Bu çalışma NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796 tarafından desteklenmiştir.

Sunulan Leo-iş akışları protein izotop etiketleme sindirir ve sentetik peptidler için izin verir. Bu zaman süreci deneyler (Şekil 1) ve kantitatif proteomikler karşılaştırmalı çalışmalar gibi proteaz araştırma için de geçerlidir. Her iş akışı iki deneysel adımlar (Şekil 2) oluşur: A) ilgili 18 O-izotop kodlanmış reaksiyonu (proteaz-katalizli peptid bölünme karar örnekleme zamanı; proteaz-katalizli karboksil oksijen alışverişi reaksiyonu; asit katalizörlü karboksil oksijen alışverişi kütle spektrometresi ve 18 O-birleşme kinetiği grafiksel gösterimi ile reaksiyonu) ve B) analizi. A. timecourse Deneyler I. Paleo-timecourse: proteolitik dilinimleri of Proteaz-katalizli etiketleme <ol><li> (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır25 mM NH4 50, 30 dakika süre ile inkübasyonu ile HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) ° C. </li><li> (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla. </li><li> Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein örneklerinin için tamponlar alışverişinde peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri (Sartorius) için PepClean C-18 sıkma sütunlar (Termo) kullanın. </li><li> / Çözülür değiş tokuş peptitler / 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz proteinler (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5.5; tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) ile 1:1 (v / v) nihai H 2 içeren 18 O (% 95, Sigma IsoTec). </li><li> Önceki proteaz ilave olarak bir sıfır zaman noktası numune alımı için: Karışım reaksiyon karışımının 0.5 ul, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamikmatris asit (% 50 asetonitril içinde 10 mg / ml,% 0.1 TFA). Opti bir MALDI-TOF 384 hedef plaka (AB Sciex) üzerinde Noktası numune ve oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakmak kuruyana kadar (yaklaşık 5 dakika). </li><li> Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta:;: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM tripsin 75 nM ECE-1) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve kontrol örneği olarak hizmet verecek. Birinci kısım proteaz-katalize 18 O-etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve proteolitik bölünme reaksiyonları peptid ve protein tespiti, proteolitik etkinlikler tespit edilmesi ve izlenmesi için de kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz neden olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, ne etiket veya dilinim Bu örnek için bekleniyor. </li><li> Reaksiyon çözeltisi kısmı kaldırılması ve des olarak lekelenme ile reaksiyon takipzaman aralıklarında 5. adımı altında açıklanan şekilde değiştirin kadar formda görünüyor. Yukarıda tarif edilen reaksiyon koşulları, en fazla dört günde (yaklaşık 24 noktası) için bir proteolitik reaksiyon izlemek için kullanılır. 30 dk kadar her 5 dk örnekleme başlayın, sonra 4 gün kadar 8 saat ve her 8 saat kadar sonra 2 saat kadar her 30 dakikada, her saat nokta. Parçalanma ürünleri ilk 12 saat içinde gösterilecektir ve alt tabaka 24 saat sonra tamamen hidrolize olması gerekir. Genişletilmiş reaksiyon inkübasyon sürelerinde daha işlenir reaksiyon ara, ayrık olan stabil reaksiyon ürünleri tanımlamak için izin verir. Lekelenme süreleri ve inkübasyon sıcaklığı optimal reaksiyon örnekleme sağlamak için modülasyonlu olması, araştırma sorusu ve verilen enzim-substrat çiftleri üzerinde var olarak. </li><li> Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi uzun lekelenme aralıkları arasında, MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra. </li></ol> II. Paleo-timecourse: Postdigproteolitik terminallerinin estion etiketleme <ol><li> (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla 50 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon ile 25 mM NH 4 HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) içinde DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır </li><li> (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla. </li><li> Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein tampon degişimi peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri için PepClean C-18 sıkma sütunları kullanın. </li><li> Çözülür / temizlenmiş peptid ürünler / proteinler 20 ul proteaz reaksiyon tamponu içinde (örneğin tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) değişimi (örn. tripsin tamamlanması için ilgi proteaz ve özeti: 0.04 nM; 37 ° C, 12 saat). </li><li> PepClean C-18 sıkma sütunlarla Temizleme parçalanma ürünleri. Bu adım, kalan proteaz aktiviteleri ortadan kaldıracaktır. </li><li> Çözülür / (tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz temizlenmiş peptid ürün değişiminde 1:1 (v / v) nihai H 2. 18 O. içeren </li><li> Önceki enzimi eklenmeyen bir sıfır zaman noktası numune alımı için: reaksiyon karışımı, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) Karışımı 0.5 ul. MALDI bir hedef plaka üzerinde Noktası numune ve (yaklaşık 5 dak) kuru kadar oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakın. </li><li> Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM örneğin, tripsin) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve bir kontrol olarak hizmet verecek. Birincialikot proteaz katalize 18 O-postdigestion etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve peptid ve protein ölçümü için kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz tarafından katalize olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, hiçbir etiketleme için bu örnek bekleniyor. </li><li> Reaksiyon alikotları çıkarırken ve bunları adım 7 altında açıklanan tespit ederek tepki uygulayın.) Zaman aralıklarında kadar formda görünüyor. Örneğin, tripsin tarafından katalize karboksil oksijen alışverişi tepkisini izlemek için bundan sonra başlangıçta yukarı 30 dakika ve her 15 dakika için her 5 dk gördü. </li><li> Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi yakalama uzun aralıklar arasında da MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra. </li></ol> III. Aleo-timecourse: karboksil gruplarının asit katalizörlü etiketleme <ol><li> 1:1 (v / v) t olarak 18 O-zenginleştirilmiş su ile tek tek peptidler (50 nM) inkübeo varlığında ya da% 0.1 yokluğunda (kontrol) (v / v) nihai trifluoroasetik asit (toplam hacim 30 ul). </li><li> Numune ile 48 gün süreyle günlük reaksiyon ürünlerinin doğrudan doğruya bir MALDI hedef üzerine alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) ve 0.5μl ile karışım 0.5 ul alikot eş-lekelenme plaka. </li><li> Lekelenme aralığında ve Bölüm B de aşağıda tarif edildiği gibi MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi için MALDI hedef plaka sunmak nihai reaksiyon zaman noktasında tespit sonra </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Kütle spektrumları 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB Sciex) üzerinde elde edilir. </li><li> Önce analiz, enstrüman ± 50 ppm ve maç için altı tepe asgari sayıda azami kütlesi ölçüm hatası toleransı ile peptid standartları karışımı (AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Kiti) ile kalibre edilir. </li><li> MS spektrumları (kütle aralığı2,000 kabul edilebilir bir temel pik yoğunluğu aralığı ile adım büyüklüğü 50) - 45,000; 400 - 3.800 - 4.000 m / z) ayarlanabilir bir lazer yoğunluğu (3,400 pozitif iyon modunda kullanarak üç nüsha halinde elde edilir. Tek çekim 400 toplam çekim / spektrumu, alt-spektrumları amacıyla elde edilen, 800 alt-spektrumları sonra yürürlüğe girer koşulları durdurmak (geçmek