Biz yararlı tartışmalar için teşekkür Patrick Hayden (Mattek) ve Robert Smith ve EM becerileri Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi Libby Perry. Bu çalışmada DAD NIDCD hibe DC010187 tarafından finanse edildi

1. Biyogüvenlik kabini EpiAirway dokular için hazırlanması <ol><li> Geri ve eldiven bağlı saç, özel bir laboratuvar önlüğü giymek, laminer akış başlar. 5 dakika sonra, kabine (Pipet, ipuçları, santrifüj tüpleri, vb) herhangi bir alet taşımak bir yana, sprey,% 70 etanol ve temiz bir kağıt havlu ile silin ile biyogüvenlik kabini iç ve kanat. % 70 etanol ile tekrar temizlenir iç Sprey ve kurumaya bırakın. Temiz tarafında araçları hareket ettirin ve etanol prosedürü tekrarlayın. </li><li> Kabine aerosol bariyer pipet uçları ve adanmış Pipet kullanın. Ayrı ayrı sarılmış steril serolojik pipetler kullanmak için, ambalaj dışında atarak, laminer akış ile takılı sonuna geçmesi açık ara ve kabin içine pipet kaydırın. </li><li> EpiAirway ekler steril forseps ile ele alınması gerekir. Yeri 6-inç ince ucu kavisli kendinden sızdırmaz sterilizasyon keseleri ve otoklav içine forseps diseksiyon. En az altı günlük kullanım için hazır olması için yeterli hazırlayın. </li></ol> 2. EpiAirway dokuların Unpacking <ol><li> % 70 etanol ile biyogüvenlik kabini çalışma yüzeyine püskürtün ve temiz bir kağıt havlu ile silin. Tekrar Sprey ve yüzey kullanmadan önce kurumasını bekleyin. EpiAirway kutusunu açın ve strafor ve ambalaj malzemesi atmak. </li><li> EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya, HAVA-100-AA ABF (MM), Mattek sahipli ve ekler ile kit olarak gönderilir. Biyogüvenlik kabini, ortam türü ve tarihi ile etiket altı steril 50 ml santrifüj tüplerine ve kapakları gevşetin. % 70 etanol ile medya şişe Sprey ve kabin içinde açık. 4 ° C&#39;de kısım her tüp için yeni bir steril serolojik pipet kullanarak her bir tüp içine 25 ml MM, kapaklar, ve mağaza sıkın. MM her gün taze bir kısım kullanın. </li><li> 2.2 1 X Dulbecco&#39;nun taze bir şişe fosfat, kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin (D-PBS) kullanarak yukarıdaki tekrarlayın. Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tekrar tekrarlayın. 4 alikotları Mağaza ° C. </li><li> EpiAirway ekler HAVA-100 ° C katı medya içeren agaroz 4, 24 plaka gelmesi ve 6-iyi kullanmak için tabak içine yerleştirilmesi gerekir. Etanol-dayanıklı bir kalem kullanarak tarih ve açıklama ile her plaka etiketleyin. Her kuyuya 4 ° C EpiAirway MM Yeri 1 mililitre. Ulaşım, ambalaj,% 70 etanol ile sprey, ve biyogüvenlik kabini yer plaka çıkarın. Bandını çıkarın ve plakasını açın. Otoklavlanmış forseps kullanarak, EpiAirway ekler Nemli gazlı bez üzerine çıkarın. </li><li> 6 plaka bir kuyuya bir agaroz serbest yardım etmek için bir kıvırma hareketi ile otoklava forseps ile insert, yer ve Pick up. Bazı agaroz ortam için taşıma plakası sıcaklığı artar, özellikle de eklemek uygun olabilir. Steril bir pamuklu çubukla dikkatlice yerleştirin agaroz kaldırmak için kullanın. Membran dokunmaktan kaçının ve ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Plaka% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. </li><li> Ortak kültürler başlamadan önce inkübatör dengeye dokular için en az 24 saat bekleyin. </li></ol> 3. EpiAirway dokuların bakımı <ol><li> Otoklavlanmış forseps kullanarak, bir ekleme pick up ve doku üzerine hafifçe kalsiyum ve magnezyum ile, önceden ısıtılmış D-PBS 200 mikrolitre pipet ve ekleme rock. Tilt bir açıyla yerleştirin ve insert altındaki membran tutan plastik halka karşı steril P1000 pipet yerleştirmek. Doku dokunmayın. D-PBS durulama ve etiketli bir steril cryovial yerleştirmek aspire edin. Numuneler -20 ° C&#39;de dondurulmuş ve sonraki bir tarihte, müsin ve / veya sitokin ifade için test edilebilir. </li><li> Aspire ve taze MM 1 mililitre ile değiştirerek günlük bazal MM değiştirin. Her bir kuyu için yeni bir bariyer pipet kullanın. Bir gecede% 10 çamaşır suyu ile kullanılan medya davranın ve atın. </li></ol> 4. Aşılama, EpiAirway dokuların <ol><li> Çikolata agara, dondurulmuş gliserol stok tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) taze bir kültür dışarı Streak . Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör geceleme büyütün. </li><li> Ertesi gün, kalsiyum ve magnezyum ile yaklaşık 0,7 OD (600 nm) önceden ısıtılmış D-PBS NTHi tek koloniler tekrar süspansiyon haline getirin. Optik yoğunluk ölçüm şiddetle önce Vortex. Optik yoğunluk ilişkisi koloni oluşturan NTHi ml (CFU / ml) başına birimleri 0.2 &#39;lik bir OD (600 nm) yaklaşık 1.0 x 10 8 CFU / ml eşittir. Bu nedenle, bir OD 0.7 (600 nm) yaklaşık 3.5 x 10 8 CFU / ml. Bu algoritma, aşılama için önce her NTHi suşu için valide edilmelidir. </li><li> EpiAirway dokuların HAVA-100, 0.6 cm 2 ve 0,4 mikron membran yüzey alanına sahip ekler yetiştirilmektedir . ~ 8.0 x 10 5 ~ 1.0 x 10 6 dokularda oluşan &lt;/&gt; Hücreleri destek. 12 - Bu nedenle, 1.0 x 10 7 CFU bir aşılama yaklaşık 10 enfeksiyon çokluğu karşılık gelir. Aşılamak için, 3.1 &#39;deki gibi her EpiAirway eklemek yıkayın, daha sonra bakteriyel süspansiyon biyogüvenlik kabini içinde her EpiAirway eklemek apikal yüzeye 4.2 hazırlanan 28 mikrolitre ekleyin. Bazal MM aşılamak etmeyin. Inkübatör her plaka dönün. </li></ol> 5. NTHi inokulum Kantitasyonu <ol><li> Sterilize etmek için% 0,1 jelatin (PBS-G), otoklav ile fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi hazırlayın. Her tüpe steril PBS-G ve inokulum kısım 900 mikrolitre OD (600 nm) dayalı istenilen 01:10 dilüsyonları Etiket steril 1,5 ml Eppendorf tüpleri. </li><li> Çikolata agar plaklarına inoküle NTHi numaralandırmak için gerekli sayısını belirler. , Bir saat boyunca üst yarısında dinlenme plakanın alt baş aşağı bir hava inkübatör bu levhaların yerleştirin. Bu plaka 37 sıcak ° C ve NTHi açılan kaplama kolaylaştırılması, kuru yüzey. Sağlayacaktır </li><li> 4.2 &#39;den ilk tüp bakteriyel süspansiyon 100 mikrolitre ekleyerek inokulum seri 01:10 dilüsyonları başlayın. Vorteks her seyreltme 5 saniye boyunca güçlü bir şekilde bir sonraki önce yapmak için. Her bir seyreltme için yarım tabak kullanarak, önceden ısıtılmış ve yüzey kurutulmuş çikolata agar plakları üzerine 10 mikrolitrelik alikotları bırakın. Beş altı 10 mikrolitrelik alikotları birlikte çalışan her 100 mm plaka bir yarım sığabilir. , Baş aşağı 37 nemlendirilmiş bir kuru yer ° C CO 2 inkübatör geceleme . </li><li> Ertesi gün, her açılan 15-30 farklı koloniler dilüsyonları sayma ve NTHi gerçek canlı inokulum geri hesaplanırken CFU / ml belirlemek. </li></ol> 6. NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür <ol><li> -20 Bakteri ve dondurma aynı gerginlik ° C gelecek analizi için etiketli cryovial inoküle her doku yıkamalar havuzu, sonra 3.1 &#39;deki gibi, her 24 saatte bir, ekler yıkayın. Bu örnekler nokta leke müsin varlığı veya ELISA ile sitokinlerin ifadesi için çalışılmalıdır. Alternatif olarak, dokularda mRNA için hasat edilebilir ve qPCR ilgi genlerin yapılabilir. 3.2 &#39;deki gibi günlük bazal MM değiştirin. Co-kültür boyunca devam edin. </li></ol> 7. EpiAirway dokuların hasadı <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS saponin taze% 1 solüsyon hazırlayın, filtre sterilize ve 37 ° C sıcak </li><li> 37 ° C, kalsiyum ve magnezyum olmadan, MM ve D-PBS başka bir 50 ml tüp Sıcak </li><li> 5.1 &#39;sulandırma tüpleri hazırlayın yanı sıra eklemek sayısı ve NTHi gerilme ile etiketlenmiş eklemek başına bir boş steril 1,5 ml Eppendorf tüp,. </li><li> EpiAirways yapışık ve içselleştirilmiş organizmalar, ya da sadece içselleştirilmiş bakteriler için iki içeren, toplam hücre ilişkili bakteri ya da hasat edilebilir. </li><li> , Damla plakalı hücre ilişkili veya 5.2 gibi bir hava inkübatör etiket ve bir saat süreyle kuru NTHi işgal gerekli çikolata agar plaklarına sayısını belirler. </li><li> Toplam hücre ilişkili bakteriler hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan 200 mikrolitre D-PBS ile üç kez EpiAirways apikal yüzey durulama, daha sonra ekleme eğilme ve bazal membran kalan MM durulayın. Ilk yıkamada daha sonra analiz için dondurulmuş olabilir; aşağıdaki yıkar iptal. </li><li> 7.1 &#39;den% 1 steril saponin çözüm yıkanmış MM olmadan yeni bir 6-plaka, insert, ve pipetle 250 mikrolitre her doku apikal yüzeye yerleştirin. 10 dakika boyunca inkübatör dön. </li><li> Inkübatör çıkar ve P1000 steril bir pipet kullanarak, geri ve ileri hareket, insert kenarlarından doku kaldırmak için dairesel bir hareket takip membran dokuların fırçalayın. Büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak, 7.3 &#39;de hazırlanan boş etiketli tüpe süspansiyon yerleştirin. Eklemek apikal yüzeye kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 250 mikrolitre ekleyin. </li><li> Kalan herhangi bir doku hasat edilebilir olup olmadığını belirlemek için ters bir faz-kontrast mikroskop kullanarak eklemek inceleyin. Gerekirse, başka bir steril P1000 pipet ile tekrar fırçalayın, sonra büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak tüp 7.8 süspansiyon ekleyin. 1 mililitre kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tüp toplam hacmi getirin. </li><li> En yüksek hızda bir dakika boyunca şiddetle vorteks hücre süspansiyonu. 26 gauge iğne ile donatılmış, 1 ml steril bir şırınga, iğne süspansiyon ile enjektöre aspire. Yavaş yavaş süspansiyon özen baloncuklar oluşturmak için değil, iğne 3 kez geçmektedir. Bir dakika boyunca kuvvetlice tekrar karıştırın. </li><li> 7 hazırlanan ilk sulandırma tüpü içine geniş çaplı bir pipet, yer süspansiyon 100 mikrolitre kullanma.3. Vortex şiddetle beş saniye sonra seri 01:10 dilüsyonları. Drop-plaka yüzey kuru çikolata agar plakları üzerine istenilen dilüsyonları. </li><li> Içselleştirilmiş bakteri sadece hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 200 mikrolitre her ekleme 3 kere yıkayın. Ilk yıkamada saklayın ve dondurma. Önceden ısıtılmış MM nihai konsantrasyonu 100 mikrogram / ml gentamisin sülfat ekleyin. 1.5 ml eklemek için hasat edilebilir başına medya hazırlayın. Gentamisin içeren MM ile bazal MM değiştirin ve apikal yüzeye gentamisin içeren MM 300 mikrolitre ekleyin. Bir saat geri plaka CO 2 kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Apikal yüzey gentamisin içeren MM çıkarın ve apikal yüzey ve yaygın olarak kalsiyum ve magnezyum olmadan önceden ısıtılmış D-PBS ile ekleme bazal membran yıkayın. 7,7-7,11 içinde gibi devam edin. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları: NTHi ile 5 günlük bir ko-kültür (A) bulaşmamış EpiAirway doku ve (B) doku elektron mikrograflar sonra Tarama Şekil 1&#39;de gösterildiği NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür apikal önemli bir hasara yol açmaz . dokular, EpiAirway modeli yardımcı programı vurgulayan. Dokular içinde zamanla sayısal içselleştirilmiş bakteri sayısını gösteren bir grafik Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, her ikisi de oldukça tekrarlanabilir sonuçlar, EpiAirway dokular ve tutarlı bir insan üst solunum yolu in vitro model biyolojik ilgili çalışma NTHi konak- patojen etkileşimleri. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 EpiAirway dokuların elektron mikroskobu Tarama. A. bulaşmamış kontrolü doku. NTHi eş-kültür beş gün sonra B. Doku. Apikal yüzey enfekte dokularda önemli bir hasar yok görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 NTHi sayısı EpiAirway ko-kültür sırasında zamanla içselleştirilmiş. Gerilme R2866 sonra her Belirtilen bir zaman noktasında içselleştirilmiş bakteriler hasat yaklaşık 1.0 x 10 7 CFU / ekleme (Gün 0) ekildi. Barlar = 3, en az iki nüsha halinde çoğaltır n temsil eder. Hata çubukları, SD.

<ol>
	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem, hava-sıvı arayüzü birincil insan solunum dokuların biyolojik ilgili bir arka planda uzun vadeli konak-patojen etkileşimleri soruşturma sağlar. Burada bulaşmasını organizma olarak NTHi kullanılan, ancak herhangi bir bakterinin zamanla kabul edilemez sitotoksisite tanıtmak gelmez bu yöntem ile etkileşimi sayılabilir olabilir. EpiAirway model aynı zamanda, virüsler, ilaçlar, ya da kimyasalların bu etkiyi insan üst solunum yolu 5 çalışma için kullanılan, 6, 7, 8 . ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558.255-25GM </td><td> Kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS içinde% 1, sterilize filtre </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco&#39;nun kalsiyum ve magnezyum ile tuzlu fosfat tamponlu </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco&#39;nun kalsiyum veya magnezyum olmadan tuzlu fosfat tamponlu </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiyotik ücretsiz dokular </td><td> Mattek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya </td><td> Mattek </td><td> HAVA-100-AA-ABF </td><td> Kit ile birlikte </td></tr><tr><td> 10X fosfat tamponlu salin solüsyonu </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1X seyreltik kullanmadan önce </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> 1 X PBS ve otoklav bir final konsantrasyon% 0.1 ekle </td></tr><tr><td> Difco GC Orta Bankası (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Otoklav 500 ml GKD 2 O 36 - 60 g ve serin ° C </td></tr><tr><td> BBL Hemoglobin (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60 500 ml GKD 2 O serin Otoklav 10 g ° C ve üzerinde GC orta tabanı ile karıştırın </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX zenginleştirme (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> - 55 ° C ve 10 ml rehidrate IsoVitaleX eklemek, çikolata agar plaklarına dökün GC orta taban ve hemoglobin karışımı soğutun </td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps, ince uçlu, kavisli </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Sızdırmazlık sterilizasyon keseleri </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin sülfat, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> 10 mikrolitre / ml gentamisin öldürmek için EpiAirway MM </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

2; Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi), tekrarlayan ve kronik solunum mukoza 1 enfeksiyonlara yol açabilir insan adapte Gram-negatif bakteriler . Bu organizmalar solunum dokularda ve iç hayatta hangi mekanizmaları, bakteri ve insan hücreleri başarılı bir şekilde uzun vadeli işbirliği kültürü yapılabilir hangi modelin incelenmesi. Biz hava-sıvı arayüzü yükseltilmiş birincil insan solunum yolu epitel dokuların kullanımı, EpiAirway modeli (Mattek, Ashland, MA). Bu sıkı kavşaklar, siliyalı ve nonciliated hücreleri, müsin üreten ve enfeksiyona karşı sitokin üretme yeteneğini muhafaza goblet hücreleri içeren olmayan ölümsüzleştirdi, iyi diferansiye, 3-boyutlu dokular. Bu biyolojik olarak insan üst solunum yolu in vitro model ilgili bir dizi şekillerde kullanılabilir; zamanla bu yöntem genel hedefi, NTHi ve Asitli EpiAirway dokuların uzun vadeli işbirliği kültürü hücre ilişkili ve içselleştirilmiş bakteriler gerçekleştirmek için . Yanı sıra, enfekte ko-kültür müsin üretimi ve sitokin profili tespit edilebilir. Bu yaklaşım, pek çok mevcut protokoller mevcut yöntemleri geliştirir uzun süre 3 üzerinde bakteriyel enfeksiyonlar destekleme yeteneğine sahip değildir, insan hücrelerinin batık tek tabaka veya transwell kültürleri, kullanın . Örneğin, eğer bir organizmanın üstteki medya çoğaltmak, bu deney tutuklamak, sitotoksisite ve ev sahibi hücrelerin kaybı kabul edilemez düzeyde neden olabilir. EpiAirway modeli uzun vadeli konak-patojen etkileşimi karakterizasyonu sağlar. EpiAirway için kaynak ölümsüzleştirilen çizgisinden daha çok bir normal insan trakea-bronş hücreleri beri Ayrıca, her gerçek insan üst solunum yolu doku yapısı ve fonksiyonu 4 hem de mükemmel bir temsil,. Bu yöntem için, EpiAirway dokular teslimattan 2 gün önce anti-mikrobiyal ve anti-mantar bileşiklerin sütten ve tüm işlemler antibiyotik koşullar altında yapılmaktadır. Bu her iki bakteri ve birincil insan dokuları aynı Biyogüvenlik kabini olduğundan, özel durumlar gerektirmektedir ve uzun süre ko-kültür vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions at JoVE.com

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Görüntüleme.  Mercer University School of Medicine. Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu In vitro Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.

Video: Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The significance of innate immunity signaling in viral infections has increased substantially as patients with respiratory infections who exhibit high innate T cell activation show a better disease outcome. Hence, dissecting these early innate immune interactions allows the elucidation of the processes that govern them and may facilitate the development of potential therapeutic targets and strategies for dampening or even preventing early progression of viral infections. This protocol details a versatile model that can be used to study early crosstalk, interactions, and activation of innate immune cells from factors secreted by virally infected airway epithelial cells. Using an H3N2 influenza virus (A/Aichi/2/1968) as the representative virus model, innate cell activation of co-cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) has been analyzed using flow cytometry to investigate the subsets of cells that are activated by the soluble factors released from the epithelium in response to the viral infection. The results demonstrate the gating strategy for differentiating the subsets of cells and reveal the clear differences between the activated populations of PBMCs and their crosstalk with the control and infected epithelium. The activated subsets can then be further analyzed to determine their functions as well as molecular changes specific to the cells. Findings from such a crosstalk investigation may uncover factors that are important for the activation of vital innate cell populations, which are beneficial in controlling and suppressing the progression of viral infection. Furthermore, these factors can be universally applied to different viral diseases, especially to newly emerging viruses, to dampen the impact of such viruses when they first circulate in na&#239;ve human populations.

This protocol details an investigation of the early interactions between virally infected nasal epithelial cells and innate cell activation. Individual subsets of immune cells can be distinguished based on their activation in response to viral infections. They can then be further investigated to determine their effects on early antiviral responses.

Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic pathogen upon influenza A virus (IAV) infection. Advanced age enhances host susceptibility to secondary pneumococcal pneumonia and is associated with worsened disease outcomes. The host factors driving those processes are not well defined, in part due to a lack of animal models that reproduce the transition from asymptomatic colonization to severe clinical disease. 
This paper describes a novel mouse model that recreates the transition of pneumococci from asymptomatic carriage to disease upon viral infection. In this model, mice are first intranasally inoculated with biofilm-grown pneumococci to establish asymptomatic carriage, followed by IAV infection of both the nasopharynx and lungs. This results in bacterial dissemination to the lungs, pulmonary inflammation, and obvious signs of illness that can progress to lethality. The degree of disease is dependent on the bacterial strain and host factors. 
Importantly, this model reproduces the susceptibility of aging, because compared to young mice, old mice display more severe clinical illness and succumb to disease more frequently. By separating carriage and disease into distinct steps and providing the opportunity to analyze the genetic variants of both the pathogen and the host, this S. pneumoniae/IAV co-infection model permits the detailed examination of the interactions of an important pathobiont with the host at different phases of disease progression. This model can also serve as an important tool for identifying potential therapeutic targets against secondary pneumococcal pneumonia in susceptible hosts.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

This paper describes a novel mouse model for the transition of pneumococcus from an asymptomatic colonizer to a disease-causing pathogen during viral infection. This model can be readily adapted to study polymicrobial and host-pathogen interactions during the different phases of disease progression and across various hosts.

Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

3 Boyutlu Sığır İleal Enteroid Kültüründen 2 Boyutlu Monotabaka Oluşturulması

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Yazar Spotlight: Konak-patojen etkileşimlerini incelemek için gelişmiş enteroid model 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Uzun Vadeli Kronik

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması