Bu proje, E. Jolly sağlanan Case Western Reserve Üniversitesi&#39;nde başlangıç ​​fonları tarafından finanse edildi. Enfekte salyangoz şiştozom Kaynak Merkezi, NIH-NIAID (NIAID Sözleşme No HHSN272201000009I) tarafından verilmiştir. Ayrıca Chris King ve Ronald Blanton enfekte şiştozom salyangoz güvence destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz.

Güvenlik önlemleri: Şiştozom cercariae bir kesik veya gözeneklerin ihtiyaçları olmadan doğrudan cilde nüfuz eder ve kronik hastalık schistosomiasis neden olabilir. S. mansoni bir biyogüvenlik düzeyi 2 organizma, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve enfektif cercaria ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri takip edilmelidir. Schistosomes büyümeye dönüştürmek için gerekli ekipmanların çoğu protokol sonunda tabloda belirtildiği gibi birkaç önemli istisnalar dışında, standart. Tüm cercarial çalışma, izole bir odada yapılmalıdır. Schistosomules steril, onaylı biyogüvenlik kaput kültüre olmalıdır. İki kat nitril ya da lateks eldiven giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü, su geçirmez bir çift ayakkabı, bilek ve silah için herhangi bir delik veya yırtık ve su geçirmez kol koruyucuları pantolon gerekir. Kazara dökülme durumunda, derhal şiddetle kişi hakkında ise sürtünme,% 70 etanol veya% 10 çamaşır suyu ile kirlenmiş alanda sprey. Bu parazit devre dışı bırakmak için yeterli olacaktır, ancak tüm olası enfeksiyonlara ve ciddiye alınmalıdır. Schistosomules doğuştan enfektif olmasa da, kurumsal kurallar değişir ve BSL2 önlemler noninfeksiyöz yaşam aşamalarında gerekli olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Biohazard onaylı bir kapta yapılır ve deney atık atmak sonra herhangi bir potansiyel bulaşıcı madde ile temas eden tüm yüzeyler dezenfekte edin. NOT: Kapak salyangoz ana bidonları, 1 ila 2 gün önce dökülme ve ışıktan korumak için 1. Salyangoz konak cercariae Hasat <ol><li> Yarım distile su ile oda sıcaklığına gelmesi dolu deterjan, 500ml temiz bir behere doldurun. Farklı tarihlerde miracidia ile enfekte konak salyangoz ile çalışıyorsanız, her enfeksiyon tarih için ayrı bir beher kullanmak (salyangoz gelecek deneyler için tekrar olacak, bu özellikle önemlidir). Beher boyutu da kullanıcı deneyimine bağlı olarak daha küçük olabilir. </li><li> Gerektiği gibi net bir standart akvaryum balığı ve genel amaçlı forseps kullanarak beher döken ve dikkatli bir şekilde yatırmak isteyen enfekte salyangoz ev sahipliği toplayın. </li><li> Acil bir dökülme Yeri beher akkor bir ışık kaynağı altında yaklaşık 8 ila 12 inç tepsisi. Işığı altında 1-2 saat bekletin. Parlak ışığa maruz kaldığında Cercariae salyangoz konak çıkın. </li><li> Cercariae karışımı dikkatlice salyangoz dışarı filtre. Karışımının son derece bulaşıcı olduğundan, ekstra güvenlik önlemleri alın. Unutmayın, cercariae doğrudan insan derisi nüfuz edebilir! </li><li> Herhangi bir partikül atık madde yerleşmelerine izin verme, yaklaşık 15 dakika ışık kaynağı altında karışımı değiştirin. </li><li> Cercariae beher altındaki enkaz kaçınarak, bir pipetlemeyin kullanarak temiz bir Erlenmeyer şişesinin içine aktarın. Şişesi 60 dakika, cercariae bir köşeye yerleşmek için izin - 45 için karanlık buz üzerinde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. </li><li> Süpernatantı 75 -% 90% 10 çamaşır suyu ya da% 70 etanol içeren beher kaldırmak ve mevduat, su damlaları pipetlemeyin cercariae damla içeren girmemesine dikkat çekici bir 50 ml pipetlemeyin kullanın. </li><li> Swirl Erlenmeyer şişesinde çözüm cercariae tekrar süspansiyon yavaşça cercariae içeren. Steril 50 ml konik tüpler için örnek aktarmak için bir pipetlemeyin kullanın. Karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde tekrar tüpleri yerleştirin. Cercariae karanlıkta tüp alt kısmına doğru geçer. </li></ol> 2. Schistosomules için cercariae Manuel dönüşüm Başlamadan önce: RPMI 1640 (RPMI,% 5 fetal sığır serumu, 1X Pen / Strep) tamamlamak ve 37 ° C&#39;ye kadar sıcak olun. (Kullanılan fetal sığır serumu inkübasyon inaktive edildiğini çok önemlidir 56 ° C 1 saat schistosomes tamamlamak için duyarlı olmak gibi). <ol><li> Biohazard kaput, her biri 50 ml konik bir pipet veya vakum cihazı kullanılarak çözüm 5 ila 10 ml kadar süpernatant çıkarın. </li><li> Döner lok uygun boyutta bir şırınga iğnesi bulamaç, çift uçlu, 22 gauge takın. </li><li> Yavaş yavaş şırınga içine karışımı çizin. Bir şırınga içinde 50 ml tüpler cercariae toplayın. Damlayan dikkatli olun. </li><li> Unattached iğne ucu kadar olduğu gibi üzerinde dikkatle şırınga açın. Bulamaç iğne bu tarafında başka bir şırınga takın. </li><li> Cercariae dönüştürmek için iğne ile toplam 40 kez (20 kez ileri ve geri) Pass karışımı. </li><li> Karışım, alt şırınga bulunan ve üst şırınga boş olduğunu dikey gibi şırınga yerleştirin. Üst şırınga çıkarın ve% 70 Etanol dezenfekte. </li><li> Mevduat karışımı temiz bir yüksek duvarlı 100mm x 50mm kabına ya da kristalize çanak içine damla damla. % 70 Etanol iğne ve şırınga dezenfekte edin. </li><li> 37 ° C RPMI 1640 eksiksiz bir medya gibi ekleyinPetri kabı alt Luria suyu plakası dökme gibi tamamen kaplıdır. </li><li> Petri kabı merkezinde schistosomules toplamak için hafifçe Swirl. Sıçramasını önlemek. Not: Bu adım için daha yeterli merkezinde schistosomules görselleştirmek için kaput ışığı kapatmak için yararlı olabilir. </li><li> Hemen steril bir damlalık kullanarak yeni bir 12-kuyu hücre kültür plakasına konsantre schistosomules yatırın. </li><li> 2.9 ve 2.10 schistosomules artık çanak (yaklaşık 10 kat) merkezi bugünkü kadar tekrarlayın. Sonraki her taze bir kuyu koleksiyonu Depozito. </li><li> Her iyi yarısına kadar (~ 1.5 mL) prewarmed RPMI tam medya ile doldurun. </li><li> Schistosomules varlığı ve cercariae yokluğu doğrulamak için bir inverted mikroskop gözünüzde canlandırın. </li><li> Büyümeye CO 2 inkübatör schistosomules - 37 ° C ve% 5 CO 2. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Kültür ortamı haline dönüştürülmüş schistosomules Bekleyen transferi, ters bir parlak alan mikroskobu altında (örneğin ekipman tabloya bakınız) görselleştirme Şekil 1, sadece dönüştürülmüş schistosomules iyi olduğu için benzer bir görüntü elde edilmelidir. Potansiyel kirleticiler, sağlam cercariae, kopmuş cercarial kuyrukları, veya diğer çöküntüleri içerebilir. Hiçbir inverted mikroskop varsa, standart bir mikroskop ya da hatta bir diseksiyon kapsamı schistosomules görselleştirmek için yeterli olacaktır. Bu işlem her zaman% 100 cercariae dönüştürmek unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Dönüştürülmüş Schistosomulum <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2: Cercariae ve Severed Tails

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bazı potansiyel sorunları dönüşüm işlemi sırasında ortaya çıkabilecek; Ancak, bu protokol, bu sorunların en önlemek için tasarlanmıştır. Potansiyel bir tehlike genellikle adım 1.3 &#39;de hasat arta kalan enkaz nedeniyle ortaya çıkar bulamaç iğne, tıkanma. Bu sorunu önlemek için tüm partikül madde, 1.5 adım yerleşmek ve adım 1.6 cercariae dikkatli bir şekilde aktarmak için izin emin olun. Ayrıca, biyolojik güvenlik kabini içinde çalışmak, daha önce açıklandığı gibi, kişisel koruyucu ekipman kullanımı (hatta yüz kalkanlar) ve şırınga aşırı basınç kaçınma tavsiye edilir. Müstakil cercarial kuyrukları 2.9 adım sırasında kötü ayrılması göstergesidir medya, görüntülenebilir. Kuyrukları spazm gibi hareket sergiler ve farklı bir şekil var (bkz. Şekil 2) ve thusly schistosomules kolayca ayırt edilebilir. Schistosomules yerleşmelerine izin tamamlamak RPMI aşan schistosomules yıkama kuyrukları tarafından kaldırılabilir. Kuyrukları kayan kalacak ve kapalı vakumlu olabilir. Sağlam cercariae medya varsa, adım 2.5 dönüşüm düzgün idam değildi. Şekil 3b başvuru için sağlam bir cercaria bir görüntü tasvir edilmiştir. Bu sorun oluşursa, kullanılan bulamaç iğne uygun büyüklükte olduğunu sigorta. Ayrıca, cercarial karışımı iğne geçirilir kez, 40 kez genellikle cercarial kuyrukları% 100 kesme yaklaşım çok daha fazla olmasına rağmen, artmış olabilir. Schistosomules içine cercaria Dönüşümü ilk Colley ve Wikel (13) tarafından 1974 yılında tarif edilmiştir. O zamandan beri, schistosomules hazırlanması, bir iğne ve şırınga ile ya kesme strateji kullanarak Bu çalışmada gösterdiği gibi, bu protokolde tanımlanan veya vorteks bir yaklaşım kullanarak ve Percoll, gradyanlar ile ayrılmış (14, 15) ya da dönen olarak yapılmıştır. Schistosomules hazırlanması için bu iki teknik güzel Fred Lewis (16) ve uzun vadeli büyüme için daha fazla schistosomules kültür için daha fazla bilgi NIAID şiştozom Kaynak Merkezi (bulunabilir tarafından <a href="http://www.schisto-resource.org/">açıklanan www.schisto-</a> resource.org) .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;Bulamaç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Orta 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) ısı inaktive </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Kristalize Bulaşık (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Genel Amaçlı Cımbızlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Salamura karides için Petco Akvaryum net </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

Şiştozom parazitler etken schistosomiasis kronik zayıflatıcı hastalığı, dünyada 200 milyon insanı etkileyen ve halk sağlığı ve sosyo-ekonomik etkileri (1-4) açısından paraziter hastalıklar arasında sıtma ile ikinci sırada yer alıyor. Şiştozom parazitler karmaşık bir yaşam döngüsü serbest yüzen aşamalarında müdahale molluscan ve memeli ev sahipliği yapan asalak bir yaşam arasındaki ¤ lantılarını trematod solucanlar. Kısaca, serbest yüzen cercariae schistosomules dönüşürken, cercariae kuyrukları kaybetmek ve bu süre boyunca salgılanan proteazlar yardımı ile cilde nüfuz konak memeli bozar. Schistosomules şimdi, konak bağışıklık sistemini kaçınmak, kırmızı kan hücrelerinin bir bağırsak sindirim için geliştirmek ve göç gerekir rağmen akciğer ve karaciğer portal sisteminin nihai hedefe giderken portal dolaşıma ve sonunda mezenterik damarlar (S. mansoni ) erkek ve dişi solucanlar çifti ve arkadaşı, her gün yüzlerce yumurta üretmek. Bazı yumurta, taze su, serbest yüzen miracidia (5-10) içine yumurtadan çıkar yumurta içine vücuttan atılır. Miracidia özel salyangoz türleri enfekte ve anne ve kızı da, yaşam döngüsünü tamamlayarak, enfektif cercariae üretmek sporocysts dönüşmek. Ne yazık ki, tüm şiştozom yaşam döngüsü in vitro kültüre, ancak infektif cercariae schistosomules dönüşebilir ve schistosomules vitro veya mikroarray analizi şiştozom gelişme analizi için hafta boyunca kültüre olabilir. Bu protokol, biz cercarial dönüşüm ve schistosomules in vitro kültür görsel bir açıklama sağlar. Biz salyangoz ana Biomphalaria glabrata bulaşıcı cercariae döken ve elle, bir bulamaç çift uçlu bir iğne kullanarak kendi kuyrukları ayırarak schistosomules haline dönüştürmek. , In vitro cercarial dönüşümü ve schistosomules kültür teknikleri, schistosomes, görselleştirme kolaylaştırır ve deneysel analizi için parazit toplanmasını kolaylaştırır. In vitro dönüşüm ve kültür teknikleri schistosomes yıl için yapılmış bir konak memeli, (11 kullanımını önlemek açıklanan 12), ancak hiçbir görsel protokoller tüm toplum için kullanılabilir olduğunu geliştirilmiştir var.

Watch this Scientific Journal Video about Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules at JoVE.com

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Biz bir tarif<em&gt; In vitro</em&gt; Flatworm parazit kültür schistosomula yöntemi<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Tatlı su salyangozu ara konak Biomphalaria glabrata enfektif cercariae hasat ve dönüşüm yoluyla.

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

18.0K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Biz bir tarif In vitro Flatworm parazit kültür schistosomula yöntemi Schistosoma mansoni Tatlı su salyangozu ara konak Biomphalaria glabrata enfektif cercariae hasat ve dönüşüm yoluyla.

Video: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Gelişim Biyolojisi

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genetik

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Biyoloji

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gelen Yumurta kullanma