Name: in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion
Uploaded: 2011-11-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

Biz Üniversitesi Dr Paul Weigel teşekkür etmek istiyorum. Oklahoma kullanmak için onun teknik yardım için HARE/Stabilin-2 reseptör ve Janet Weigel tespiti için monoklonal antikor 30. Bu araştırma, Nebraska Araştırma Fonları Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.

1. Karaciğer eksizyonu (değişiklikler 14,15 PO Seglen 12 ve R. Blomhoff 13 kabul) <ol><li> 5.5 L odasında kapalı bir petri polietilen glikol izofluran 10 ml% 30 ekleyin. Bu odanın içinde stabilize bir atmosfer yaratmak için izofluran eklenmesinden sonra 10-15 dakika beklemek en uygunudur. </li><li> Kapalı odasında bir fare koyun ve anestezi olmak için izin verir. Anestezi tam etkileri hayvan tepkisiz, gevşek olduğunda fark edilir ve derin nefes alma sergiler. </li><li> 2 ml, 30 ml şırınga tüpün alt kısmında bazı pamuk topları polietilen glikol izofluran Yeri. </li><li> Bebek bezi kaplı bir tepsi ve burnu üzerinde şırınga tüp sırtında sıçan yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile karın ıslatma hemen derin anestezi onaylayın. Hayvan izofluran doz aşımı ölmesine izin vermeyin. </li><li> Bandaj makasları ve forseps kullanma, tüm abd maruzominal kavite. </li><li> Vena porta bulun ve forseps kullanarak, iki kısımlı mezenterik şube hemen üzerinde vena porta altında cerrahi ipek veya polyester iplik (ligatür) çizin. </li><li> Forseps çekiniz ve gevşek bir overhand düğüm. </li><li> Vena porta altında forseps kullanma ve damar düzeltmek için hafifçe geri çekilerek, bir Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences) veya benzeri bir kateter ile ven cannulate. Kateter parçacığı tarafından oluşturulan döngü ötesinde birkaç mm gitmeli. </li><li> Kateter yaylı tetik serbest iğne geri çekin ve çıkartın. Kan uygun ligatürün yerleşimini gösteren kateter içine sızan başlamalıdır. </li><li> Overhand düğüm aşağı sıkın ve başka bir overhand düğümle sabitleyin. </li><li> Inferior vena kava veya inen aorta (aorta abdominalis), kan dolaşım sistemi tahliye izin ya Sever. </li><li> Oksijenli ile karaciğer kızarma başlayınTBS ° 37 ° C 20 ml / dk akış hızında, kan (beyazlaşma) kaldırmak için. Karaciğer, kırmızımsı mor bir balçık renk açmak gerekir. </li><li> Karaciğer kızarma olmasına rağmen, tüketim, gastrointestinal sistem ve bağ dokusu kesim tarafından karaciğer. Karaciğer veya delinme Glisson kapsül delici için önemlidir. </li><li> Plastik tamponlar toplanan ve sirküle olması için olanak sağlayan bir huni üzerinde net karaciğer yerleştirin. Bu noktada Tamponlar sirküle, ancak atık behere akışı olmamalıdır. Flushing 10 dakika daha fazla sürmemesi. (Şekil 2A). Adım 2.1 &#39;de gerekli endositoz çözüm hazırlayın. </li></ol> 2. 