun (kararlı) sabittir, ya da komşuları tarafından sağlanan dış faktörler tarafından etkilenir? Xenopus embriyosunun kapsamlı kaderi haritaları kullanarak, biz nasıl belirleneceği açıklanmaktadır, izole ve kültür tek klivaj dönemi öncüllerinin blasto denirMeres. Bu yaklaşım bir bu erken hücreler onların komşu hücreleri ile etkileşim gerektiren, sağlam embriyonun normal ortamda elde kaderi kararlıyız, veya sinyaller diğer türlerine maruz kalırsa alternatif kaderi ifade etkilemiş olup olmadığını değerlendirmenizi sağlar.

Doğru bir hücre gelişme potansiyelinin değerlendirmek için bu tahlil yeteneği kaderi haritalar 1, 2, 3, 4, 5, 6 göre dışarı doğru blastomerli kesme dayanır. Bu nedenle, daha sonra, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, normal bölünme desen ile uyumlu Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, 2 hücreli aşamada doğru pigmentasyon deseni ile embriyolar seçmek çok önemlidir. Kimse onlar gerekli bölünme aşamasına ulaşıncaya kadar kriteri embriyolar gözlemler ve düzensiz dilinimleri gösteren embriyolar dışarı ayıran ise, doğruluğu büyük ölçüde artırıldı. Şekil 2 de gösterildiği gibi, normal dilinimleri genellikle sadece embriyo bir tarafında meydana gelir. Donör hücre &quot;normal&quot; yan kaynaklanıyorsa bu embriyolar vericisi olarak da kullanılabilir. Eğer incelemek niyetinde düzenli bölünme desenleri birçok embriyo olarak yaklaşık beş kat hücre bölünmesi ilerledikçe, tür olarak daha az embriyo bulunur çünkü. Doğal fertilized yumurta in vitro döllenmiş yumurta içinde daha düzenli yarık sahip olma eğilimindedir. Dilinim desenleri yumurtaları tek bir kavrama içinde büyük farklılıklar olmasına rağmen, en az bir 10-20% bir manipülasyon bu tür için yararlı olmasını bekleyebilirsiniz. Blastomerlerin tek başına ya da küçük gruplar halinde kültüre edilebilir. Blastomer ilk (Şekil 3A) disseke ve iyi kültürü (Şekil 3B, C) ​​transfer edilir, onlar yumuşak ve kırılgandır. Bizim tecrübelerimize göre, hayvan ve ekvatoryal blastomer bitkisel blastomer (Şekil 3C) daha incelemek daha kolay ve kültürü vardır. Küçük oldukları Belki, çünkü onlar aktarmak kolaydır. Onlar da forseps ile çentikli zaman daha hızlı iyileşecek gibi gözükmüyor. Bitkisel hücreleri genellikle parçalanmış zaman onları daha &quot;geçirgen&quot; hale, daha yavaş ve dolayısıyla sitokinez tamamlamak kardeş hücreler sitoplazmik köprüler korumak gibi görünüyor, ve onların hücre zarı hasarına daha kırılgan ve daha kolay.Kültür içinde yaklaşık 1-2 saat sonra, eksplante blastomerli (s) yaklaşık 4 kez bölünmüş ve hasarlı komşu hücreler (Şekil 3D) kalan kalıntıların en dökülür olacaktır. 20 saat sonra, hücreler, küçük sağlam bilyalar (Şekil 3E) oluştururlar. Bazı enkaz gömülü olsa da, çoğu zaman sağlıklı bir kitle (Şekil 3E, sol) bulunabilir. Eksplantlar küçük olmasına rağmen, bunlar daha sonra bir gen ekspresyonu izlemesini sağlar in situ hibridizasyon gibi daha sık kullanılan hayvan kap eksplantlar bölgesi için işleme hayatta. Şekil 4A gösterilen deneyde, iki dorsal blastomer (D1.1) veya iki ventral blastomer (V1.1) 16-hücreli aşamada diseke edildi ve 14 yaşında 1X MBS kültürlü ° C kardeş embriyoların erken nöral plakayı aşamalarında ulaşıncaya kadar (ST12-13; kesme sonra yaklaşık 20-22 saat). Her numune zigotik nöral plak geni (sox2 ifadesi için test edildi &lt;/ Em&gt;) in situ hibridizasyon ile (mavi reaksiyon ürünü). Bu testte nöral plakayı öncüleri olan dorsal hayvan blastomer, çoğunluğu embriyonun diğer bölgelerden ilave sinyal olmadan, yani özerk sox2 ifade edebilirim olduğunu gösteriyor. Sox2 ifade yok bu eksplantlar yanlış diseksiyonu sırasında tespit edilmiş olabilir. Buna karşılık, ventral epidermis, açık sox2 öncüleri olan ventral hayvan blastomerlerin, hiçbiri. Böylece, ventral hayvan blastomer yok ise dorsal hayvan blastomer, nöral doku oluşturmak için içsel bir yeteneğe sahip olduğu sonucuna varıldı. Unutmayın D1.1 eksplantlar bazıları da, dorsal mezoderm oluşumu göstergesi bir morfoloji eIongated var; bunlar blastomer de sağlam embriyonun 3 Notokordun oluşturmak için kaderde olup, eksplant kültür ekspres bir Notokordun işareti protein 10. Blastomer intrinsik kaderi altere olabilir<html> önceki mRNA&#39;ların mikroenjeksiyon (kazanç fonksiyon-) veya anti-sense morfolino oligonükleotidler (; kaybı fonksiyon-MOs) tarafından d. Şekil 4B, bir anneden ifade sinir geni, foxD5 16, 17, endojen düzeylerini değiştiren etkisi test edilir. FoxD5 endojen düzeyi V1.1 (alt sıra) 8 hücreli habercisi blastomer içine foxD5 mRNA enjekte ederek artırırken, V1.1 eksplantlar çoğunluğu (st 12-13 kültüre) sox2 dile getirdi. Tersine, FoxD5 endojen düzeyi D1.1 (üst sıra) 8 hücreli habercisi blastomer içine MOs enjeksiyonu ile azaltılabilir zaman, D1.1 sadece birkaç eksplantlar (st 12-13 kültüre) sox2 (karşılaştırmak ifade Şekil 4A üst satır). Bu deneyler foxD5 arasında maternal ifade eden sinirsel bir kaderi elde etmek için dorsal blastomer içsel yeteneği bir rol oynadığını göstermektedir. ftp_upload/4458/4458fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;/&gt; Şekil 1. Doğal döllenmiş yumurta 2 hücreli embriyolar Pigmentasyon desenler. İlk bölünme karık bir ok ile gösterilir. A) embriyonun hayvan yarımkürenin hafifçe pigmente bölgede bir hücre (solda) çoğunlukla bulunduğu için, daha sonraki aşamalarda blastomer tanımlamak için kullanılmaması gerektiğini bir embriyo bir örnek. İlk bölünme karık embriyonun orta sagital düzlem öngörür yana, bu embriyonun hafifçe pigmentli bölgede dorsal tespit olmayacaktır. B) embriyoların iki örnek olduğunu eksplant kültürleri tasnif edilmelidir. Her ikisinde de, hayvan yarıküre (*) arasında hafif renkli bölge birinci bölünme karık örtülmüş edilir. Soldaki ilk embriyo hücre döngüsünün başında, ve hafif renkli bölge, hücre yüzeyinde yaklaşık% 25 olarak görülebilir. Sağdaki embriyonun ilk hücrenin döngüsünün sonuna yaklaştığını ve pigment ve taşındıntrally böylece iki hücre dorsal yarısının daha hafiftir. Sonuç olarak, daha sonraki aşamalarda hafifçe pigmentli hayvan hücreleri dorsal (d) tahmin edecektir ve koyu pigmentli hayvan hücreleri (v) ventral tahmin edecektir. <img src="/files/ftp_upload/4458/4458fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Doğal döllenmiş yumurtalardan bölünme aşamasında embriyo örnekleri. Tüm embriyolar üst dorsal okuyucu, bakan hayvan kutup odaklı. A) 4-hücreli embriyo. Dilinim sığ oluklar böylece soldaki embriyo sadece ikinci hücre döngüsü girmiştir. Bölünme derin ve hücrelerin daha yuvarlak görünmesini oluklar yüzden sağda embriyo neredeyse ikinci hücre döngüsünü tamamladı. Siyah oklar ilk bölünme karık gelin ve kırmızı oklar ikinci bölünme karık işaret. B) 8 hücreli embriyolar. Soldaki embriyonun erken üçüncü hücre döngüsü olduğunu ve sağdaki embriyo yakınÜçüncü hücre döngüsünün sonu. C) 16-hücreli embriyo. C &#39;kaçınılması gereken düzensiz yarılmış bir örnektir. C &quot;ön yüzünde düzenli yarılmış bir örnek, ancak sırt tarafında düzensiz. C&#39;&#39; &#39;sırt tarafında daha düzenli yarılmış bir örnek, ancak ön yüzünde. C&#39;&#39;&#39;&#39; bir örnektir orta hatta normal yarık arasında, ancak yanal. D) 32-hücreli embriyo. D &quot;ön yüzünde düzenli yarılmış bir örnek, ancak sırt tarafında düzensiz. D&#39;&#39; sırt üzerinde düzenli yarılmış bir örnektir yan, ancak ventral tarafta. D&#39;&#39; &#39;sağ tarafta düzenli dilinimleri bir örnektir, ama sol tarafta daha düzensiz bölünmelere. E) 64 hücreli embriyo. Bu aşamaların şematik için, bakınız (on-line bulunabilir Nieuwkoop ve Faber evreleme serisi, <a href="http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do" target="_blank">http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do</a> ). Şekil 3. Doğal döllenmiş yumurtalardan 16-hücreli embriyo gelen Eksplantlarından. Kısa diseksiyon sonrası A) ventral hayvan blastomer. Ok &quot;sap&quot; hücre kalıntıları gösterir. B) Bir ventral hayvan blastomer kez bölünmüş bir kültürün de aktarılır. Kısa bir süre sonra diseksiyon C) A ventral bitkisel blastomer. Hayvan blastomer ile karşılaştırıldığında, bu büyük ve manipüle etmek daha zordur. D) İki ventral hayvan blastomer eksplantlar, diseksiyon sonrası 2 saat, dört kez bölünmüş var. Sol eksplant blastomerli orijinal pigmentli, dış yüzeyinden görülmektedir; doğru eksplant blastomerli orijinal, unpigmented iç yüzeyinden görüntülenmektedir. E) İki ventral hayvan blastomer eksplantlar 24 saat süreyle kültüre. Sağ eksplant herhangi detritus ücretsiz iken sol eksplant hücresel enkaz (oklar) bir yatakta oturuyor. Tüm görüntüler 50X Magnificat altındadıriyon. <img src="/files/ftp_upload/4458/4458fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/4458/4458fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Doğal döllenmiş yumurta diseke 16-hücreli blastomer türetilen eksplantlar gen ifadesinin situ hibridizasyon analizi. A. Soldaki 16 hücreli embriyo sonuçlar için eksplante edildi dorsal blastomer çifti (D1.1) göstermektedir üst satır ve alt satırında sonuçları için eksplante edilmiştir ventral blastomer çifti (V1.1). Uninjected embriyolardan Dissected blastomerli çiftleri kültür kuyularının içinde 0,1 X MBS yerleştirilmiş ve yaklaşık 20 saat süreyle 14 ° C&#39;de inkübe edildi. Onlar sabitleştirici bir tüpte toplanır ve bir zigotik nöral gen, sox2 ifadesi için in situ hibridizasyon tarafından işlenir. 8-hücreli dönem embriyoların B. blastomer bilateral ya enjekte edildi edildiventral blastomerlerin endojen ekspresyonu artırmak için dorsal blastomerlerin, ya da foxD5 mRNA ile endojen ifade azaltmak için foxD5 MOS, ile. Enjekte edilen embriyolar 16 hücreli evre (20-30 dakika sonra) ulaştığı zaman, blastomer çiftleri A gibi in situ hibridizasyon tarafından disseke kültüre ve analiz edildi. Ekspres sox2 anlamlı foxD5 MOs (Bir üst satıra karşılaştırın) enjekte edildi D1.1 eksplantlar azalmış olduğu eksplant sayısı. Ekspres sox2 anlamlı foxD5 mRNA (A alt satır karşılaştırmak) enjekte edildi V1.1 eksplantlar arttığı eksplant sayısı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4458/4458fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

15.2K Görüntüleme.  The George Washington University. Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Video: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

This video demonstrates two methods for preparing and placing beads, which have been coated with growth factor, on explants of the developing cerebral cortex. These beads can be used to induce spatially restricted gene expression on developing neural tissue such as forebrain explants. Methods are given for using both Affi-Gel beads and heparin acryllic beads.

Dorsal önbeyin eksplantlar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk Yerleştirme

Biyoloji

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Ole Isacson: Parkinson Hastalığı İçin Yeni Tedaviler

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...