Bu çalışma Scott I. Simon ve Anthony G. Passerini NIH / NHLBI hibe R01 HL082689 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Kültürü ve Yüzey Hazırlama <ol><li> Bir torna kullanarak 100 x 20 mm doku kültür kaplarına (BD Falcon) 3-inç dairesel yüzeylerde kesin. % 70 etanol içinde boğulma yolu ile yüzeyler sterilize edin. Oda sıcaklığında 1 saat için 4 ml tip I kollajen (100 ug / ml) içeren bir Petri kabı ve kat yeri, daha sonra 4 ml 1 x PBS ile yıkayın. </li><li> Doğrudan malzeme 1 ml uygulayarak 6.5x10 5 hücre / ml ve tohum İnsan aort endotel hücreleri (HAEC, pasaj 4-6) Askıya. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde yer ve hücreler 1 saat için alt-tabaka için uygun izin verir. </li><li> Hücrelere 1x antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş Medium Endotel Büyüme-2 (EGM-2) 9 ml ilave edilir. Hücrelerin% 90 confluency ulaşıncaya kadar her 2 günde bir ortam değiştirin. </li><li> % 10 FBS ve 1 x antibiyotik-antimikotik çözüm ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamı içinde THP-1 hücreleri, koruyun. Onlar 1 bir yoğunluk ulaşmak Passage hücreleri0 6 hücre / ml. </li></ol> 2. Hücre Kesme Protokolü Hücreler özel bir koni ve plaka Hücre Kesme Cihazı (CSD) olarak koşuluna bağlıdır. Aygıt bilgilerini ve tasarım özellikleri Tablo 1 ve Şekil 4&#39;te belgelenmiştir. <ol><li> CSD hazırlayın. Etanol ile bölmeli gövde sterilize ve steril PBS ile yıkayın. ° C seviyesinde koni hücre mono tabakasında dik olmasını sağlamak için 37 ila konut ısıtın. Mahfazanın alt gelen hücreleri ile alt tabaka birleştirin ve istenen yüksekliğe koni ayarlayın. </li><li> Leibovitz-15 (L-15) CO 2 yokluğunda pH değerini korumak için kesme aracı olarak Endotelyal BulletKit ile takviye ortamı kullanın. , Enflamasyon teşvik kesme araç, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α, 0.5 ng / ml) eklenir ve bir giriş portuna bağlanmış bir şırınga aracılığıyla aygıt içinde 6 ml enjekte edilir, hava getirmek için dikkat etmek içinodacığın içinde kabarcıklar. </li><li> Yüksek bir büyüklük sabit kesme gerilmesi de makaslama hücreleri (HSS 15 dyne / cm 2) 4 saat için ya da bir salınan makaslama gerilmesi (OSS, 0 ± 5 din / cm 2, 1 Hz). İstenen SS tam daha önce açıklandığı gibi bir mikro-adımlama motoru ile kontrol edilen hücreler, yukarıda koni dönen elde edilir 6 yüzeyi duvar SS (τ w) ile tahmin edilir.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> μ ortamın viskozitesi olduğu durumlarda, ω koni açısal hız, ve α koni açısı (0.5 °) &#39;dir. Alt tabaka ile koni hizalama 0.05 hassas tesviye ve 20 ° olarak belirlenmiştir aralık yüksekliği ± 10 um τ w çember boyunca ve radyal varyasyonu en aza indirmek için bir derinlik ölçer kullanarak içinde ayarlanır. Cihaz laminer akış özelliklerini sağlamak için onaylanmıştır. C Kaldırcihazdan arşın ve monosit yapışma analizi için hazırlar. </li></ol> 3. PDMS mikroakışkan Odası Fabrikasyon <ol><li> Uygulamaya bağlı olarak istenilen mikroakışkan kanal numarası ve kanal yüksekliği için master kalıp elde edilir. Bu protokolde kullanılan özel tasarım özellikleri 5000 dpi 1 Kısaca kanalları ağı (Autodesk Inventor) CAD yazılımları kullanılarak dizayn edilmiştir. Şu oluşturmak için yöntem zaten literatürde iyi belgelenmiştir. Tablo 1&#39;de ayrıntılı ve yazdırılır Bir şeffaflık. Negatif fotorezist (SU8) 100 mikron kalınlığında bir silikon yonga üzerine bükülmüş olan. Şeffaflık bindirilmiş ve UV ışınlarına maruz kalmaktadır. Sigara polimerize fotorezist olumlu çoğaltma ana oluşturmak için kaldırılır. </li><li> Silikon bir tartın tekne ağırlık ajan 10:01 kür ile PDMS çözüm karışımı silikon bir üs yapmak ve 5 ml serolojik pipet yardımıyla karıştırın. Duvarlara kazımak için dikkatli olunçözüm için plastik pul eklemekten kaçının tekne tartın. </li><li> Bir 100x15mm Petri kabındaki ana gofret yerleştirin ve yemeğin içine PDMS çözüm dökün. </li><li> Çanak Kapak ve kabarcıklarını çıkarmak için 15 dakika süreyle vakum kabı içine yerleştirin. 15 dakika Petri kabı çıkarın ve hafifçe yüzey üzerinde hava üfleme herhangi bir aşırı kabarcıkları sonra. </li><li> 70 de 1 saat için bir fırın içinde Petri kabı yerleştirin ° C. Çanak çıkarın ve keskin bir bıçak kullanarak mikroakışkan odaları kesip. </li></ol> 4. Mikroskop Aygıt Meclisi <ol><li> Inverted mikroskop ışık kaynağı açın ve 37 ısıtıcı set ° C 10 ml&#39;lik şırınga hortumu takın ve hiçbir kabarcıklar vardır böyle distile su ile doldurun. 1 dyne / cm 2 lik bir duvar SS indüklemek için şırınga pompa ve ayar akış hızı şırınga yerleştirin. Kanalın merkez boyunca üretilen duvar kesme gerilmesi (τ w) standart yöntemi kullanılarak tahmin edilirBir paralel plakalı akış odası için denklem: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> μ hacimsel akış oranı, Q orta, viskozite olduğu, h kanal yüksekliğini ve w kanal genişliği Not:. kanal genişliği sınırlı olmasından dolayı, asıl τ w w kanala bağlı olarak değişecektir boy oranı ve ölçüm yan duvarların en yakın% 25 olarak önlenir. 1.7 </li><li> Su PDMS odasına yerleştirin ve bireysel kanallardan havayı çıkarmak için 100μl mikropipet kullanın. Kamara off valve ayarlanmış olduğundan emin hale getirmek için vakum adaptörü takın. </li><li> Objektiv HAEC monolayer ile Petri kabı yerleştirin. Petri kabı üzerinde PDMS odasına yerleştirin ve hiçbir hava kabarcığı cihaz ve tek tabaka arasında oluşması temin ederken dikkatli HAEC monolayer üzerinde ayarlayın. Vakum üzerinde ve oda sıkıca bağlı olduğu, böylece valf döndürün. </li&gt; <li> 19 gauge iğne metal sol sadece 5 mm olduğu bu tür blunt kesin. Tamponu ile plastik haznesini doldurun ve PDMS odasının girişine koymak. Kullanılacak uygun sayıda kanal için tekrarlayın. Şırınga pompaları PDMS kanalı çıkar tüp takın. </li></ol> 5. Kesme Gerilmesi altında Monosit Yapışma Testi <ol><li> 2x10-6 hücre / HBSS + Ca2 + / Mg + 2 +% 0.1 ml HSA içinde THP-1 hücreleri, askıya alma. Oda sıcaklığında 15 dakika için stromal türetilmiş factor-1 (SDF-1, 50 mg / ml) ile kuluçkaya alarak etkinleştirme THP-1 hücreleri. </li><li> Akış kurmak için şırınga pompası açın, sonra hava kabarcıkları tanıtan olmadan rezervuar hücre süspansiyonu 50 ul ekleyin. Bir kez akışı tamamen geliştirilirse, veri toplama başlar. </li><li> Çözüm düşük alırsa rezervuara tampon ekleyerek, uygun akış hızında 5 dakika çalıştırın. Akış bilgisi bağlanmamış hücreleri yıkayın kanal içine tampon akan devam edin. </li></ol> 6. Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Yan yakın hemen girişinde sonra veya çıkış portları önce veya% 25 kaydetmek özen, kanal 3 noktada kanalın uzunlamasına ekseni boyunca tam gelişmiş akış takiben 2 dakika süreyle 3 kare / s sayısal görüntü dizilerinin Edinme duvarlar. </li><li> Monolayer aynı odak düzlemi kendi faz-parlak görünüm tanımlayarak alan başına tutuklanan hücrelerin sayısını sayın. </li><li> Sabit hücre durması hareketi ile tanımlanır &lt;10 sn içinde yarım hücre çapı. 3 rasgele alanları / kanal ve üzeri ortalama veri ImageJ yazılımı kullanarak ölçmek. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Damar endoteli tekdüze sistemik inflamasyona katkıda agonistleri maruz olmasına rağmen, ateroskleroz endotel fonksiyonu mekansal heterojenlik karıştığı, arter akımlarında rahatsızlık sitelerinde tercihen gelişen fokal bir hastalıktır. 