veya başarısız) satın alınan veya 400 alt-spektrumları geçiş kabul kriterleri. Düşük miktarda numune halinde ya da kompleks biyolojik kökenli varlığında MS tespiti aralığının alt ucunun 800 m / z için yükseltilmiş olmalıdır. Buna ek olarak, LC ayrımı ile ya da yukarıda anlatıldığı gibi, bir örnek temizleme adımı ile tuz ve diğer müdahale bileşikleri çıkarmak için gerekli olabilir. </li><li> MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explorer veri toplama yazılımı ihraç ve spektral işleme ve pik algılama için MASCOT Distiller yazılımı (Matrix Bilimi) kullanır bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi, içine alınır. İzotopik zarflardeconvoluted ve otomatik olarak Mason et al. 12 tarafından tanımlanan ve grup 9 ile uyumlu bir benzer bir algoritma kullanılarak belirlenmiştir 18 O-birleşme oranını göstermektedir. Alternatif olarak, bu tür ZoomQuant 13 ve 14 engerek gibi yazılım araçları, hem de bu tür ticari yazılım paketleri BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) ve Maskot Distiller kantitasyonu Araç Kutusu gibi (Matrix Bilim) 18 O-tipi verileri 15,16 deconvolute yapabilirsiniz. 18 O-şirketleşme oranları (yani, 16 içeren peptidler bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları olarak ifade edilir O, tüm izotopik zarf ile 18 O ya da 1 18 O 2). </li><li> Her bir timecourse deney için, moleküler kütleleri ([M + H] +) tespit edilen tüm türlerin ilişkili peptid MS verileri ve dosyaları elde değerler 100 ppm kütle genişlikte binned birer. </li><li> Aen t üç [M + H] + bir depo doldurmak için gerekli ayarlanır. Bilinen substratlar olması halinde, kutu listesi filtrelenmiş EXPASY FindPept aracını 17 (kullanarak, substrat peptid sekansı ile tahmin proteolitik bölünme ürünleri bir liste ile karşılaştırılır <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) ve bir 200 ppm kitle hata kabul toleransı. </li><li> MS / MS spektrumları FindPept araç ve onlarla ilgili 18 O-birleştirmeleri var bin değerler için öngörülen parçalanma ürünleri tüm kütle değerleri için elde edilir. MS / MS veri kapalı modunda sabit lazer 4200 yoğunluğu ve CID-gaz ile 1kV reflektör pozitif iyon modunda 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer elde edilir. 50 çekim nokta başına 40 alt-spektrumları (2,000 kare / nokta toplam verimli) toplam alt spektrumları başına randomize desen kadar elde edilir. </li><li> MS / MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explo ihraç edilmektedirrer veri toplama yazılımı ve bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi ithal, zirveleri tespit edilir ve MS / MS tepe listeleri ilgili binned MS verileri ile ilişkilidir. </li><li> Peptid belirlenmesi için, MS / MS tepe listeleri aşağıdaki arama parametreleri ile MASCOT arama motorunu kullanarak SwissProt veritabanı karşı aranır: Hiçbir enzim spesifitesi, 150 ppm öncül iyon ve 0.2 Da fragmanı iyon kütle toleransları. </li><li> Peptit ayrıca kimlik Şevçenko ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi Y-dizi parça üzerinde karakteristik iyonlar 18 O-birleşme paternleri teyit ederek veri Explorer yazılımı (AB Sciex) kullanılarak doğrulanabilir. 18. </li></ol> Spektral Zaman ve 18 O-şirketleşme Arsalar C. Hazırlanması Spektral süresi araziler: Bir kullanarak her reaksiyon süresi noktası için MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) olarak Veri Explorer yazılım ihraç edilmektedir ASCII dosyalarımakro ve veri analizi ve grafik yazılım programı (originlab örneğin Kökeni) ithal ve şelale araziler (Şekil 3) olarak görüntülenir. 18 O-kuruluş grafikleri: Her binned peptid bölünme ürün için, bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları (16 O, 18 O 1 veya 18 O 2) her reaksiyon zamanı noktalarında ayıklanır ve (Şekil 4) Zamana karşı çizilen.