125 I-SA-b-Hep (ya da diğer uygun etiketli ligand), içselleştirme <ol><li> Küçük bir behere 50 ml RPMI ortam, nihai konsantrasyonu% 0.05 BSA ve 0.01 mCi 125 I-SA-b-Hep veya diğer şekilde etiketlenmiş endositoz ligand ekleyin. </li><li> Bu beher takın apparatuoksijenasyon için izin vermek. </li><li> , Pompa kapatın giriş tüp geçiş ve sonra 20 ml / dak pompa açmak. </li><li> Etiketli RPMI karaciğer yaklaşırken, pompayı kapatın ve huni aşırı sıvı ve tüp drenaj izin. </li><li> Etiketli medya devridaim izin ve sonra pompa yeniden başlatmanız drenaj boru medya behere koyun. </li><li> Sıvılar, en fazla 1 saat için karaciğer yoluyla sirküle izin verin. </li><li> Bu içselleştirme adım sırasında, karaciğerde sıcaklığı kapsayan ve kollajenaz sindirim için hazırlamak istikrarlı olduğundan emin olun. </li></ol> 3. Kollajenaz sindirim karaciğer sindirimi <ol><li> Taze çözünmüş ve süzülür (0,45 mikron) kollajenaz 37 60 ml geçmemek üzere toplam hacim ° C (100 mg / kg rat ağırlığı) 2 Tampon eklendi olmalıdır Hacmi boru uzunluğu / iç hacim bağlıdır ve buna göre ayarlanması gerekir. </li><li> Pompa ve döviz DurdurTBS medya beher giriş boruları. </li><li> Kalsiyum bağımlı desmosomal hücre kavşaklarından gevşeme sağlar dk 50 ml / 2 dk karaciğer yıkayın. </li><li> Karaciğer kızarma, beher cihazın kollajenaz içeren medya beher değişimi. </li><li> Hemen yıkamadan sonra, 20 ml / dak akış hızında 15 dakika kadar bir dolaşım döngü içinde kollajenaz ile sindirim başlar. Kollajenaz partiler çok sayısına göre farklılık gösterir, sindirim miktar ve zaman içinde değişiklikler kollajenaz her yeni parti için optimize edilmesi gerekir. Kollajenaz de kalsiyum bağımlıdır. Pompayı kapatın ve Flask B. (Şekil 2B) Flask Yatak atık hattı atık konteyner transfer Flask tampon ve gaz hatlarının geçiş. </li><li> Pompa Dur, kateter kaldırmak ve 20-30 ml Tampon 1 içeren bir çanak karaciğer aktarmak. </li><li> Geri Peel Glisson kapsül ve karaciğer hücre sallamaksıvı s. </li><li> Sıvı hücresel malzeme ile opak hale geldikçe, 30 mikron mesh ile ve daha sonra 50 ml konik içine buz filtrasyon ile 100 mikron mesh yoluyla hücrelere aktarın. </li><li> Karaciğer daha fazla Tampon 1 ekleyin ve mesh filtreleri ve konik sıvı, karaciğer matris hücreleri sarsmaya devam ediyor. </li><li> Adımları tekrarlayın 3,7-3,9 artık hücreleri karaciğer makul sallayarak yerinden olabilir kadar. </li></ol> 4. Hepatosit ve SEC arıtma <ol><li> 3 dakika boyunca 150 xg&#39;de hücreleri içeren 50 ml conicals Santrifüj. hepatositler pelet. </li><li> Buz üzerinde taze 50 ml conicals olmayan parankimal hücre içeren sıvı kısmını aktarın. </li><li> Hepatositler Tampon 3 pelet resuspending ve adımları 4.1 ve 4.2 en fazla üç defa tekrar yıkayın. </li><li> Yıkar sonunda, pelet ≥% 97 saf hepatositler. Sn elde etmek için, tüm borular c santrifüj10 dakika için 200 xg (HKH&#39;lerin, saniye, ve KCS ve bazı küçük hepatositler içeren) supernatant toplanmış ontaining. 4 ° C </li><li> Tampon aspire 4, 5 ml RPMI / BSA tüm pelet ° C tekrar süspansiyon </li><li> 2 tüp içine hücreleri birlikte Havuz ve 35 mL bir birime kadar RPMI / BSA ekleyin. </li><li> 3 dakika boyunca 100 xg&#39;de conicals santrifüjleyin. </li><li> En iyi 25 ml sıvı ve temiz bir 50 ml konik transfer toplayın. </li><li> Kalan 10 ml medya pelletini tekrar ve tekrar soğuk RPMI / BSA 25 ml ve 3 dakika boyunca 100 xg&#39;de santrifüj ekleyin. </li><li> 3,8 ve 3,9 adımları tekrarlayın hücre pelet ve alt 10 ml medya, bir kez daha atın. </li><li> Pelet saniye, KCS ve 10 dakika için 200 xg HKH&#39;lerin supernatents santrifüjleyin. 4 ° C </li><li> Buz 20 ml PBS içinde% 25 Percoll içeren üç 50 ml tüpler hazırlayın. Her bir tüp içinde 15 ml% 50 Percoll Underlay. </li><li> 30 ml RPMI / BSA toplam hacmi hücre pelletleri tekrar </li><li> Dikkatle bindirme eac4 h 20 dakika için 900 xg hücreleri ve santrifüj 10 ml degrade ° C </li><li> SAN ve KCS batmaz yoğunlukları çok yakın ve% 25/50 arayüzü var. HKH&#39;lerin / medya lipid depolama hücreleri gibi yüksek kaldırma kuvveti nedeniyle arayüzü tipik olarak 25%. Kalan hepatositler ve kan hücreleri düşük buoyancies ve pelet. 25/50% arabiriminin yanında yukarıdan aşağıya aspire ve bu malzemenin atın. </li><li> 25/50% arayüzü ve soğuk RPMI ile taze bir konik hücrelerin toplayın. Son hacim Percoll sulandırmak için ~ 40 ml olmalıdır. </li><li> 4 az 10 dakika süreyle 350 xg&#39;de konik Santrifüj ° C pelet hücreleri. </li><li> ~ 10 ml önceden ısıtılmış RPMI asitle yıkanmış cam Petri kabındaki 100 U / ml Penicillin/100 g / ml Streptomisin ve yer hücreleri içeren ya da çanak kristalize hücrelerin tekrar </li><li> Hücreler 15 dakika inkübe edin. 37 ° C&#39;de bir doku kültürü inkübatörde. </li><li> Rock ya da girdap plakası birazve sonra süpernatantı sn toplamak. KCS saniye daha çok daha hızlı bir şekilde cama yapışır. Alternatif olarak, SAN, manyetik boncuk konjuge veya anti-Stabilin2/HARE anti-CD31 antikorları kullanarak immunopurification KCS ayrılmış olabilir. </li><li> Canlılık ve hücre sayıları hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama ya da otomatik hücre sayıcı ile değerlendirilebilir. </li><li> Kültür sn 37 ° fibronektin kaplı plastik tabaklar ° C,% 5 CO 2, 40 ng / ml VEGF, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml Streptomisin veya hepatosit klimalı ortam RPMI/0.25% BSA. </li><li> Hepatositler, KCS ve SAN etiketli malzeme içselleştirilmesi için bir gama sayacı kullanımı ile değerlendirmek ve bu kültür yöntemleri kullanılarak (floresan ile işaretlenmiş) toplam hücresel protein veya mikroskobu ile normalize edilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: Hepatosit arıtma ≥% 97 ve SEC arıtma typicmüttefiki ≥% 95 bu yöntemi kullanarak. Karın boşluğunda, portal ven, kanülasyon, karaciğer, beyazlaşma eksizyonu en iyi sonuçlar için bir dakika içinde meydana gelmelidir. HARE/Stabilin-2, karaciğer sn belirli bir reseptör ve diğer karaciğer hücre tipleri ifade değildir. Bu örnekte, hepatosit ve SAN hem de hücre lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrıldı Stabilin-2 hem de izoformları (Şekil 3) karşı monoklonal antikor ile probed. Kan dolaşımına enjekte heparin, 16 karaciğer tarafından temizlenir . Gümrükleme, öncelikle hepatositlerde ve KCS 17 aksine, karaciğer sn tarafından yapılır . Stabilin-2/HARE reseptörüne bağlanır ve 18 saniye içinde heparin içselleştirmesi ana bir boşluk reseptör . Buradaki örnekte, biz GlcNAc / NS karboksilat grup biotin etiketiyle heparin etiketli. Biotin, içselleştirilmiş heparin Prot tespiti için iyotlu streptavidin ile konjugeeoglycan. Exsanguination tarafından takip etiketli heparin enjeksiyonu, enjeksiyon sonrası 30 dakika bize hangi organları heparinin bu formu içselleştirmek izlemenize olanak sağlar. Bu kısa zaman aralığında, karaciğer birincil gümrük organ (Şekil 4). Daha açık bir şekilde hücre tipi temizlenmesi için sorumlu olduğu anlamak için,% 0.05 BSA ile desteklenmiş RPMI medya I-SA-b-Hep 125 eklenir ve 20 dakika için karaciğer dolaşmasına izin. Kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma ardından, etiketli heparin hepatositler (Şekil 5) aksine saniye içinde büyük bir çoğunluğu tarafından içselleştirilmiş. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Temel karaciğer mimarisi . Sn sinüzoidler duvarlarını oluşturmak ve normal (çevrelerin küçük kümeleri) Fenestre. Stellat hücreleri (HKH&#39;lerin) Kupffer c aksine Disse Uzay bulundu.arşın (KCS) normalde sinüzoidler mikrovaskuleterini mevcuttur. Hepatositler Disse Uzay diğer tarafında işgal eder. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 perfüzyon cihazların şematik. A) Karaciğer sinüzoidler kızarma / yıkama sırasında aparat Set-up. TBS, 1 litre cam şişe içinde. B) ~ 60 ml Tampon 2 kollajenazlarla içeren 125 ml şişeyi, bir kapalı devre karaciğer sindirim için kullanılır. Atık su hattı da lastik tıpa bir çentik kesi aracılığı ile atık konteyner balon B değiştirildi. Oksijen hattı kollajenaz (balon B) içeren köpük önlemek için tampon içine batmış değildir. Her balona Stoper atık su hattının etkin transferine izin vermek ve artan oksijen gazı basıncı önlemek için çentikli. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. </sTrong&gt; Hepatosit hazırlıkları saniye ile kontamine değildir. Eşit miktarda saflaştırılmış hepatositlerde gruplar halinde (şeritli 1) ve saniye (şeritli 2) cep lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrılmış ve nitroselüloz için lekelenen. HARE/Stabilin-2 hem izoformları (315 kDa ve 190 kDa) karşı spesifik monoklonal antikor # 30 lizatları prob kullanıldı. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 organlarda etiketli heparin Dağılımı. Sıçanlar, 30 dakika boyunca 125 I-SA-b-hep beklemek lateral kuyruk damar yoluyla enjekte edilir ve daha sonra exsanguinated. Kan yapay olarak herhangi bir organ yüksek okuma vermek amacıyla toplanmıştır. Her organ dakika başına (BGBM) Sayımlar, gram olarak organ ağırlığını karşı normalize edildi. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5 hepatosit ve saniyede etiketli heparin miktarı. RPM125 içeren medya I-SA-b-Hep kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma takiben 20 dakika için sağlam bir karaciğer ile dolaşmasına izin verildi. Eşit miktarda hepatosit ve SEC hücre proteini lizatları Bradford Testi sayısal ve bir gama sayacı tarafından sayıldı. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6 Kupffer hücreler cam üzerine yapışmasını sn ayrılır. Hücreler bir asitle yıkanmış cam kristalize çanak yerleştirilir ve 37 ° C,% 5 CO 2 15 dakika uyması izin verildi. Olmayan yapıştırılır hücreleri içeren supernatent hafifçe kıvrıldı ve bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. % 8 SDS-PAGE ile ayrılmış iki cam yapıştırılır hücreleri (şeritli 1) ve olmayan yapıştırılır hücreleri (şeritli 2) lizatları lekelenen ve Kupffer hücreleri için spesifik CD163 karşı bir antikor ile probed. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> Fibronektin kaplı plastik kaplanmış Şekil 7 sn 6-iyi yemekler,% 0,1 BSA ile desteklenmiş RPMI bir gece inkübe edildi . (A) 100x ve (B), 200x büyütme Faz kontrastlı görüntüler alınmıştır.