8 9, 10 TNF-α hücre adezyon moleküllerinin up-regülasyonu (CAM&#39;lar içerir EC iyi karakterize yanıtı indükler edilir ; örneğin VCAM-1, ICAM-1, E-selektin) ve dolaşım, erken aterosklerotik lezyon damgasını gelen işe monositler 11 Hemodinami endotel enflamatuar fenotipe önemli bir düzenleyicisi olduğu 12 Yüksek büyüklüğünü kayma gerilmesi kemokinlerin (HSS..; örneğin 15 dynes / cm 2) veya pulsatil kayma gerilmesi (PSS; örneğin 15 ± 5 dynes / cm 2) arterlerde TNF-α ile indüklenen yanıtları düşürmesine ateroskleroz direnç siteleri ile ilgili. Tersine, düşük büyüklüğünü kayma gerilmesi (LSS; örneğin 2 dynes / cm 2) ya da salınımlı kesme; in vivo duyarlı sitelerin karakteristik (ÖSS örn. 0 ± 5 dynes / cm 2), cytoki alevlendirebilirne bağlı inflamasyon. 13, 14 Bizim mikroakışkan PDMS cihazlar endotel fonksiyonu ve patoloji düzenlenmesinde hidrodinamik faktörleri ile metabolik stres süperpozisyon ile ilgili hipotezleri test etmek için mekanik çalışmalar yürütmek için bir platform sağlar. Yaklaşımın yarar ve çok yönlülük geniş Aşağıdaki temsili sonuçları ile gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kayma gerilmesi ayirt TNF-α iltihaplı endotel monolayers için THP-1 hücre adezyonu modüle. Bu veriler yukarıda ve video belgelenen açıklanan ayrıntılı protokolü kullanılarak elde edildi. HAEC monolayers eşzamanlı inflamatuvar sitokin TNF-α (0.5 ng / ml, VCAM-1 up-regülasyonu için ~ AK 50) ve HSS (15 dynes / cm 2) veya ÖSS (0 ± 5 dynes ya düşük dozda maruz bırakıldı anlatıldığı şekilde 4 saat boyunca özel bir CSD içinde / cm 2, 1 Hz)ayrıntılı bir protokol yatak. THP-1 hücre tutuklanması PDMS akışı odasında kayma akışı altında ölçüldü. Insan monosit fenotip taklit Bu hücre hattı kendi tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı için seçildi. HSS zayıflatılmış inflamatuvar yanıt azalmıştır THP-1 hücre tutuklanmasıyla sonuçlanan, ÖSS ile karşılaştırıldığında. Veriler Student t-testi ile analiz edildi ve ortalama ± 3 bağımsız deneyler SEM olarak temsil edilmektedir. DeVerse ark izniyle uyarlanmıştır. 5 Aşağıdaki bilgiler yayınlanmış çalışmalarından örnekler kullanarak bizim yaklaşımın yönlülüğü göstermektedir. Eğer varsa, yukarıdaki protokol sapmalar gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Sitokin indüklenen VCAM-1 ekspresyonu ve kayma gerilmesi degrade monosit alımı Modülasyonu. A) HAEC mono tabakalar flo altında 4 saat süre ile, TNF-α (0.3 ng / ml) ile uyarıldıHele-Shaw akış teorisine göre tasarlanmış bir VMMC içinde w. 15 kanalın merkez boyunca SS büyüklük olarak doğrusal bir azalma iki boyutlu bir durgunluk akışının düzene denk odasının yan duvarları tasarımı ve son şekillendirilmesi ile sağlanmıştır Kanalın iso-olası hatları eşleştirmek için. Giriş (x) bir eksenel mesafede bu kanalın merkez hattı boyunca üretilen duvar kesme gerilmesi (τ w) aşağıdaki gibi verilir: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> μ hacimsel akış oranı, Q orta, viskozite olduğu, h kanal yüksekliğini, w 1 kanal giriş genişliği, ve L toplam kanal uzunluğu. Q 16 dan SS büyüklükte bir gradyan oluşturmak için seçildi outle için dynes / durgunluk noktada 0 girişinde cm 2 &quot;&quot; sadece proksimalt. B)-C) VCAM-1 ekspresyonu kuantum noktaları için konjuge ve uyarılmamış statik kontrol yüzdesi ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak sunuldu antikor kullanarak immünofloresan mikroskopi ile in situ ölçüldü. SS uyarılmamış HAEC (gri üçgenler) de düşük VCAM-1 bazal seviyesi, modüle değildi. Ancak, VCAM-1 ekspresyonu) ~ 2 dynes / cm 2 peaking ve kayma büyüklükleri&gt; 5 dynes / cm 2 (siyah kareler). D TNF-α bazal dönen veya aşağıda, LSS büyüklükleri de TNF-α göreli artış Monositler (10 6 / ml) A) &#39;da olduğu gibi koşullanan mono tabakalar üzerinde paralel akış kanalları içinde 5 dakika için 2 dynes / cm 2 perfüze edildi. Endotele Monosit işe kantitatif verilen kayma gerilmesi genlikte VCAM-1 ekspresyonu ile ilişkilidir. Özellikle, bir monolaye ince uzaysal çözünürlüğü olan VCAM-1 ekspresyonu ve monosit işe soruşturma yeteneğir ayrı deneylerde kayma sadece bir kaç ayrık değerler uygulayarak takdir etmem SS büyüklükte dar bir aralık üzerinde önemli değişiklikler saptandı. Veri TNF-α dan * p &lt;0.05 statik koşullarda, tekrarlanan ölçümler ANOVA ve Newman-Keuls sontest ile değerlendirilen farklılıklar analiz edildi. Veriler, ortalama ± SEM edilir 3-6 bağımsız deneyler. Tsou ark. 2 izniyle uyarlanmıştır <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. Trigliserid-zengin lipoproteinler (TGRL) donör serum trigliserid düzeyleri ve VCAM-1 ekspresyonu ile orantılı olarak sitokin indüklenen inflamasyonu modüle. HAEC monolayers TGRL (10 mg / dl ile eşzamanlı olarak 4 saat süreyle TNF-α (0.3 ng / ml) ile uyarıldı ApoB) Statik kültürde yüksek yağlı bir yemekten sonra insan denekler izole. A) VCAM-1 ekspresyonu akım sitometri ile askıya AK ayrı ölçüldüve monosit yapışma ayrıntılı protokolde tarif edildiği gibi bir VMMC kullanılarak belirlenebilir. Veriler, TNF-α% değişim olarak gösterilmektedir. Monosit tutuklama donör serum trigliserit düzeyi ile doğrudan artmıştır. B) pro-inflamatuar donörler bir altkümesi için Monosit tutuklanması VCAM-1 engelleme antikor varlığında yürürlükten kaldırılmıştır endotel VCAM-1 ekspresyonu, doğru orantılı olarak değişmektedir. Anlamlılık eşleştirilmiş Student t-testi ile belirlendi, 3-5 bağımsız deneyler ± SEM demektir. Wang ve ark izniyle uyarlanmıştır. 4

<ol>
	<li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response.">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li><li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress.">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li><li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li><li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress.">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li><li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endothelial+phenotypes+evoked+by+arterial+waveforms+derived+from+atherosclerosis-susceptible+and+-resistant+regions+of+human+vasculature.">Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).</li><li>Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+adhesion+of+vascular+and+valvular+endothelial+cells+in+microfluidic+channels.">Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+associated+with+regional+athero-susceptibility+and+adaptation+to+disturbed+blood+flow+in+vivo.">Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo.</a> Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).</li><li>Burdge, G. C., Calder, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+response+during+the+postprandial+period:+A+potential+causal+process+in+vascular+disease.">Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease.</a> Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).</li><li>Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+metabolic+disorders.">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+atherosclerosis.">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li><li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+shear+stress+and+atherosclerosis:+A+matter+of+site+specificity.">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li><li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li><li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li><li>Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+cytoskeletal+mechanics+by+hemodynamic+forces.">Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces.</a> Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).</li><li>Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd11c/cd18+expression+is+upregulated+on+blood+monocytes+during+hypertriglyceridemia+and+enhances+adhesion+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1.">Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).</li><li>Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+cd11c++monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia.">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz CAM ifade ve monosit adezyon gerçek zamanlı görüntüleme yoluyla endotelyal inflamatuvar fenotip on-chip değerlendirme için mikroakışkan PDMS cihazların kullanımını açıklar. Bizim yaklaşımın önemli bir avantajı gibi aterojenik damarlarda makaslama stresi ayna tanımlanan hidrodinamik koşullar altında diyet lipid ve sitokinler gibi inflamatuvar mediatörlerin maruz hücrelerde endotel disfonksiyonu ile ilişkili sonuçları sayısal yeteneği yatıyor. VMMC reaktifler veya sınırlı kaynağı olabilir malzemelerin küçük miktarlarda kullanımını kolaylaştırmak ve ucuz, özelleştirilebilir ve yüksek verimlilik için mükellef olmak ekledi avantajları var. Mikroakışkan cihazların kullanımı kesme kültürlü AK cevabı araştırmak için yıllardır kullanılmaktadır makro ölçekli yaklaşımlara bir alternatif temsil eder. Bunlar, Ca, her biri paralel-plaka akış odası, silindirik tüpler, ve koni ve plakalı viskometre içerirsabit, laminer Poiseuille akış şartlarında (16 yorum) empoze palpe edilebilir. Bu cihazlar üzerinde değişiklik duvar kayma gerilmesi temporal ya da mekansal varyasyon üretmek hatta arteriyel dalga recapitulate. 6 Ancak, genel olarak bu cihazlar medya büyük miktarda gerektiren, daha az uyarlanabilir imal etmek pahalı ve nispeten düşük akış muzdarip olabilir. Sınırlamalar, aynı zamanda VMMCs kullanımı ile mevcuttur. Bu cihazlar sonsuz genişliği varsayar paralel plakalı akış teorisi, esas olarak tasarlanmıştır. Bu genişliği yüksekliği daha fazladır makro ölçekli cihazlar için makul bir varsayımdır. Bununla birlikte, mikroakışkan kanal genişliği sınırlı gerçek τ w w kanal oranına bağlı olarak değişecektir gibi çalışmalar, yan duvar etkileri ortadan kaldırmak için, kanalın uzunlamasına ekseni boyunca yapılan orta zorunlu kılmaktadır. 1, 7 Benzer şekilde , ölçümler yakın t alınmazGiriş etkileri önlemek için kanal giriş ve çıkış o. Biz yaralanma veya gözlenen tepkiler katkı olarak tek tabaka için cihaz mühürleme nedeniyle AK hasara yol açtığı herhangi bir önemli parakrin sinyal etkisi veya inflamasyon dışladı var. PDMS salgılanan kemokinler ve lökositler ve VMMC arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri emme yol açabilecek hidrofobik molekül için yüksek afiniteye sahiptir. Ancak, biz bu bizim çalışmaların süresi için bir sorun olmaya bulamadık. 2 Kültür hücreleri ile akış cihazların kullanımı kayma gerilmesi ile ilgili mekanik çalışmalar ve neden ve etkisi gösteri kolaylaştıran bir indirgemeci bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, in vitro yaklaşımlarda herhangi bir sınırlama yeterince yerli arterlerde ortamının karmaşıklığı özetlemek olacağı varsayımıdır. İn vivo olarak, endotel hücreleri kronik karmaşık akış şekilleri adapte edilirdiğer hücreler, matris ve davranışlarını düzenleyen hümoral mediatörler ile etkileşimleri tabidir. Yukarıda sunulan sonuçlar, her kısa süreli bir model ve bu gibi olduğu dikkat çekicidir, değişmez zaman olmayabilir. Ancak, onlar da genellikle akut inflamatuar bir meydan okuma mekanizması altında araştırmak gerçekleştirmek deneyler temsilcisi vardır. Çalışmalarımızda için ilgili strateji 4 saat VCAM-1 ekspresyonu yaklaşık tepe temsil eden düşük doz TNF-α stimülasyon, iltihabi bir başlangıca değişiklikleri izlemektir. Bu VCAM-1 ifadesini yüzey değişiklikleri bu şartlar altında geliştirilmiş bir monosit alımı ile ilişkili olduğunu çeşitli çalışmalarda ortaya çıkarmıştır. 2-4, 17, Ayrıca, SS dalga seçimi diferansiyel endotel tepkiler uyandırabilir. Bizim temsilcisi protokol biz ler altında şartına HAEC monosit adezyon olayları ölçmek VMMC kullanımı belgelemekrelatif direnç (HSS) ve özelleştirilmiş bir hücre kesme cihaz arterlerde ateroskleroz yatkınlık (OSS) sitelerin temsilcisi olarak seçilmiştir gerilmeler duydum. Kültürlü EC önceki bulguları, HSS zayıflatılmış ÖSS göreli sitokin aktivasyonu için tepki ile tutarlı. 12, 13 sonuçları in vivo akım bozulma bölgelerinde AT inflamatuar aktivasyonu için büyük bir serbestlik ile tutarlıdır. Bu koşullar genellikle sırasıyla bozulmamış ve bozulmuş akışını temsil etmek için kullanılır, onlar tamamen arter akımlarında karmaşıklığı recapitulate yok. Ancak, bir edebiyat zenginliği yeterince belirgin akış özellikleri yeniden basit yaklaşımlar olarak kullanımını desteklemektedir. 14. Özellikle, bizim koni ve plaka bazlı CSD önce bildirildiği gibi uzun süreler için daha karmaşık dalga şekilleri ve klima hücre üretme yeteneğine sahiptir. Böylece 6, tarif pr CSD ile VMMC eşleştirmeotocol maksimum esneklik derecesi verir. Bu yaklaşımın bir göz CSD makaslama havalandırma yönüne göre VMMC yönünü de yer alır, çevresel yönde olan HAEC tecrübe akış. Bu kanallar şimdiye kadar mümkün olduğu kadar akış yukarı şartlı hücrelerinin akış alan ve giriş ile paralel olacak şekilde uygulamada, VMMC yöneliktir. Kanallar bu makul bir yaklaşım temsil ettiği kadar küçük. Bununla birlikte, aynı zamanda VMMC makaslama havalandırma yönüne dik veya paralel olarak akan monositler Şekil 2 &#39;de gösterilen sonuçlar etkisi olmadığı bir önceki çalışmada gösterilmiştir. 2 In vitro teknikleri ile ilişkili Ek hususlar seri izole EC veya monositlerde kültür ve heterojenite AT pasajı ile ilişkili fenotipik sürüklenme tarafından indüklenen değişkenliği vardır. HAEC tipik olarak geçit 6 ve her parti bir tarafından kullanılması gerekirTNF-α ile tutarlı bir inflamatuar yanıt için karakterize edilmektedir. Bu tür THP-1 gibi hücre hattının kullanılması verici tarafından etkinlik değişir ve kolay bir şekilde izolasyon ile aktive monositler, kullanımı ile ilişkili değişkenlik azaltabilir. Tekrarlanabilir ve doğru işlevsel okuma, hücre hazırlama ve transfer sürelerini minimize edilmelidir sağlamak için. Kontrollerin dikkatli seçimi anlamlı sonuçlar yorumlamak için gereklidir. Deney bağlı olarak, bu tedavi edilmemiş ya da statik kültürlü hücreler, TNF-α tedavi Aktif Edilmemiş THP-1 hücreleri, bloke edici antikorlar, siRNA&#39;lar veya farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı, ve diğerleri içerebilir. Yaklaşımın çok yönlülük vasiyeti olarak, HAEC sitokin-2 lipid-3, 4 ve RAGE indüklenen 5 inflamasyon araştırmak için bu cihazlar uyguladık. Tüm çalışmalar insan serum sn &#39;den türetilmiş lipid parçacıklarının enflamatuar potansiyelinin ölçümü ekledikendotel hücreleri 3, 4 ve monositler üzerinde ubjects. 17 alternatif bir strateji olarak, monositler yapışma mekanizması incelemek için VCAM-1 gibi hareketsiz molekülleri ile türevlendirilmiş substratlar ile sunulabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, daha önce insanlar 17 ve farelerde dislipidemi sırasında VCAM-1 monosit adezyon -4 çok geç antijen (VLA) ile işbirliği adezyon molekülü CD11c için işlevsel bir rolü göstermiştir. 18. monositler tarafından kolaylıkla aktive edilebilir yana onların izolasyon, biz de daha hassas ve tekrarlanabilir tespiti için izin vermek bizim laboratuvar-çip cihazla birlikte kullanım için tam kan testi geliştirdi. 17. Sonuçta, ateroskleroz altında yatan erken enflamatuvar durumların fikir sağlamanın yanı sıra, bu w serme, bu teknoloji gelişmesi-aracılıklı iltihaplanma, kardiyovasküler hastalık, bir bireyin riskini değerlendirmek için güvenilir ex vivo yaklaşımlar yol açacağı tasavvurmonosit ve EC aktivasyon rapor kişiselleştirilmiş teşhis gelişmesi için ay. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Koni-ve-Levha Hücre Kesme Cihazı </td></tr><tr><td> Koni Yarıçap </td><td> 0.06985 </td><td> m </td></tr><tr><td> Koni Açısı </td><td> 0,00877 (0.5 °) </td><td> rad (derece) </td></tr><tr><td> Gap Yükseklik </td><td> 20 ± 10 </td><td> um </td></tr><tr><td> Maksimum Açısal Hız (deneyler için burada özetlenen) </td><td> 18.85 </td><td> rad / s </td></tr><tr><td> Kinematik Viskozite </td><td> 0.00077 </td><td> m 2 / s </td></tr><tr><td> Max R numarası (deneyler için burada özetlenen) </td><td> 0.000758 </td><td> boyutsuz </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td colspan="3"> VMMC Özellikler </td></tr><tr><td> Kanal Uzunluğu </td><td> 8 </td><td> mm </td></tr><tr><td> Kanal Yüksekliği </td><td> 60 </td><td> um </td></tr><tr><td> Kanal Genişliği </td><td> 2 </td><td> mm </td></tr><tr><td> Reynolds sayısı </td><td> 1.67 </td><td> boyutsuz </td></tr></tbody></table> Tablo 1. CSD ve VMMC Özellikler. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Koni ve plaka hücre kesme cihazı (MDA) enine kesit görünüşüdür. CSD, sabit bir hücre kültür substrat üzerinde döner bir paslanmaz çelik silindir koni oluşur. Koni açısı ve aralık yüksekliği kültür vasatı varlığında üretilen kesme alanının yapısını tanımlayacak kritik parametrelerdir. Viskoz santrifüj kuvvetleri ile ilişkisini gösteren modifiye edilmiş bir Reynolds sayısı ile ifade edilir: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq4.jpg" alt="Denklem 4" /> &lt;br /&gt; r yarıçapı koni olduğu, ω açısal hız olup, α koni açısı olup, ν sıvı kinematik hızıdır. R &lt;&lt; 1 merkezkaç kuvvetleri düşük olduğunda, akış laminer ve tamamen azimutal ve bağlı kayma gerilmesi monolayer boyunca sabittir. Bizim CSD yılında 19, kültür hücreleri ile yüzey evler odasına alttan yüklenir koni. Orta bölme eklendi ve kesme sıvı olarak kullanılmaktadır. Koni önceden yüklenmiş hassas rulmanlar ve bir mikro-step motor ile tahrik rotasyon ile monte edilir. Bir hassas tesviye sistemi hücre substrata uyum dik tutar. Boşluk yüksekliği (hücre substrat koni apeksinden mesafe tarafından tanımlanan) bir yüksek hassasiyetli derinlik ölçer ile ayarlanır. Bir gres yakalamak ve medya salmastra odası konut hücreleri temiz ve yağ ve enkaz serbest tutulmasını sağlamak için sırada yer almaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Madde </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> 100 x 20mm Petri Yemekleri </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Etanol,% 95 </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Ben Sıçan Kuyruğu Türetilmiş Kollajen yazın </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> İnsan aort endotel hücreleri </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik Çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Endotel BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endotel Bazal Medya-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 ml şırıngalar </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Poliüretan boru </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 Medya </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer Base </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer Kürleme </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 fotorezist Usta Gofret </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 Ters Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Şırınga Pompası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 numara derialtı iğne </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 Monositik Hücre Hattı </td><td> ATCC </td><td> TİB-202 </td></tr><tr><td> HBSS Ca 2 + / Mg 2 (Hanks Tuzlu Çözüm Buffered) + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Tümör Nekroz Faktör Alfa (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromal Türemiş Faktörü - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040-CV </td></tr><tr><td> Albumin Serum İnsan (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanlar.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

Aterogenezin endotelyal disfonksiyona yol açan sistemik enflamasyon artan devlet katkıda metabolik anormallikleri tarafından daha da güçlendirilmektedir. Ancak, risk bireyin düzeyi anlatıyor endotel erken fonksiyonel değişiklikler doğrudan kılavuzu tedavi stratejisi yardım klinik değerlendirilmemektedir. Diğer taraftan, yerel hemodinami ile inflamasyon düzenleme, ateroskleroz, tesadüfi olmayan bir uzaysal dağılımının katkıda bulunur, ama mekanizmalar, in vivo tarif etmek zordur. Biz hassas akış şartlarında insan endotel hücreleri (EC) ve monositler inflamatuar olayların kantitatif tayini metabolik pertürbasyon için bir laboratuvar-on-a-chip bazlı yaklaşım açıklanmaktadır. Yumuşak litografi standart yöntemlerle kültive EC mono tabakalara direkt olarak bağlı olan damar taklit eden microfluidic odaları (VMMC), microfabricate etmek için kullanılır. 1. Bu cihazlar, reaktiflerin küçük miktarlar ise kullanma avantajına sahiptiriyi tanımlanmış bir kesme alanına maruz AK membran inflamatuar olayların doğrudan görüntüleme için bir platform sağlar. Biz başarıyla insan aort EC (HAEC) sitokin-2 lipid-3, 4 ve RAGE indüklenen 5 inflamasyon araştırmak için bu cihazlar uyguladık. Burada tahlil monositik hücre (THP-1) haddeleme ve diferansiyel kayma özellikleri altında klimalıdır ve inflamatuar sitokin TNF-α tarafından aktive edilir HAEC mono tabakaları üzerinde durmasına VMMC kullanımı belgelemek. Bu gibi çalışmalar metabolik risk faktörleri altında atherosusceptibility içine mekanistik anlayış sağlıyor.

Watch this Scientific Journal Video about On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping at JoVE.com

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Görüntüleme.  University of California, Davis. Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

Video: On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Biyomühendislik

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Endotel Hücre yakalama ve Saklanmasına İlişkin ferromanyetik Bare Metal Stent

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...