<ol>
	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics.">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li><li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics.">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li><li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+proteolytic+18O+labeling:+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates.">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li><li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples.">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li><li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1:+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling.">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li><li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3.">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156 (2009).</li><li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters.">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li><li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry.">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Izotop etiketleme ve zamana bağımlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştirerek, Paleo-timecourse yöntemi peptid ürünlerinin nesil dinamik bir analiz sağlar. Tahlil nicel ve nitel proteomikler çalışmalar için kararlı izotopik olarak etiketlenmiş bir peptit üretmek için ve proteotypic peptidler elde edildikleri kinetik değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, Paleo-timecourse spesifik olarak, fizyolojik olarak uygun koşullar altında ex vivo olarak proteolitik yollar değerlendirmek için tasarlanmıştır. Endojen proteinler, peptidler ve proteazlar gibi sentetik peptidlerin ve rekombinant proteazlar akışı içinde kullanılabilir. Belirli bir proteolitik araştırılması için reaksiyon, tahlil koşulları ve lekelenme kez bağlı olarak reaksiyon sürecinin en iyi örnekleme sağlamak için ayarlanabilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu (örneğin, düşük enzim konsantrasyonu kullanılarak, oda aşağı proteolitik reaksiyonları yavaşlatmak için yardımcı oluruygun elle örnekleme aralıkları için izin sıcaklık) diğer kararlı-izotop etiketleme yöntemleri ile olduğu gibi, deney 18 O-birleşme oranı ölçümleri için sapmalar küçük -. genellikle% 5&#39;inden az yeterli iyon istatistikleri ile zirveleri için. Genel protokol kolayca başka tahlil formatları için adapte edilmiş, örneğin sentetik substrat arasında bir büyük grubu ya da kompleks biyolojik örnekler (ör., hücre kültür ortamı, vücut sıvıları) dan endojen peptidler proteolitik işleme karakterizasyonu tarama şekilde olabilir. Daha önce paleo-yaklaşım LC-ayrıştırma aşaması ile tire, ve insan tükürük peptidome 9 dinamik kompozisyon tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Paleo-timecourse tarafından tanımlanan proteolitik imza proteaz enziminin substrat spesifitesi ile ilgili önemli bilgiler sağlamaktadır ilgi. Buna ek olarak, zamana bağımlı veri da kinetik bilgi üretir. Bu bilgiler tekrar üretilebilir ve yüksek derecede bol hedef peptidleri tercih 21 önemlidir kantitatif proteomik çalışmaları için, proteotypic peptidler değerlendirilmesi özellikle yararlıdır. Aynı şekilde, proteolitik yollar oran sınırlayıcı tanımlayan adımlar yeni proteaz bazlı ilaçların geliştirilmesi için büyük ilgi görmektedir. Proteazlar birçok fizyolojik ve patolojik süreçler (örneğin kardiyovasküler bozukluklar, nörodejeneratif hastalıklar, kanser) ve bu gözlemler terapötik müdahaleler için yeni fırsatlar açabilir önemli faktörlerdir. Aleo-stratejisi - karboksil gruplarının asit katalizörlü etiketleme - kolayca kararlı izotopik olarak kodlanmış sentetik standartlar üretmek için ve endojen peptidler uygulanır. Asit katalizli reaksiyon kinetiği, enzim-katalizörlü tepkime çok daha yavaştır. Bu nedenle, denemeleri dikkatlice önceden planlanmış olması gerekir. Aleo-timecourse kimyasal bir düşük maliyetli bir