<ol>
	<li>Elvevold, K., Smedsrod, B., Martinez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sinusoidal+endothelial+cell:+a+cell+type+of+controversial+and+confusing+identity.">The liver sinusoidal endothelial cell: a cell type of controversial and confusing identity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 294, G391-G400 (2008).</li><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol. Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell.">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochem. J. 266, 313-327 (1990).</li><li>Shiratori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sinusoidal+cell+function+in+vivo.">Quantification of sinusoidal cell function in vivo.</a> Semin. Liver. Dis. 13, 39-49 (1993).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eriksson, S., Fraser, J. R., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+vitro+on+the+uptake+and+degradation+of+sodium+hyaluronate+in+rat+liver+endothelial+cells.">Studies in vitro on the uptake and degradation of sodium hyaluronate in rat liver endothelial cells.</a> Biochem. J. 223, 617-626 (1984).</li><li>Harris, E. N., Kyosseva, S. V., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+processing,+and+glycosaminoglycan+binding+activity+of+the+recombinant+human+315-kDa+hyaluronic+acid+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Expression, processing, and glycosaminoglycan binding activity of the recombinant human 315-kDa hyaluronic acid receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 282, 2785-2797 (2007).</li><li>Alkhouri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+the+Pediatric+NAFLD+Fibrosis+Index+and+Enhanced+Liver+Fibrosis+Test+Identifies+Children+with+Fibrosis.">A Combination of the Pediatric NAFLD Fibrosis Index and Enhanced Liver Fibrosis Test Identifies Children with Fibrosis.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. , (2010).</li><li>Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+liver+endothelial+cells:+a+cell+culture+model+for+studies+of+motility+and+angiogenesis.">Immortalized liver endothelial cells: a cell culture model for studies of motility and angiogenesis.</a> Lab. Invest. 90, 1770-1781 (2010).</li><li>Zhou, B., Weigel, J. A., Fauss, L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE).">Identification of the hyaluronan receptor for endocytosis (HARE).</a> J. Biol. Chem. 275, [pii]- (2000).</li><li>Krause, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-supported+serum-free+culture+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J. Hepatol. 32, 718-726 (2000).</li><li>Esser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+induces+endothelial+fenestrations+in+vitro.">Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro.</a> J. Cell. Biol. 140, 947-959 (1998).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods. Cell. Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Blomhoff, R., Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+rat+liver+stellate+cells.">Isolation and cultivation of rat liver stellate cells.</a> Methods. Enzymol. 190, 58-71 (1990).</li><li>Harris, E. N., Baggenstoss, B. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+and+human+HARE/stabilin-2+are+clearance+receptors+for+high-+and+low-molecular-weight+heparins.">Rat and human HARE/stabilin-2 are clearance receptors for high- and low-molecular-weight heparins.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, G1191-G1199 (2009).</li><li>Karaa, A., Kamoun, W. S., Clemens, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+disrupts+nitric+oxide+synthase+activation+in+liver+endothelial+cells.">Oxidative stress disrupts nitric oxide synthase activation in liver endothelial cells.</a> Free. Radic. Biol. Med. 39, 1320-1331 (2005).</li><li>Gustafson, S., Bjorkman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hyaluronan,+chondroitin+sulphate+and+dextran+sulphate+bind+to+a+liver+receptor+that+does+not+recognize+heparin.">Circulating hyaluronan, chondroitin sulphate and dextran sulphate bind to a liver receptor that does not recognize heparin.</a> Glycoconj. J. 14, 561-568 (1997).</li><li>Oie, C. I., Olsen, R., Smedsrod, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+the+principal+site+for+elimination+of+unfractionated+heparin+from+the+circulation.">Liver sinusoidal endothelial cells are the principal site for elimination of unfractionated heparin from the circulation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 520-528 (2008).</li><li>Harris, E. N., Weigel, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hyaluronan+receptor+for+endocytosis+(HARE/Stabilin-2)+is+a+systemic+clearance+receptor+for+heparin.">The human hyaluronan receptor for endocytosis (HARE/Stabilin-2) is a systemic clearance receptor for heparin.</a> J. Biol. Chem. 283, 17341-17350 (2008).</li><li>Knook, D. L., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Kupffer+and+endothelial+cells+of+the+rat+liver+by+centrifugal+elutriation.">Separation of Kupffer and endothelial cells of the rat liver by centrifugal elutriation.</a> Exp. Cell. Res. 99, 444-449 (1976).</li><li>Graupera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+endothelial+COX-1-derived+prostanoids+modulate+the+hepatic+vascular+tone+of+cirrhotic+rat+livers.">Sinusoidal endothelial COX-1-derived prostanoids modulate the hepatic vascular tone of cirrhotic rat livers.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 763-770 (2005).</li><li>Yannariello-Brown, J., Zhou, B., Ritchie, D., Oka, J. A., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ligand+blot+assay+detects+different+hyaluronan-binding+proteins+in+rat+liver+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells.">A novel ligand blot assay detects different hyaluronan-binding proteins in rat liver hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Anestezi, izofluran buharı neden olur bilinçsizlik çalışmalar için tercih edilen bir yöntem olduğu asılı damla yöntemi ile sıçan. Buharlaştırıcı da odasının dışında hayvanın korumak için pamuk ile bir şırınga yerine kullanılan, ancak cerrahi işlemler bu gerekli değildir, çok hızlı olabilir. Polietilen glikol, buhar basıncı ve buharlaşma oranı azaltmak için izofluran eklenir. Çok fazla izofluran buharı çok hızlı bir şekilde ölüme neden olacaktır. Kanüle karaciğer ve TBS, karaciğer havuzu kan olabilir pıhtı ile beyazlatılmış ve kollajenazlarla sinüzoidler ve sindirim verimli çamaşır önlemek önce hayvan ölür. Bir antikoagülan olarak heparin eklenmesi yararlı olabilir ancak bizim prob olarak etiketlenmiş heparin kullanan beri bu çalışmalarda kullanılmaz. Gey tamponlu salin solüsyonu (GBSS) sık sık diğer laboratuvarlar tarafından saniye arıtma değiştirilir. SEC arıtma, hep yararlı olmakla birlikteatocytes 1-3 GBSS yanı sıra Tamponlar tahammül edemez ve canlılığı yaklaşık olarak yüksek değildir. Endositoz ölçerken, organ ve hepatositler saflaştırılmış arka plan düzeylerini ölçmek için iyi bir uygulamadır. Bu yöntem iki biridir kollajenaz ile karaciğer perfüzyon aşağıdaki sn verimli arıtma. Diğer yöntem Yıkayarak tasviye santrifüj 19 yerine Percoll degrade olmayan parankimal hücreleri ayırır. Percoll gradyanlar üzerinde Yıkayarak tasviye kullanmak için avantajları biraz daha yüksek hücre canlılığı ve numaraları. Dezavantajı Yıkayarak tasviye santrifüj özel bir rotor, adanmış santrifüj, ve on binlerce dolar maliyeti birlikte peristaltik pompa gerektirir. Bu yöntem, yalnızca birçok laboratuvarda standart bir buzdolabında masa üstü santrifüj ve peristaltik pompa kullanımını gerektirir. SAN ve seçici yapışma KCS ayrılması standart bir yöntem20-22. Saniye cam ve plastik uygun olacağı doğru olmakla beraber, 37, 15 dakikalık bir inkübasyon daha fazla asitle yıkanmış temiz bir cam kullanmak için kilit nokta ° C,% 5 CO 2. KCS saniye daha hızlı uyacaktır ve bu gevşek bağlı hale gelmiştir kalan sn ayıklamak için medya ile KCS hafifçe yıkamak için tavsiye edilir. Pronase ve diğer proteazlar hücrelerinin canlılığı artırmak için bu protokolü kollajenaz sindirim adımları da atlanmıştır. Proteazlar ekstrasellüler reseptörleri sindirmek ve nihai arıtma adımları hücresel adezyon inhibe edebilir. Burada sunulan yöntem, uygulamalar geniş bir yelpazede. Heparin başlangıçta birincil hepatositler almak için karaciğerin temizlenmesi, perfüzyon için alındığı sonuçta gösterse de, KC, SAN ve HKH&#39;lerin metabolik yollar, immunoregulation, çöpçü faaliyetleri, ve diğer ilgili çok sayıda çalışma için yararlı olabilir fizyolojik Studies. Bu prosedürün en zor kısmı, portal ven kateter kayma kalmadan iyi kanülasyonu, sindirim, karaciğer ve karaciğer taşıma.

<ul><li> Tampon 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES,% 1.5 BSA, pH 7.4 </li><li> Tampon 2 (perfüzyon tampon): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl 2-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA% 1.5, pH 7.4. </li><li> Tampon 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO 4, 1.2 mM CaCl 2-2H 2 O, 10 mM HEPES,% 1,5 BSA, pH 7.4 </li><li> RPMI / BSA: 15g / L BSA RPMI </li><li> TRIS-tamponlu salin (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Bankası tuz. </li><li> Kollajenaz: Sigma-Aldrich Roche kollajenaz A (11088785103), Biyokimyasal Worthington veya kollajenaz I kollajenaz Tip I (# LS004691) (# C0130) veya IA (C9891). </li></ul> Tüm tuzları Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Model / katalog # </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> 20L su banyosu </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> Su, yaklaşık 45 ° C soğutma telafi etmek için </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Hortumun içinde. </td></tr><tr><td> Peristaltik Pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serisi </td></tr><tr><td> Soğutmalı Santrifüj </td><td> Sorvall </td><td> Legend XTR </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Desikatörde odasına </td><td> Balıkçı </td><td> 08595E </td><td> İç plakası kullanın </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mikron mesh </td><td> Spectrum laboratuvarları </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mikron mesh </td><td> Spectrum laboratuvarları </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilen glikol </td><td> Spectrum laboratuars </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Karaciğer memeli vücudun metabolik merkezi ve kan için bir filtre olarak hizmet vermektedir. Karaciğer temel mimarisi hepatositlerin karaciğer kütlesinin% 85 den daha fazla oluşur ve hücresel kitle kalan% 15 Kupffer hücreleri (KCS), stellat hücreleri (HKH&#39;lerin) oluşur Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, ve sinüzoidal endotel hücreleri (sn). Sn karaciğer içinde kan damarı duvarlarının formu ve sitoplazmaya içinde Fenestra denilen özel morfolojisi içeren. Sitoplazmaya fenestrasyon saniye hareket, bir elek gibi en şilomikronlar, şilomikron kalıntıları ve makromoleküllerin, ama hücreleri, hepatositler ve HKH&#39;lerin 1 (Şekil üzerinden geçtiği, böylece hücrelerin içinde delik görünüm (~ 100 mikron ) 1). Bazal membran olmaması nedeniyle SAN ve hepatositler arasında boşluk Disse Uzay oluşturur. HKH&#39;lerin yer kaplamaz ve düzenleme ve ben önemli bir rol oynayabilirnjury, retinoik asit ve karaciğer 2 immunoregulation depolama. SAN, hücre yüzeyinde 3 çöpçü reseptörleri bir dizi görüntüleme vücudun en endocytically aktif hücreleri arasında yer almaktadır . Bu SR-A, Stabilin-1 ve Stabilin-2 içerir. Genellikle, büyük partiküller ve hücresel enkaz KCS 4 (fagosite) endocytosed, oysa tampon aşamasında küçük kolloidal parçacıkları az 230 nm ve makromoleküllerin saniye tarafından alınır. Böylece, toplu boşluk gibi kan glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı malzeme, sağlık ve 5,6 saniye endositik fonksiyonları büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, kan hyaluronan düzeylerinde artış, hafif ya da daha şiddetli formları 7 arasında değişen karaciğer hastalığının göstergesidir . Bir rapor 8 istisna ile, varlığını hiçbir ölümsüzleştirdi SEC hücre hatları vardır. Hatta bu ölümsüzleştirdi hücre hattı de-diferansiyebirincil SAN (veri, gösterilmemiştir) çöpçü reseptörleri ifade etmediğini ilişkilidir. Tüm hücre biyolojik çalışmalar, taze hayvandan elde edilen birincil hücreleri üzerinde yapılmalıdır. Ne yazık ki, SAN, standart kültür koşulları altında dediferansiye ve hayvan izolasyon üzerine 1 veya 2 gün içinde kullanılması gerekir. Saniye farklılaşma Stabilin-2 veya HARE reseptör 9, CD31 ve sitoplazmik fenestrasyon 1 varlığı ifade ile işaretlenir. Saniye farklılaşma kültür ortamı VEGF ek veya hepatosit klimalı orta 10,11 kültür hücreleri tarafından uzatılabilir. Bu raporda, SEC özel Stabilin-2 reseptör hyaluronan için radyo-etiketli heparin kullanarak sağlam organ sn endositik aktiviteleri gösterecektir. Daha sonra endositoz ölçmek için perfüze karaciğer hepatosit ve SAN arındırmak.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion at JoVE.com

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

19.0K Görüntüleme.  University of Nebraska, Lincoln. Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Video: In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Biyokimya

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Sıçan Portal Fibroblastlar izolasyonu ile<em&gt; Yerinde</em&gt; Karaciğer Perfüzyon

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biyoloji

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Farelerde Engrafte Karaciğer Sferoidlerinin Noninvaziv Göz İçi İn Vivo Görüntülenmesi

In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until now, optical imaging of the liver in situ is possible by intravital imaging, which offers high-resolution imaging at the cellular level but cannot be performed multiple times and, therefore, longitudinally in the same animal. Noninvasive imaging methods, such as bioluminescence, allow repeated imaging sessions on the same animal but do not achieve cell resolution. To address this methodology gap, we have developed a platform for noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. In the workflow described in this study, primary mouse liver spheroids are generated in vitro and transplanted into the anterior chamber of the eye of recipient mice, where they engraft on the iris. The cornea acts as a natural body window through which we can image the engrafted spheroids by conventional confocal microscopy. The spheroids survive for months in the eye, during which the cells can be studied in contexts of health and disease, as well as being monitored in response to different stimuli over repeated imaging sessions using appropriate fluorescent probes. In this protocol, we provide a breakdown of the necessary steps to implement this imaging system and explain how to best harness its potential.

Yazar Spotlight: Noninvaziv Karaciğer Spheroid Çalışmaları için Fare Göz Odalarından Yararlanma

Here, we describe a platform that allows noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. The workflow spans from generating spheroids from primary liver cells to transplantation into the mouse eye and in vivo imaging at cellular resolution by confocal microscopy.

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until ...

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Sıçan Portal Fibroblastlar izolasyonu ile

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi