Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AYS Post-doktora bursu) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (MH085499, EB003832 ve OD006831 DK) tarafından desteklenmiştir. Bu yazının yorumları için Beth Friedman ve Pablo Blinder teşekkür ederiz.

1. Ameliyat için hazırlık i <ol><li> Ultrasonik temizleyici Maxizyme ve Cerrahi Süt karışımı içinde sonicating tarafından cerrahi aletler temizleyin. Her deneyden önce cerrahi aletler otoklav. </li><li> Gerekli tüm reaktifler ve sarf kullanılabilir olduğundan emin olun. Reaktifler ve tek kullanımlık bir listesi Tablo 2&#39;de verilmektedir. Mümkün olduğunda maruz doku ile temas Reaktifler ve sarf malzeme, steril olmalıdır. </li><li> Anestezi neden. Sağkalım çalışmaları için uygun olan tipik anestetikler Tablo 1 &#39;de tarif edilmektedir. Ayak tutam refleksi eksikliği denetleyerek anestezi cerrahi uçağı olun. Farenin optimum yaşı yaşı 3-6 hafta. Genç farelerin kafatasları daha yumuşak ve ince daha zordur. Yaşlı farelerde inceltme işlemi sırasında daha fazla kanayacak kalın kafatasları var. </li><li> Bir stereotaksik çerçeve 1 içindeki hayvan sabitlemek. Cerrahi ekipman bir listesi Tablo 2&#39;de verilmektedir. </li><li> Vücut sıcaklığı koruyun37 Ture ° C&#39;de bir geri bildirim düzenlenir rektal ısı probu ve takımını kullanarak. </li><li> Nemi korumak için gözleri oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Küçük bir elektrik ustura ile kafa derisi Tıraş. </li><li> 70% (v / v) izopropil alkol ile sürüntü takiben Betadine, kafa derisi ile temizlenir. </li><li> İsterseniz, kalp ve solunum hızları bir pulse oksimetre kullanarak normal sınırlar içinde olup olmadığını kontrol edin. Bir fare için, bu rakamlar sırasıyla 10 civarında merkezi ve 2 Hz gerekir. </li><li> 37 ° C&#39;de (125 mM NaCl, 10 mM glükoz, 10 mM HEPES, 3.1 mM CaCI2, 1,3 mM MgCl2, pH 7.4) (Sigma tüm kimyasal) için steril-Süzülen yapay serebrospinal akışkan (ACSF) bir kısım ısıtmak 2. </li></ol> 2. Bir baş Çerçeve Montaj <ol><li> Pens ve cerrahi makas ile tüm dorsal kafatası yüzeyi üzerinde kafa derisi çıkarın. Kafa ve post her iki tarafında yanal zamansal kaslarının kenarlarına cilt kesinboyun (Şekil 1A) ve kaslara erior. </li><li> Kafatası yüzeyinden ince periost kaldırmak için bir neşter bıçak kullanın. </li><li> Nemli bir pamukla temizleyin kafatası aplikatör uçlu ve bir toz olabilir gelen hava akımı ile kafatası yüzeyi kurulayın. Sonra tüm kafatası yüzeye siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir tabaka uygulayın. Tutkal iyice kurumasını bekleyin. Tutkal bu katman ardçıl adımda diş çimento uygun yapışması için gereklidir. Siyanoakrilat yapıştırıcı steril olması gerekmez. </li><li> Uzağa istenen penceresinin alanından, kafa yüzeyine bir metal bağlayıcı takın. Anestezi hazırlıkları için, küçük bir somun sonra bir cıvata kullanarak görüntüleme kurulumu (Şekil 1B, 1L ve 1N) vidalanan siyanoakrilat yapıştırıcı bir DAB ile kafatası tesbit edilebilmektedir. Tutkal kafatasına takma esnasında konuları girmezse sağlamak için bant ile fındık arkasına sürün. Somunu ve teyp sterilize edilmelidir<html> operasyon öncesi otoklavlayarak. </li><li> Uyanık görüntüleme hazırlıkları için iki bağlantı noktaları (Şekil 1M ve 1N) ile daha rijit bir özel konnektör takın. Bir ½ mm matkap çapak ile kontralateral kortikal yarımkürede üzerinde kafatasında iki delik açın ve sonra iki # 000 vidaları tanıtmak. Bu vidalar kafa kafatasına monte demir yardımcı olacaktır. Altta yatan korteks basınç uygulayarak önlemek için, vidanın sadece bir tam dönüş geçerlidir. Sonra, beyincik üzerinde siyanoakrilat yapıştırıcı küçük bir dab ile özel metal çapraz çubuk takın. Siyanoakrilat yapıştırıcı iyice kurumasını bekleyin. Bu metal bağlantı büyük ölçüde özgürlüğü derece azaltır ve uzunlamasına çalışmalarda aynı görüntüleme alanının taşınması kolaylaştırır. Geniş bir çapraz çubuk burun kılı elektrot yerleştirme ve uyarılması için bol bol yer veriyor. Özel kafa montaj ve bağlantı cihazı üretmek için detaylı planlar çevrimiçi mevcuttur (sics / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). vida ve çapraz çubuk operasyon öncesi otoklav ile sterilize edilmelidir. </li><li> Diş çimento tabakası ile pencerenin konumu, (Şekil 1C ve 1D) hariç, tüm kafatası yüzeyini kaplayacak. Tüm cilt kenarlar çimento kaplı olduğundan emin olun. Dental çimento bileşenleri sterilize edilmesi gerekmez. </li></ol> 3. Bir Cilalı üretimi ve inceltilmiş-kafatası (port) Pencere Takviyeli <ol><li> Matkap çapak keskin olduğundan emin olun ve tekrar kullanmadan kaçının. Bir ½ mm çapak ile somatosensoriyel korteks üzerinden 2 mm bölgeye göre 2 mm&#39;lik ince, diş matkap düşük bir hızda kullanma. Soğutma için ıslak ve inceltme için kuru; ACSF ile kafatası ıslatma ve sonra bir gaz silgi gelen bir hava akımı ile kafatası yüzeyinde kuruma arasında alternatif. Bu kanayabilir kafatası ve süngerimsi katmanı sayesinde incelme gerektirir, ancak controll edilebilirACSF (Şekil 1E) püskürtülerek ed. Kafatası bunu ~ 50 mikron ve pial damarların ıslak kemik (Şekil 1F) aracılığıyla görünür olmalıdır zaman matkap hafif basınç altında flex başlar. Bu kalınlıkta, kemik içindeki küçük beyaz lekeler kuru kafatası yüzeyi nemli hemen sonra bir kaç saniye görünür hale gelecektir. </li><li> Bu noktada, kemiğin ince daha da. Sadece hafif bir dokunuş ile kafatası yüzeyi shaves daha yavaş bir matkap hız, yani, 1000 rpm, kullanın. Bir kalem gibi matkap tutarken küçük kontrollü hareketleri kullanın ve sadece yatay yönde kuvvet uygulanır. Kemik nihai kalınlığı (Şekil 1 G) azından 10-15 um Resimler ~ edilmelidir. Kuru kafatası yüzeyi nemlendirilmiş zaman kemik yeterince ince olduğunda, kemik küçük beyaz noktalar artık görülebilir. </li><li> Kalay oksit tozu ile pencere bölge parlatın. Silikon akvaryum sealant ile batırılmış Önceden hazırlanmış bir matkap ucu takınkonik bir kamçı (inset, Şek. 1H) bırakarak çekilmiş. Silikon kırbaç ameliyattan önce en az bir gün, hazırlanan kullanmadan önce izopropanol% 70 ile sterilize edilmelidir. ACSF (Şekil 1 H) ve bir damla birlikte penceresinde tozu küçük bir tutam yerleştirin. Hafifçe kafatası yüzeye hareketli kamçının ucu dokunarak kadar on dakika için penceresi üzerine bulamaç karıştırın. ACSF kullanarak penceresinden iyice kalay oksit toz uzaklıkta yıkayın ve bir hava akışı ile iyice kemik kurulayın. Önceki adımlarda sondaj bıraktığı Yüzey usulsüzlük ve yapışık kemik parçacıkları parlatma (Şekil 1H ve 1I) sonra çıkartılmalıdır. Kalay oksit tozu steril olması gerekmez. </li><li> Hiçbir kare parça kesin. Pencerenin boyutunu biraz daha küçük 0 cam kapak. Hafifçe bir cetvel kullanarak kapak kayma ayrılmış yatay ve dikey çizgiler skor bir katip kullanın. Sonra bir petri ve kn da kapak kayma yerleştirincam parçaları ayırmak için bir masa kenarına çanak ock. Tüm petri sonra sterilite sağlamak için otoklavlanabilir. </li><li> Uygun boyutta bir cam kapak yakındaki kuru pencere yerleştirin. Kırık bir tahta pamuk uçlu aplikatör ucunu kullanarak penceresi üzerine siyanoakrilat yapıştırıcı küçük bir dab uygulayın ve hızlı bir şekilde tutkal üstüne kapak cam hazır kesilmiş parça itin. Cam kapak altında hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. Yavaşça kafatası yüzeye karşı cam kapak itin ve birkaç saniye (Şekil 1J ve 1O) basılı tutun. Tutkal 15 dakika içinde tamamen kurumasını sağlayın. Bu kurutulduktan sonra aşırı siyanoakrilat tutkal bir bisturi ile bıçak cam kapak üst yüzeyi ile kaldırılabilir. Diş çimento, cam kenarları mühür ve oluşturmak biraz eğimli lensi (Şekil 1K ve 1O) su tutmak için de kaldırdı. </li></ol> 4. Kurtarma <ol><li> Sıcak bir kafes aşağıdaki cerrahide hayvan yerleştirin. Monitörhayvan periyodik tamamen anestezi kurtarır kadar. </li><li> Hazırlanması, birden fazla gün için hayatta kalmak için anlamına edilirse, analjezi için buprenorfin (rodent g başına 0,03 mg) sağlamaktadır. İlk implantasyondan sonra bu tipik olarak görüntü hayvan en az bir gün. </li></ol> 5.. Görüntüleme Hazırlık <ol><li> Bir baş desteği (Şekil 1L ve 1M) gibi çerçeve kullanılarak, görüntüleme için bir optik breadboard hayvan stabilize. Bir tutma cihazı Qioptiq ya ThorLabs ticari olarak temin optomechanical bileşenleri yapılabilir. Bizim ayrı plaka hayvan ve bir ünite 3 olarak monte tüm fizyolojik izleme cihazları ile cerrahi ve iki foton görüntüleme suit arasında taşınabilir. </li><li> Kan akışı görüntüleme isteniyorsa,% 5 0.05 mL (w / v) flüoresan-dekstran boya kan serumu (Şek. 2A ve 2C 2H üzere etiketlemek için ya kuyruk damarından ya infraorbital damarı yoluyla steril salin enjekte içinde çözülmüş </strong&gt;) 4-7. Bu, genel anestezi altında yapılmalıdır. Dekstran çözümleri daha viskoz gibi infraorbital ven yönetimi, yeni başlayanlar için daha kolay olabilir. Kuyruk damarı koyu renkli farelerde bulmak zor olabilir ve ven başarısız bir enjeksiyondan sonra daraltmak eğilimindedir. Yeşil emisyon ile görüntüleme damar, bir floresein izotiyosiyanat dekstran kullanın. Kırmızı salma için bir Texas Kırmızı dekstran kullanın. Yüksek moleküler ağırlığı olan dekstranlar, boya birkaç saat süreyle dolaşımı içinde kalır. Alternatif olarak, endojen floresan etiketleri ile hayvanların uygun iki fotonun dalgaboyu doğrudan görüntülenebilir. Dekstran çözeltisi gelecekteki kullanım için alikots içinde dondurulabilir. </li><li> Hafifçe nemli bir pamukla pencere yüzeyinin temizlenmesi aplikatör uçlu. </li><li> Anestezi hazırlıkları uzun süreli görüntüleme için, vücut sıvıları ve enerji gereksinimleri korumak gram her 2 saat için 3 uL bir hacimde steril laktatlı Ringer solüsyonu intraperitoneal olarak enjekte edilir. &lt;/ Li&gt; <li> Zaman uyanık halde görüntüleme hayvanlar, stres seviyesini azaltmak için bir seferde sadece birkaç saat kafalık sınırlayın. Yiyecek ve su için görüntüleme oturumlar arasında ev kafesine hayvan dönün. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı bir pencere birkaç ay pial yüzey altında 250 um görüntüleme derinliklerine kadar izin verecektir. Bu yöntem, kortikal parankimi 8 içinde vivo kılcal kan akışı 4, 8, mikrogliyal aktivasyon 8, 9 ve dendritik yapısında incelemek için kullanılmıştır. Bir örnek olarak, serum Texas Red dekstran (Şek. 2A) intravenöz enjeksiyonu ile etiketlenmiştir sonra, bir anestetize Thy1-sarı bir floresan proteini (YFP) fare kortikal vaskülatürün göstermek için iki-fotonlu görüntüleme kullanabilir. Dural damarları biraz dura mater kortikal yüzey (Şekil 2C, ok) yukarıda görülebilir. Büyük pial arteriol ve venüller liKortikal yüzeyinde e (Şekil 2B). Onlar kortikal doku besleyen yoğun bir kılcal damar yatağı (Şekil 2E için 2H) içine dal budak salmak korteks içine bu yüzey ağı ve dalıştan Penetran damarları dalı. Kortikal nöronların duyduğunuz derin YFP, bu fare hattı için bir sinyal endojen Dendritik Arbors, ikinci bir kanal 10 (Şekil 2B 2H için) aynı anda görüntülenebilir. Kemiğin ikinci harmonik sinyali üçüncü bir kanalda toplandı ve görüntü yığınlarının toplandıktan sonra inceltilmiş kafatası (2C üzere Şek. 2A) ve kalınlık ölçmek için kullanılabilir. Kortikal vasküler dinamikleri derinden anestezikler 11 etkilenir. İkinci bir örnek olarak, biz alışkın uyanık fare iki-foton mikroskopi tarafından toplanan spontan vasoactivity bir video gösteriyor. Lümen çapında tanınmış vazomotor salınımlar bir pial arteriyol görülen, ancak bir komşu venül ile edilir. Buvasoactivity bazal aralığı üretan anestezisi 4 ile azalır. Kan akımında spontan ve uyarılmış değişiklikleri ölçmek için, tek tek damar damar çapı ve kırmızı kan hücrelerinin hızı hem de yakalamak için uyarlanmış çizgi tarama teknikleri kullanır. İki foton mikroskopi kullanılarak kantitatif kan akışını görüntülemede Ayrıntılı kaynakları, 12 3. mevcuttur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Şekil 1.. A bağlantı noktası pencere için Prosedür. A bağlantı noktası pencere oluşturmak için prosedür sıralı adımlar (A K) Görüntüler. Ayrıntılı talimatlar için metne bakınız. β = bregma ve λ = lambda. Anestezi hazırlıkları görüntüleme sırasında başını sabitlemek için (L) Cıvata ve somun sistemi. (M) Özel uyanık hazırlıkları için çapraz çubuk baş bağlama işlendi. Bu örnekte, bir bağlayıcı da tekrarlayan electrocorticogram kayıtlar için yerleştirildi. (N)Şematik baş bağlama ve çeşitli bileşenlerinin konumu dorsal görünümü gösteren. Panel L kullanılan fındık paneli M. İki kullanarak çapraz çubuk alternatif olarak kastedilen # 000 vidaları uyanık görüntüleme hazırlıkları ile eklenen istikrar için çapraz çubuk montaj ile ilave edilir. A bağlantı noktası pencere kesiti gösteren (O) şematik diyagramı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Şekil 2. Fare korteks damarsal ve sinirsel yapının iki-foton görüntüleme. Tüm görüntüler pencere implantasyonu 10 2 gün sonra bir Thy1-YFP fare bir LİMANLARI pencereden toplanmıştır. Vasküler (A) ve dendritler (B) ile ilgili olarak inceltilmiş kafatası gösteren koronal yönde doku 150 mikron üzerinde maksimal projeksiyon. Kemik (mavi) 900 nm eksitasyon 450 nm emisyon de ikinci harmonik floresans toplayarak tespit edildi <sup&gt; 8. Damar (kırmızı) damardan enjekte 70 kDa Texas Red dekstran 6 etiketli edildi. Nöronların dendritik alanlar (yeşil) Thy1-YFP transjenik fare hattına endojen vardır. Pia altında farklı derinliklerde yatay olarak doku 50 mikron üstü (CH) Maksimal projeksiyonlar. Veri Paneller gösterilen aynı görüntü yığından A ve B Dural damarlarının sadece kortikal yüzeyi (C de ok) yukarıda görülebilir. Kısaltmalar ACSF = yapay beyin omurilik sıvısı Ports = cilalı ve güçlendirilmiş inceltilmiş kafatası penceresi YFP = sarı floresan protein i açıklanan işlemleri yerel Kurumsal Hayvan Bakımı tarafından onaylanmış olduğundan emin olun ve Komite kullanın.

<ol>
	<li>Cetin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).</li><li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes.">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).</li><li>Driscoll, J. D., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+two-photon+imaging+of+blood+flow+in+cortex.">Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , 927-937 (2011).</li><li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extends+arteriole+capacity.">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+2-Photon+Imaging+of+Blood+Flow+in+the+Neocortex+through+a+Cranial+Window.">A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window.</a> J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reversible+changes+in+dendritic+spine+structure+in+vivo+gated+by+the+degree+of+ischemia.">Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia.</a> Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).</li><li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-mediated+control+of+cerebral+blood+flow.">Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).</li><li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Marker, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+neural-hemodynamic+coupling+and+the+hemodynamic+response+function+in+the+awake+rat.">Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat.</a> Neuroimage. 32, 33-48 (2006).</li><li>Shih, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2011).</li><li>Kobat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li><li>Ascenzi, A., Fabry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+dissection+and+measurement+of+refractive+index+of+osteons.">Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).</li><li>Stosiek, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+cerebral+blood+flow+using+laser+speckle.">Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 21, 195-201 (2001).</li><li>Villringer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+perfusion+of+the+rat+brain+cortex:+An+in+vivo+confocal+microscopy+study.">Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study.</a> Circulation Research. 75, 55-62 (1994).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+for+the+quantitative+study+of+cerebrovascular+physiology.">Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &#38; Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).</li><li>Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+imaging+and+characterization+of+the+microvasculature.">Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature.</a> Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).</li><li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory animal anesthesia. , (1987).</li></ol>

Ifşa şey yok.

İki foton A bağlantı noktası pencereden görüntüleme lazer ışığı zayıflar ve daha büyük derinliklerde 8 de optik sapmaları ekler inceltilerek kemik ve dura, üzerinden iletim gerektirir. Bununla birlikte, bu mahzur, rağmen, yukarı pial yüzeyinin altında 250 um ile görüntüleme derinlikleri 900 nm uyarma ile elde edilebilir. Büyükşehir görüntüleme derinliklerinde prensipte 13 daha uzun dalga boylarında uyarma ile mümkün olabilir. Bu yöntemin önemli bir avantajı tam kraniotomi 14, 15 içeren yöntemler geçici mevcut olabilecek kortikal enflamasyon yokluğudur. İyi hazırlanmış LİMANLARI pencere implantasyonu 8 takiben anjiyogenez veya inflamasyon hiçbir belirgin belirtileri göstermesi gerekir. Bu yapı ile vaskülatürün görüntüleme deneyi sırasında in vivo olarak değerlendirilebilir, ya CX (3) CR1-GFP fare hat 8, 16, 17 in mikrogliya morfolojik değişikliklerin tespit ederek. Ayrıca, post hoc İmmunohistolojik başına olmalıdırglial fibriller asidik protein 8 için bir antikor kullanarak, örneğin yüzeysel korteksinde astrogliosis yokluğunda teyit etmek için oluşmuştur. A bağlantı noktası penceresi üreten en zor adım kalınlığı 10-15 um ile kemik inceltme edilir. Geniş bir alanda floresan diseksiyon mikroskobu altında pencerenin Periyodik muayene inceltme işlemi sırasında kafatası kalınlığı ölçmek için de yararlıdır. Kortikal yüzeye yakın Floresan etiketler ıslak kafatası yoluyla açıkça görünür olmalıdır. Kafatası kalınlığı daha doğru bir ölçmek için, kemik ikinci harmonik sinyali iki-fotonlu mikroskopi (Şek. 2A için 2C) altında bir üç boyutlu bir yığın ölçülebilir. Bu tutkal ve cam kapak, kemik uygulanmasından önce yapılır ve gerekirse başka inceltilmiş edilebiliyorsa. Yetersiz yoksul görüntüleme derinlemesine sonuçları incelme. Parlatma sondaj mümkün artık olduğunda kafatası inceltmek için devam edecek ve yardımcı olacakyüzey düzensizliklerini ve yapışık kemik parçacıkları azaltır. Ön çalışmalar olarak, cilalama görüntüleme derinliği hafta başlangıç ​​implantasyondan sonra iyileştirir olduğunu bulduk. Ancak, parlatma yararı üzerinde titiz bir analizi yapılmamıştır. Kemik üstüne siyanoakrilat yapıştırıcı ve kapak cam uygulaması ışık saçılımı azaltmak ve derin görüntüleme sağlamak için kritik bir adımdır. Delme işlemi sayesinde, kemik yüzeyine daha sonra, cilalama, düzensiz olması, ve böylece ışık saçılması olacaktır. Siyanoakrilat yapıştırıcı uygulaması bu usulsüzlüklerin doldurur ve örten cam olmayan bir saçılma pürüzsüz bir yüzey bırakır. Önemlisi, üretici şartnamelere göre 1.45 ve 1.52 olan tutkal ve cam kapak için kırılma endeksleri yakından 1.55 18 kemik olduğunu eşleştirilir endekslidir. Bu 1,00 kırılma indeksine sahip inceltilmiş kafatası üzerinde hava veya su olan üzerinde bir gelişmedir, bir oland 1.33. Kritik, siyanoakrilat tutkal daha kemik yeniden büyümesini engellememek yardımcı olur. Bu, ilk ameliyat sonrası ilave bakım ihtiyacı olmaksızın, en çok üç ay için uzunlamasına görüntüleme sağlar. Yoksul görüntüleme derinliği ikinci bir nedeni kanama veya ödem giden pial damarlara zarar verir. Matkap gelen titreşimleri en aza indirilmelidir. Vakaların küçük bir kısmında, dura içinde kanama kaçınılmaz olacaktır. Dura mater damar inceltme işlemi sırasında bozulur kafatasının vasküler pleksus, sürekli olmasıdır. Dural kalınlaşma ve anjiyogenez birbirini takip edecek şekilde alt-dural kanama belirtisi hazırlıklar atılmalıdır. LİMAN pencerenin başarı oranı uygulaması ile% 80 gibi yüksek olabilir. Bazı deneylerde için, boyalar / virüsler enjekte veya bağlantı noktalarını penceresi altında doku içine elektrotlar eklemek için gerekli olabilir. Bu küçük bir üretmek mümkündürpipetler veya elektrotlar bir stereotaksik kol veya Sutter manipülatör 19 kullanılarak sokulabilir hangi aracılığıyla pencere, bitişik delik. Hayvan gelecek oturumlarda tekrar yansıması için ise bu delik kemik mum ile mühürlenmeli edilebilir. Ancak, elektrotlar tanıtımı, depresyon gibi yayılan korteks ve akut patoloji inflamasyon elbette kurşun yapabilirsiniz. LİMAN penceresi de beyne optik erişim gerektiren herhangi bir görüntüleme yöntemi için uygun olmalıdır. Bu tür intrinsik optik görüntüleme 20 ve lazer görüntüleme 21, ya da bu konfokal 22 ya da iki-fotonlu mikroskopi 23 gibi teknikler Optik kesit benek gibi yüzey görüntüleme tekniği içerir. Ayrıca, bir LİMANLARI hazırlanması gibi optik koherens tomografi 24 ve foto akustik mikroskopi 25 gibi geniş bir alanda transkranial görüntüleme tekniklerindeki çözünürlüğünü arttırmak gerekir. Son olarak, portlar penceresicam kapak olarak uyanık hayvanların görüntüleme için uygun penceresi 4 ila sertliği ekler. Baş bağlama fazla diş çimento (Şekil 1L) uygulaması öncesinde kontralateral hemisferde iki self-tapping # 000 vida girişi ile stabilize edilir. Kafa-fiksasyon Alışma görüntüleme sırasında azaltılmış hayvan hareketi önemlidir. Yeni bir hayvan yavaş yavaş 15 dk seans ile başlayan ve birkaç saate kadar çalışma, görüntüleme öncesinde 3 ila 7 günlük bir süre içinde kafalığı alışkın olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ajan </td><td> Doğum şekli </td><td> Fare için Doz </td><td> Süre </td><td> Notlar </td><td> Kaynak </td><td> Ref Ref </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 mg / g </td><td> 15-60 dak </td><td> Dar güvenlik marjı. Yavaş yavaş anestezi uygun dozu kadar çalışın. Gerektiği gibi indüksiyon dozunun% 10 tamamlayın. </td><td> 036.093; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketaset) Xylazine (Anased) ile karıştırılır </td><td> IP </td><td> 60 mg / g (K) 10 mg / g (X) (aynı şırınga içinde mix) </td><td> 20-30 dakika </td><td> Ksilazin bir kas gevşetici ve ağrı giderici olarak birlikte enjekte edilir. Gerektiği gibi indüksiyon dozunun% 50 sadece Ketamin tamamlayın. </td><td> (K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Izofluran (Isothesia) </td><td> Soluma </td><td> % 4 indüksiyon için alveoler konsantrasyon (MAC) anlamına gelir; bakım için% 1-2 MAC </td><td> 4-6 saat. </td><td> % 70 oksijen ve% 30 nitrik oksit karışımı içinde sağlanan. Uzamış anestezi toparlanma yavaş olur. </td><td> 029.403; Butler Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Yaşam çalışmaları için anestezik ajanların Önerilen. <table border="1"><tbody><tr><td> MADDE </td><td> ŞİRKET </td><td><strong&gt; KATALOG # / MODEL </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> Buprenorfin (Buprenex) </td><td> Butler Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Floresein izotiosiyanat dekstran, 2 MDa moleküler ağırlığı </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> İzopropil alkol </td><td> Balıkçı </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Ringer Çözümü </td><td> Butler Schein </td><td> 009.846; </td></tr><tr><td> Lidokain çözeltisi,% 2 (v / v) </td><td> Butler Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Tuzlu </td><td> Butler Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Cerrahi Süt </td><td> Butler Schein </td><td&gt; 014.325 </td></tr><tr><td> Texas Red dekstran, 70 kDa molekül ağırlığı </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> SARF </td></tr><tr><td> Karbür çapak, 1/2 mm uç boyutu </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Cottoned ucu aplikatörler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Cam, hiçbir örtün. 0 kalınlığı </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate yapıştırıcı </td><td> ND Sektörler </td><td> 31.428 H04308 </td></tr><tr><td> Gaz silgi </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Kavrama çimento tozu </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Kavrama çimento çözücü </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Insülin enjektörü, 29.5 iğne ile 0.3 mL hacim </td><td> Butler Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> Somun ve başını sabitlemek için vida </td><td> Digikey </td><td> Somun, H723-ND, cıvata, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Oftalmoloji merhem </td><td> Butler Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Bisturi bıçakları </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Vidalar, self-tapping # 000 </td><td> JI Morris Şirketi </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> Silikon akvaryum mastik </td><td> Perfecto İmalat </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Kalay oksit tozu </td><td> Mama Mineraller </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> EKİPMAN </td></tr><tr><td> Cam scribe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Mikroskop Kesme </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1. FC </td></tr><tr><td> Elektrikli matkap </td><td> Foredom veya Osada </td><td> K.1020 (Foredom) veya EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Elektrikli tıraş </td><td> Wahl </td><td> Serisi 8900 </td></tr><tr><td> Forseps, Dumont yok. 55 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Görüşleri düzenlenmiş ısı yastığı </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (rektal Termistör, 40-90-5D-02; h) pad, 40-90-2-07 yemek </td></tr><tr><td> Izofluran vaporizer </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Pulse oksimetre </td><td> Starr Yaşam Bilimleri </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Minyatür, Tornavida </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Stereotaktik çerçeve </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 900 (fare anestezi maskesi ve non-rüptürü kulak çubukları ile) </td></tr><tr><td> Cerrahi makas, kör uç </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Ultrasonik temizleyici </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Özel reaktifler, sarf malzeme ve ekipman listesi.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

In vivo kortikal fonksiyon görüntüleme intrakraniyal çevre aksamadan beyne optik erişim gerektirir. Biz, çapı birkaç milimetre yayılan ve ay dayanır farenin kafatasının bir cilalı ve güçlendirilmiş inceltilmiş kafatası (portlar) pencere oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Kafatası optik netlik elde etmek için matkap tutulan bir el kalınlığının 10 ila 15 um ile inceltilir ve daha sonra siyanoakrilat yapıştırıcı ve bir cam kapak ile kaplanır: 1) sertlik, 2) sağlamak kemik yeniden büyüme inhibe ve 3) ışık saçılımı azaltmak kemik yüzeyine düzensizlikler den. Kafatası ihlal olmadığı için, çalışılan süreci etkileyecek herhangi bir inflamasyon büyük ölçüde azalır. Kadar kortikal yüzeyinin altında 250 um arasında görüntüleme derinlikleri iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu kullanılarak elde edilebilir. Bu pencere de anestezisiz ve uyanık hem hazırlıklarına serebral kan akımı ve hücre fonksiyonu incelemek için uygundur. Daha da op sunuyorportunity optogenetics kullanarak hücre aktivitesi işlemek için veya ışığa dolaşan ışınlama tarafından hedef damarlarındaki kan akımını bozabilir.

Watch this Scientific Journal Video about A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain at JoVE.com

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.8K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Video: A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Nörobilim

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Reconsolidation Pencere sırasında Extinction Eğitim Fear Kurtarma önler

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Için inceltilmiş-kafatası Kortikal Pencere Tekniği<em&gt; In Vivo</em&gt; Optik Koherens Tomografi Görüntüleme

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...