alternatif, metabolik ve sentetik etiketleme methods şu anda proteomikler çalışmalarında kullanılmıştır. Etiketleme süreci 18 O-şirketleşme diğer izotop etiketleme yöntemleri üzerinde bir avantaj olabilir dengeye ulaşmış olduğunu doğrulamak için izlenebilir. Sonuç olarak, burada açıklanan Leo-timecourse iş akışları yaratıcı birçok kalitatif ve kantitatif proteomik çalışmalarının yanı sıra proteaz araştırma istihdam edilebilir yönlü araçlardır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzemenin adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Sütunlar </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI hedef plakası </td><td> AB Sciex </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB Sciex </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Malzemeler <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiyotretol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endotelin-1 enzim (ECE-1) dönüştürme </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsin Altın </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Su-18 O, 97 atom% 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Seti </td><td> AB Sciex </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Kararlı izotoplar biyolojik kütle spektrometresi için temel araçlardır. Tarihsel olarak, 18 Ey-kararlı izotopu yaygın 1-3 proteolitik enzimlerin katalitik mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik gelişiyle birlikte, istikrarlı izotopik zenginleştirilmiş su 18 O-atomların enzimatik katalize eklenmesi kantitatif protein ekspresyon düzeyleri (Fenselau ve Yao 4, Miyagi ve Rao 5 ve Ye tarafından gözden karşılaştırmak için popüler bir yöntem haline gelmiştir ark. 6). 18 O-etiketleme bir kimyasal için basit ve düşük maliyetli bir alternatif (örneğin iTRAQ, ICAT) ve metabolik (örneğin SILAC) etiketleme teknikleri 7 oluşturmaktadır. Kullanılan proteaz bağlı olarak, 18 O-etiketleme bölünme ürün 3, C-terminal karboksil grubunda, iki 18 O-atomuna kadar birleşme sonuçlanabilir </sup&gt;. Etiketleme Reaksiyon iki bağımsız süreçler, peptid bağı bölünme ve karboksil oksijen değişiminin reaksiyon 8 ayrılabilir. Bizim paleo (p rotease-bir 18 O-zenginleştirilmiş su mploying ssisted l abeling e) enzimatik 18 O-etiketleme adaptasyonu, biz farklı izotop imzaları verim 50% 18 O-zenginleştirilmiş su kullanılmıştır. Yüksek çözünürlüklü ile kombinasyon halinde matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu zaman-of-flight tandem kütle spektrometresi (MALDI-TOF/TOF MS / MS), karakteristik izotop zarf özgüllük yüksek düzeyde bir bölünme ürünleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz daha önce proteolitik reaksiyonlar 10-11 algılamak ve karakterize endojen proteazlar 9 ve izlemek için paleo-metodolojisi kullanılmıştır. Paleo proteolitik bölünme reaksiyonu özünü kodlar yana, deneysel kurulum basit ve biyokimyasal Enri olduğunuklevaj ürünlerinin chment adımlar atlatılabilir. Paleo-yöntem kolaylıkla proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini ve fizyolojik koşulları temsil karmaşık biyolojik örneklerde proteoliz (ii) analizi izlemek (i) zaman ders deneyler kadar uzatılabilir. Paleo-timecourse deneyler karmaşık proteolitik yolağı reaksiyonlarda hız sınırlayıcı işlem adımları ve reaksiyon ara tanımlamak için yardım. Buna ek olarak, reaksiyon paleo-bize bu tür kendi parçalanma ürünleri rebind ve bir ikinci 18 O-atomu ile birleşmesiyle katalize etmek için yeteneğine sahip serin proteaz tripsin gibi proteolitik enzimlerin belirlemesini sağlar. Böyle bir &quot;çift etiketleme&quot; enzim postdigestion 18 peptidler özel olarak karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile etiketlenmiş olduğu O-etiketleme için de kullanılabilir. Bizim üçüncü strateji enzimler ötesinde 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam etiketleme uzatır ve 18 O-izotop işareti tanıtmak asidik pH koşullarında kullanırpeptidler içine atures.

Biz dinamik proteolitik enzimler tarafından üretilen peptit parçalanma ürünleri içine 18 O-kararlı izotoplar dahil izlemek için paleo-timecourse iş akışı kullanılır. Sunulan yaklaşım nispeten farklı substrat ve proteaz kombinasyonları için proteolitik işleme yolları incelemek için çok yönlü bir araçtır. Reaksiyon boyunca art arda proteolitik reaksiyonlar alınarak, Paleo-timecourse deney substrat ve ürün bolluk zaman çözüme anlık ve işleme ayrıntıları sağlar. Co-lekelenme bir hedef plaka üzerinde asidik matris çözüm örnekleri enzimatik reaksiyon ve matris kristalleşme daha örnek kompozisyon korur durur. Bu nedenle, zaman puan retrospektif enzimatik reaksiyon bitmesinden sonra MALDI-TOF/TOF MS / MS ile analiz edilebilir. Bu deneysel iş akışlarının veri açısından zengin doğası yerleştirmek için, 18 Ey-incorporat hesaplayan bir yarı-otomatik biyoinformatik sistemini hayataHer peptid. Şekil 3 iyon oranları ECE-1 peptit Endokinin C işleme temsilcisi spektral zaman ders planını gösterir. Paleo-timecourse çok boyutlu veri gibidir: Tüm kütle aralığı boyunca MS verileri, genişletilmiş görüş aynı anda peptit substratının bollukları hem de peptid ürünleri bollukları göstermektedir. Zamansal düzenlemesini bölünme olayların sırası deşifresi ve peptid fragmanları stabil parçalanma ürünleri olan belirleyici sağlar. Yakınlaştırılmış-MS veri görünümü izotop her peptid zarflar ve dilinim indüklenen 18 O-etiketleme kolayca onun karakteristik izotop dağılımı ile tanımlanır. 18 O-etiketleme MS / tarafından sonradan belirlenmesi için parçalanma ürünleri pozitif seçimine olanak tanıyan ortaya koymaktadır MS. Toplamda, Paleo-timecourse tahlil proteolitik işleme dinamiklerini yakalar ve proteazların tercih bölünme siteleri değerlendirmek sağlar. Bilgiler henüz başka bir seviyeyetion kullanılan proteaz enzim mekanizmaya bağlı olarak elde edilebilir. Bu tür bir serin proteazdır tripsin gibi bazı proteazlara kovalent bunların peptid parçalanma ürünleri yeniden bağlama yeteneğine sahiptir. ., C-terminal karboksil grubunda bir ikinci 18 O-atomu dahil edilmesi, açil-enzim ara sonuçları hidroliz Şekil 4 saat boyunca farklı isotopomers göreli katkı ortaya çıkan kaymalar gösterir: ilk peptit bağı bölünme reaksiyonu 16 O ve 18 O 1 peptit fraksiyonları arasındaki 1:1 bölünme ile sonuçlanır. 16 O fraksiyonu bir azalma ile birlikte denge% 25 oranı 18 O 2 fraksiyonu artış karboksil oksijen değişiminin reaksiyon sonuçları. Karboksil oksijen değişim reaksiyonu katalize yeteneğine sahip proteazlar bu nedenle proteolitik ter postdigestion etiketleme, ek 18 O-etiketleme akışı için de kullanılabilirMini. Bu tür deneyler olarak, substrat başlangıçta H 2 yokluğunda 18 O, peptid ürünleri temizlenmiş ve proteaz taze bir grup ile inkübe sindirilir, ancak en az% 50 varlığında, bu süre H 2. 18 O. Şekil 4&#39;te gösterilmektedir edilir Bu iki deneysel iş akışları ve bireysel peptid substrat arasındaki birleşme hız farklılıkları görülebilir izotop kuruluş farklılıklar. Postdigestion etiketleme iş akışında, 18 O-birleştirmeleri için her iki oran karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile tespit edilir. Reaksiyon hızı proteaz onun parçalanma ürünleri ile nasıl etkileşim kolayca bağlıdır. Reaksiyon ürünü için afinitesi dolaylı olarak alt tabaka ile orijinal peptit proteaz afinite belirlemek için de kullanılabilir. Bu tür bilgiler peptid dizileri triptik kantitatif proteomikler çalışmalarda digests için, örneğin uygun bir substrat olduğunu belirlemek için yararlı olabilir. Ptripsin ile kolayca parçalanabilen ve çift-etiketli eptides çoğaltıcı ve nicel olarak oluşan ve bu nedenle ideal olarak proteomikler karşılaştırmalı çalışmalar için uygun olan peptitler proteotypic olması muhtemeldir. 19-20 sulu çözücü düşük pH&#39;ta, karboksilik asit gruplarının oksijen değişimi. Bu reaksiyon, proteaz tarafından katalizlenen peptidleri içine kararlı izotopları tanıtmak için stratejiler etiketleme için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Aleo-timecourse (asit katalizörlü etiketleme 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam) iş akışı, biz sentetik peptidler içine 18 O-atomları yavaş birleşme izlenir. Asit katalizörlü oksijen alışverişi izotop dağılımı devletin etkin &quot;donma&quot; MALDI hedef plaka üzerinde matris çözümü, işbirliği kristalizasyon sonra durdu. Biz bir model peptid olarak Anjiyotensin 1 kullanılır ve zamanla izotop zarf (Şekil 5) incelendi. Her araç için iki 18 O-atomları bir tutulumboxyl grup gözlenmiştir. Mevcut deney koşulları altında, asit-katalizli karboksil oksijen değişim reaksiyonu katalize proteaz değiş tokuş 9 çok daha yavaş olduğunu ve sadece 48 gün sonra dengeye ulaştı. Ancak, Aleo yaklaşımı proteazlar tarafından tanınmayan peptidler etiketleme avantajı sunuyor. Buna ek olarak, peptidler, etiketlenmemiş ve etiketlenmiş türlerin izotop zarf tam olarak ayrılması ile sonuçlanabilir asidik yan zincirler sayısına bağlı olarak birden fazla 18 O-atomu içermektedir. Toplam kütle kayması verilen bir peptid içinde asidik artıkların sayısı hakkında bilgi sağlar ve onların yerini MS / MS fragmanı iyon kütle vardiya analizi ile elde edilebilir. 18 O-etiketli peptidlerin etiketsiz meslektaşları gibi aynı kromatografik davranış, yakın, hangi ekranın özdeş elüsyon zamanda kendi karşılaştırmalı analizi sağlar. Özet olarak, asit-katalizli 18 O-etiketleme kimyasal, en alternatif olarak hizmet edebilirzymatic ve metabolik etiketleme kantitatif proteomik yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar. Bu yöntemin özel bir izotop umut verici bir uygulama standart olarak 18 O-etiketli peptid kullanılmasıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3891/3891fig1.jpg" /> Şekil 1. 18 O-tabanlı etiketleme zaman tabii iş akışları sunar. (I) proteaz-katalizli Paleo-timecourse akışı proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerinin izlenmesi için izin verir. Proteaz bağlı olarak, (a) tek bir (bazı metalloproteinazların durumunda) ya da (b) O-18 çift birleşme (belirli serin proteaz durumunda olduğu gibi). (II) çift 18 O-Labeler böyle bir durumda, bu reaksiyonların sonucunda tripsin gibi 18 O-birleşme sadece proteaz-katalize aracılık eder ki içinde, postdigestion etiketleme akışları içinde de kullanılabilirkarboksil oksijen değişiminin reaksiyon. (III) aksine, aleo-timecourse akışı asitli peptid tarafı ve terminal grupları asit katalizörlü karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar dayanmaktadır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3891/3891fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3891/3891fig2.jpg" fo:content-width="3.9in" fo:src="/files/ftp_upload/3891/3891fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Paleo-ve aleo-timecourse stratejileri Deneysel iş akışları. A) (I) bir proteaz-katalize Paleo-timecourse deneyde, substrat H 2 varlığında bir proteaz ile inkübe edilir proteaz bağlı olarak, iki adet 18 O-atomuna kadar birleşme sonucu 18 O. (II) bir eski postdigestion etiketleme deneyde, bir önceki sindirim parçalanma ürünleri ile tekrar kuluçkaya yatırılır<html> H 2 varlığında 18 O. ilgi bir proteaz Çift etiketleme (iş akışı I) yeteneğine Proteazlar iki 18 O-atomları kuruluş katalize edecek. (III) bir asit-katalizli aleo bir deneyde, tüm asidik fonksiyonel gruplar 18 O-atomu içermektedir B) timecourse analiz:.. Zamanlanmış aralıklarda, reaksiyon karışımı bir oyuktan MALDI-hedef plakalar üzerine matris ile bir arada fark vardır üzerine MS- veri toplama, spektral zaman peptid bölünme reaksiyonların araziler yanı sıra bireysel peptid türlerin 18 Ey-şirketleşme araziler oluşturulur ve parçalanma ürünleri MS / MS tabanlı sırası tanımlama için seçilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3891/3891fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . pload/3891/3891fig3highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 3,. Spektral zaman araziler proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini görüntüler. Şelale düzende Paleo-timecourse deneyler MS spektrumları komplo olarak, aynı anda substrat ve ara ve nihai bölünme ürünlerin ortaya çıkması bozulması izlemek mümkündür. Burada tarafından biyoaktif peptid Endokinin C arasında bölünme endotelin dönüştürücü enzim-1 (ECE-1) gösterilmiştir. Dilinim ürünler MS / MS ve izotop zarflar karakteristik 18 O-kuruluş imzaları (kırmızı olarak vurgulanır) görüntülenir saptanmıştır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3891/3891fig4.jpg" fo:content-width="4.1in" fo:src="/files/ftp_upload/3891/3891fig4highres.jpg" /> Şekil 4. Gibi tripsin gibi Serin proteazlar peptid parçalanma ürünleri içine iki 18 O-atomları kadar birleşme arabuluculuk. (I) </s<html> proteaz bazlı etiketleme iş akışında Trong&gt;, taze üretilen peptid parçalanma ürünleri (siyah noktalar etiketsiz, kırmızı tek etiketli peptid kesirler belirtmek) için% 50 tek 18 O-birleşme oranı peptid bağı bölünme reaksiyonu sonuçlar. Bunların reaksiyon ürünleri (örneğin tripsin gibi örneğin serin proteaz) bağlamanız Proteazlar fazla karboksil oksijen değişiminin reaksiyon (yeşil nokta, çift etiketli peptid fraksiyonu) ile ikinci bir 18 O atomu ile birleşmesiyle katalize. Dengede, 0.25:0.5:0.25 bir etiket dağıtımı. (Un-, tek, çift etiketli) ulaşıldı (II) proteolitik termini akışının postdigestion etiketleme, hiçbir peptid bağı bölünmelere oluşabilir. Bunun yerine, iki adet 18 O-atomuna kadar birleşme sadece karboksil oksijen değişim reaksiyonu esas alınmaktadır. Bu nedenle, 18 Ey-dahil sadece kendi peptid parçalanma ürünleri yeniden bağlamanız proteazlar ile oluşur.p_upload/3891/3891fig4large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3891/3891fig5.jpg" fo:content-width="4.7in" fo:src="/files/ftp_upload/3891/3891fig5highres.jpg"/> Şekil 5,. Asit katalizli 18 O-etiketleme karboksil grubu başına iki adet 18 O-atomu birleşme yol açar. Deney boyunca, Anjiyotensin-1 izotopik zarf alımını karşılık gelen birden fazla +2 Da kütle kaymalar (kesikli hatlar) uygulandı 18 O-atomlu. 18 O-şirketleşme siteleri amino asit dizisi (mavi) vurgulanır.

Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Istihdam izotop etiketleme iş akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş su (LEO-iş akışları) nicel ve nitel proteomik çalışmaları için çok yönlü araçlar vardır. (Paleo) proteaz-destekli iş akışlarında,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomları proteazları aracılığıyla proteolitik bölünme ve karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar tarafından tanıtıldı. Asit katalizörlü (aleo) iş akışında<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomları düşük pH&#39;da karboksil oksijen alışverişi tarafından tanıtıldı.

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş Su

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K Görüntüleme.  Boston Biomedical Research Institute. Istihdam izotop etiketleme iş akışları 18 O-zenginleştirilmiş su (LEO-iş akışları) nicel ve nitel proteomik çalışmaları için çok yönlü araçlar vardır. (Paleo) proteaz-destekli iş akışlarında, 18 O-atomları proteazları aracılığıyla proteolitik bölünme ve karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar tarafından tanıtıldı. Asit katalizörlü (aleo) iş akışında 18 O-atomları düşük pH...

Video: Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biyoloji

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Morris Su Labirent Deney

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
To view this article in Chinese, <a href="https://jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/index/details.stp?ID=910">click here</a>

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

Sigma&#39;nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Morris Su Labirent Deney

Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Morris Su Labirent Deney

Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi