Bu araştırma projesi bir ARRA Ek, 5 R01 NS056380 tarafından desteklenmiştir. Ek destek Viral vektör Core ve Emory Nörobilim NINDS Çekirdek Hizmetleri hibe, P30NS055077 en Mikroskopi Çekirdek ile sağlanmıştır. Istikrarlı SSTR3-GFP IMCD3 hücre hattı için Greg Pazour,, Biz GENSAT gelen fare hattı türetmek için Emory Transgenik Fare ve Gen Hedefleme Çekirdek teşekkür ve Sstr3-GFP lentiviral için Bradley Yoder inşa. Monoklonal antikorlar NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından muhafaza edildi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.

Yetişkin fareler, mekanik servikal dislokasyon tarafından ötenazi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Embriyo Üretimi <ol><li> Çapraz Tamoksifen-indüklenebilir Cre çizgi, CAGGCreER ve dsRedCre muhabiri hattı (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Şekil 1) 5,6. Kızı hücreler, çapraz CAGGCreER ve Olig2-eGFP BAC transgenik farelerin (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Şekil 1) 7,8 ile DsRed doğrultusunda Sus yanıt göreli zamanlama izlemek için. </li><li> % 100 etanol tamoksifen çözülür ve Cre ifade ve hücrelerin bir kısmında DsRed etiketleme ikna etmek için embriyonik 6.5 (E6.5) hamile kadın içine vücut ağırlığı 40 g başına 2.5 mg tamoksifen intraperitoneal gerçekleştirin. </li><li> 48 saat sonra, embriyolar incelemek floresan mikroskop kullanılarak DsRed olumlu embriyolar tespit, kültür çanak aktarmak ve gözlemlerEx vivo görüntüleme sırasında E tek hücre bölünmesi (aşağıya bakınız). </li></ol> 2. Tüm Fare Embriyo Kültürü <ol><li> % 10 yeni doğmuş buzağı serumu ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) 9 ile desteklenmiş DMEM/F12 (1:1) içeren, önceden ısıtılmış yıkama ortamı içinde E8.5 embriyolar incelemek. </li><li> Doğrudan floresan mikroskop altında 37 ° C ısıtma sahnede diseksiyonu, yer embriyo sonra GFP ve / veya DsRed pozitif (bkz. aşağıda) olarak tanımlar. </li><li> Sonra bir L-glutamin ile takviye edilmiş fenol kırmızısı olmadan en az% 50 bir erkek Sprague-Dawley sıçan alınan serum ve% 50 DMEM/F12 (1:1) ihtiva eden önceden-dengelenmiş kültür ortamı 500 ul damla ve% 1 içine 2 embriyolar kadar veri transferi 0.85% NaCl ve P / S 9 1 M HEPES. </li><li> Buharlaşmasını önlemek ve kültür kabına 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör embriyolar içeren transfer ortamı üzerinden dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (0,1 cm) uygulanır. </li></ol> 3.Viral Enfeksiyon <ol><li> Nöroepitelyumda etiket kirpikler amacıyla, bir E8.5 embriyo içeren kültür ortamı içinde bir 500 ul dengelenmiş bir düşüş Sstr3-GFP lentivirüs 5-10 ul, yaklaşık 2.000.000 virionlar ekleyin. </li><li> Kültür 18 saat sonra, virüs yıkayın ve nöral tüp dilim hazırlamak için yıkama orta birkaç damla içine enfekte embriyo transferi. </li></ol> 4. Canlı Görüntüleme Nöral Tüp Dilim Hazırlık <ol><li> % 1 agar kaplı çanak, bir mikro-bıçak boyutu 0.025 mm kullanarak önceden ısıtılmış yıkama ortamda E8.5 embriyo nöral tüp parçalara ayır. </li><li> 35 mm poli-L-lisin kaplı cam alt çanak fenol kırmızısı olmadan dengelenmiş kültür ortamı bir 150 ul damla izole nöral tüp ventral yüzü aşağı yerleştirin. </li><li> Için cam lamel dar bir parça% 100 saf vazelin ve monte nöral tüp etrafında erimiş mum (IKEA mum), ve hafifçe basın yapılmış 1:1 karışımının az miktarda koyunörnek hareketsiz. </li><li> Dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (~ 0.1 cm) (Şekil 2) ile çanak Kapak. </li></ol> 5. Görüntüleme ve Time-lapse Konfokal Mikroskop Canlı <ol><li> Sıcaklık düzenleyen bir çevre odası ile donatılmıştır Konfokal Ters Mikroskop Tarama Nikon A1R Lazer altında yer çanak, 37 ayarlı ° C ve% 5 CO 2. </li><li> 40x yağ immersiyon objektif kullanımı Olig2-GFP ve DsRed pozitif hücreler izlemek için ise, GFP etiketli kirpikler ve DsRed pozitif hücreler kaydetmek için 60x yağ immersiyon objektif kullanın. </li><li> Zaman atlamalı görüntüleme koşulları kurmak için NIS Elements yazılımı açın. Her 10 dakika 1.5 mikron (40x objektif) ve 0.4 mikron (60x objektif) bir aralığı ile en fazla 8 mikron bir aralığı ile z-yığınları 25 mikron kadar kazanır. Gerekirse 488 ve 561 nm uyarma dalga boyları ve iletilen kanal kullanın. 512 x 512 boyutunda görüntüler elde. Int birden fazla kullanıcı tanımlı bölgeler kurmakerest aynı anda kayıt yapmak için. , Tarama hızı 1, çizgi ortalama 2 ve iğne deliği boyutu (61, görüntünün lazer gücü ve parlaklık için en iyi poz kullanımı düşük lazer yoğunluğu (4.5 kadar% EGFP 405/488 mCherry 561 için en fazla 11%) tarafından ayarlandı DsRed için mikron; Olig2 için 28.1 mikron, SSTR3GFP için 72 mikron, DsRed ve SSTR3GFP için 61.3 mikron, DsRed ve Olig2 için 58 mikron). Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanımı bize düşük lazer gücü ile parlaklık tespit sağladı. </li><li> Imaris 3D rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak kaydedilen verileri analiz. </li></ol> 6. İmmünofloresan <ol><li> Bir cam tabak içinde 1 saat boyunca buz üzerinde% 4 paraformaldehid / 0.1 M fosfat tampon (4 ° C) içinde izole edilmiş embriyolar ya da nöral tüp düzeltildi. </li><li> Örnekler buz üzerinde PBS 2 saat (4 ° C) (değiştir PBS birkaç kez) ve gece boyunca ya da embriyoların lavabo kadar% 30 sakaroz / 0.1 M Fosfat Tampon koymak yıkayın. </li><li> -80 Kuru buz ve mağaza ° C üzerinde, OCT dondurma Embed Pkriyostat (10 mm) üzerinde kesit erform. </li><li> % 1 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu ihtiva eden yıkama çözeltisi içinde 10 dakika karıştırıldı ve PBS içinde% 0.1 Triton X-100 için slayt yıkayın. </li><li> Konsantrasyonlarda takip de yıkama çözeltisi içinde primer antikorlar inceltilir Rat monoklonal anti-RFP (5F8,) 1:200; Tavşan anti-Arl13b serum 1:1500 ve fare monoklonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Tavşan anti-Olig2 1:300; Fare monoklonal Pax6, Şşş ve Nkx2.2-tüm 01:10 ve Ki67 1:500 poliklonal Tavşan. Düz nemlendirilmiş bir odasında slayt başına 150 ul yaklaşık ekle, kurumasını önlemek ve 4 gece boyunca terk ° C&#39;ye parafilm kapağı </li><li> Üç kez, 20 dakika, her zaman oda sıcaklığında yıkama çözeltisi içinde slaytlar yıkayın. </li><li> 1:200 konsantrasyonda yıkama çözümleri sekonder antikor Alexa Fluor 488, 568, 350 sulandırmak. Çekirdekleri leke Hoechst 1:3,000 veya TO-PRO-3 1:500 kullanın. Slayt başına 150 ul, ışıktan koruyarak, nemlendirilmiş bir odasında, oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> Yıkama solüsyonu tw slaytlar yıkayıno zaman, oda sıcaklığında 30 dakika, her zaman. </li><li> Dağı 24 saat içinde Altın anti-solmaya reaktif ve görünüm uzatmak% 80 kayar. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube:+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate.">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li><li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons:+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube.">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li><li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube.">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li><li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors.">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li><li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+red:+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells,+embryos,+and+adult+animals.">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li><li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre:+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation/inactivation+in+the+mouse.">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li><li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li><li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olig2++neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo.">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li><li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response.">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), (2012).</li><li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy.">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim ex vivo sistem bize doğrudan gerçek zamanlı olarak gelişmekte neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek sağlar. Örnek olarak fare embriyonik nöral tüp içinde hücre bölünmeleri incelenmiş ve kirpik oluşumu veya Sus yanıt ya izlenir. Biz teknik fizyolojik ilgili verileri sağlar gösteren sabit bölümleri (n = 178) sonuçları ile uyumlu idi bizim görüntüleme sonuçları (n = 24) doğruladı. Bizim teknik tamoksifen dozu kesin olmalıdır kadar Cre indüksiyon hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı olmak dayanır. Biz tek hücre etiketleme için dozaj çalıştım. Biz tamoksifen 6 için bir doza bağlı cevap gösterdi CAGGcreER çizgi, ilk analizine dayalı doz hafif bir artış ile hücrelerin küçük klonlar etiket kolay olacağına inanıyorum. Koşullar kapalı ise anormal gelişimi oluşur Buna ek olarak, embriyo kültür koşulları, kritik öneme sahiptir.Biz geliştirme en az 36 saat 11 için çalıştığı biliniyor kullandığımız kültür koşulları altında normal devam doğruladı. Kullandığımız indüklenebilir Cre ve Cre muhabiri hatları kamuya mevcuttur kadar kolay sorular çeşitli araştırmacılar için bu tekniği oldukça uyarlanabilir hale elde edilebilir. Bizim teknik gerçek gücü genetik olarak tek hücre etiketleme, bizim yaklaşım birçok mevcut ve gelecekteki mutant fare hatları tek hücre davranışını sorgulamak için kullanılabilir olmasıdır. Bu gerçekten gelişimi sırasında memeli embriyo içindeki hücrelerin doğrudan gözlem olarak bu satırları çok yanlış gidiyor kapsamlı incelenmiş değil ne anlamada önemli olacaktır. Düşük lazer gücü ile parlaklık tespit etmek için genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Bizim incorporaton bu gözlem için gerçek bir avantaj sağlar. Bu özel hücre organelleri işaretleme floresan etiketli proteinlerin veya diğer tr tahmin etmek zor değilanscriptional gazetecilere gelecekte entegre olma. Biz birincil kirpik oluşumu ve bir bölme hücrenin kızı hücrelerinde Sus yanıt göreli zamanlama ilgilenmişlerdir. Ancak, bize Şşş yanıt izlemek için etkin transgenik hat aynı hücre birincil kirpik, Sstr3-GFP işaretleyici görmemizi engelleyen, sitoplazma boyunca Olig2-eGFP dile getirdi. Böylece, büyük bir nükleer kısıtlı Olig2-eGFP veya spektral ayrı Sstr3 floresan proteini füzyon ya yararlanmış olacaktı. Hedefli ve transjenik kullanılmasına ek olarak, bizim tekniği viral yapıları kullanılarak adapte ve kültür epitele bulaşmasını yararlı veri sağladığı edilebilir olduğunu gösterdi. Bu genetik olarak değiştirilmiş bir fare hattı üretimi daha hızlı bir yöntem sağlayan araştırmacılar için yararlı olacaktır. Ayrıca, yaklaşım, bir hattın nesil doğrulamak için, gerçekten, bizim veri bir trans iddiaSstr3-GFP ifade genic hattı alanına büyük kullanım olacaktır. Bizim yöntemi alanında daha hemen hücre davranışlarını izlemek hangi ile araçlar sağlar. Fare mutantlar zengin kaynaklara birleştiğinde bu yöntemi yerinde hücresel davranışları bir dizi inceleyerek özellikle güçlü olmasını bekliyoruz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td>
			<td>MMRRC,</td>
			<td>010555-UCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAGGCreER</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>003724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-416F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum SD male</td>
			<td>Harlan Bioproducts</td>
			<td>4520</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Hepes</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>17-737E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sstr3-GFP lentivirus</td>
			<td>Emory Viral Core</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife, size 0.025 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% petroleum jelly</td>
			<td>Kroger</td>
			<td>FL9958c</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 3D software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>Imaris 7.2.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated sheep serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210-072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td>Lab made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-RFP (5F8)</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>110411</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Arl13b serum</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonals Pax6</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>Pax6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonalsShh</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>5E1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonals Nkx2.2</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22989</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo live imaging of single cell divisions in mouse neuroepithelium

Biz floresan işaretleri ve embriyonik fare neuroepithelium kültür dilim canlı görüntüleme entegre bir sistem geliştirdi. Biz izleme soy genetik hücre için mevcut fare hatları yararlandı: Bir Tamoksifen-indüklenebilir Cre hattı ve Cre-aracılı rekombinasyon üzerine dsRed ifade eden bir Cre muhabir hattı. Tamoksifen nispeten düşük düzeyde kullanarak, bize tek tek hücre bölünmeleri takip etmek izin, hücrelerin az sayıda rekombinasyon neden başardık. Ayrıca, bir Olig2-eGFP transgenik çizgi 1-3 kullanarak Sonic Hedgehog (Sus) sinyal için transkripsiyonel yanıt gözlenen ve kirpikler işaretleyici, Sstr3-GFP 4 ifade virüs kültürlü dilim nüfuz ederek kirpikler oluşumu izlenir. Görüntü için neuroepithelium, biz nöral tüp izole, E8.5 embriyolar hasat, görüntüleme odasına uygun kültür koşullarında sinir dilim monte ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yapılır. Bizim eskiin vivo canlı görüntüleme yöntemi bize fizyolojik ilgili bir şekilde birincil kirpikler oluşumu ve Sus cevap göreli zamanlama değerlendirmek için tek bir hücre bölünmeleri izlemek için sağlar. Bu yöntem, kolayca farklı floresan işaretleri kullanarak adapte ve alanında yerinde ve gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını izlemek için hangi ile araçları sağlar olabilir.

Burada E8.5 fare neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri ex vivo canlı görüntüleme yapılır. Tek tek hücrelerin etiketlemek için, rekombinasyon 5,6 (Şekil 3A) üzerine dsRed dile bir Cre muhabir satır içeren bir hücre alt grubunda Cre recombinase bağlı. Böylece, 48 saat sonra biz ex vivo görüntüleme (Şekil 4A-D) sırasında tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek mümkün. 1-3; etiketli hücreleri BAC transgenik Olig2-eGFP hattı (Şekil 4G-N Şekil 3C-D) modifiye Sus transkripsiyonel muhabiri dahil ederek Sus-duyarlı olunca eş zamanlı olarak, biz takip. Kirpikler oluşumunu gözlemlemek biz kültüründe embriyo bulaştırmak için Sstr3-GFP lentivirüs oluşturulan (Şekil 3B, Şekil 4A-D) 4. İmmünofloresan in vivo sonuçları (Şekil 4E-F) olarak teyit amacıyla yapılmıştır. Zaman-turOlig2-eGFP ifade ya da in vitro kültür sırasında Sstr3-GFP lentivirüs ile enfekte dsRedCre muhabiri embriyoların E konfokal görüntüleme gözlem Şekil 5 10&#39;da gösterilmektedir. Biz kirpikler görselleştirmek için kullandığınız Sstr3-GFP ifade altta yatan herhangi bir biyolojik süreci ile müdahale değildi emin olmak için, biz sabit vahşi tip embriyo bölümleri ile canlı görüntüleme verileri teyit. Biz kirpikler oluşumu ve Sus yanıt olarak asenkroni aynı oranda bulundu Çünkü, bu SSTR3-GFP virüs bu süreçlerin (Şekil 5A) etkisi yoktu gösterir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4439/4439fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig1.jpg" /> Şekil 1. Fare neuroepithelium kullanarak ex vivo canlı görüntüleme işleminin akış şeması. Son fare çapraz ve tamoxifen tedavi tüm fare embriyo kültür metodu takip tasvir edilmektedir. Floresan etiketli proteinlerin ifade Embriyolar seçilen ve canlı görüntüleme için hazırlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4439/4439fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4439/4439fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig2.jpg" /> Şekil 2. Canlı görüntüleme için nöral tüp dilim hazırlık. A) hücre gruplarının çifti ilk görünümü ile E8.5 çevrilmemiş embriyo. B) önceden ısıtılmış orta disseke Nöral tüp bir mikro-bıçak kullanarak. C) Nöral tüp dilim üzerinde ventral yüzü aşağı monte edilir nöral tüp etrafında uygulanan ve yavaşça bir na kapsamında vazelin ve balmumu yapılmış bir karışımın poli-L-lisin kaplı cam alt tabak. D) az miktardacam lamel RROW parçası. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4439/4439fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/4439/4439fig3.jpg" /> Şekil 3,. Konfokal mikroskobu ile nöral tüp canlı hücrelerinde floresan etiketli proteinlerin görselleştirme. A) DsRed etiketleri tek tek hücreleri. Onlar formu (sarı ok başları) gibi birincil kirpikler olarak ifade B) SSTR3-GFP lentivirüs. CD) Olig2-GFP taşıyan E8.5 embriyo neuroepithelium içinde GFP ifade gösterir. Barı 30 um (A, B), 15 mikron olan (B) ve 1.5 um (° C). <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4439/4439fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig4.jpg" /> Şekil 4. Bölünme geçiren gelişmekte olan nöral tüp hücreler bölünerek izleme kirpikler oluşumu ve Sus sinyal. MS) Tek DsRed pozitif hücre önce diğer hücre (C, beyaz ok) bir kızı hücrede bir kirpik formları gösterir. Film her 10 dakikada bir kare oranında görüntülendi. EF) İmmünofloresan yeşil TTT (DsRed soy izleme için) ve kırmızı Arl13b (kirpikler için) karşı antikorlar kullanarak. Hoechst (F). GN) olmadan kutulu alanı (E), büyümesi DsRed pozitif hücre bölünmesi (IM) uğrar. Olig2-GFP yalnızca bir kız (J, K) olarak ifade edilir. Kayıt bir kare her 10 dk bir oranda görüntülendi. Bar 5 mikron (AD), 50 mikron (F), 25 mikron (GN) &#39;dir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in"fo: src = src = &quot;/ files/ftp_upload/4439/4439fig5.jpg&quot; / &quot;/ files/ftp_upload/4439/4439fig5highres.jpg&quot;&gt; Şekil 5,. Kirpikler ve Şşş görünümü ile DsRed pozitif hücre sayımı. Bölümü ve kirpikler lokalizasyonu geçiren DsRed hücre) sayısı. Canlı görüntüleme kirpikler oluşumu eşzamanlı oldu tarafından Sembol * anlamına gelir. B) DsRed ve bölünme ve Sus sinyalizasyon geçiren Olig2-GFP pozitif hücre sayısı.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium at JoVE.com

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Burada için gerekli araçları geliştirmek<em&gt; Ex vivo</em&gt; Canlı görüntüleme fare E8.5 neuroepithelium tek hücre bölünmeleri izlemek için

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

10.3K Görüntüleme.  Emory University School of Medicine. Burada için gerekli araçları geliştirmek Ex vivo Canlı görüntüleme fare E8.5 neuroepithelium tek hücre bölünmeleri izlemek için

Video: Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.