Laboratuarda İş NSF (MCB0919933) ve NIH (GM088790) tarafından desteklenmektedir.

1. Trunk parçası rejenerasyon tahlil <ol><li> Hayvanların atık ve yutulur gıda (~ 30 bozulmamış solucanlar, her solucan ~ açlık sonrası 8-10 mm uzunluğunda) emin olmak için en az 5 gün önce rejeneratif tahlil için solucanlar bir kohort beslenme durdurun. </li><li> Testinin gününde, su ile önceden dondurulmuş tesviye buz bulaşık durulama ve plastik wrap ile düz buzlu bir yüzey kapağı. Forseps kullanarak, plastik ambalaj malzemesi ile bir filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Filtre kağıdı, kaynak suyu birkaç damla ile ıslatın. Planaryalar bir transfer pipet kullanarak filtre (filtre ortalama &lt;20 solucanlar) üzerine aktarın. Worms, gerekirse daha fazla kaynak suyu ile repipetting, filtre yeniden konumlandırılmış olabilir. Aşırı sıvı çıkarın. </li><li> Bir neşter kullanılarak, tek bir kesim hayvan ön apeks ve yutak (Şekil 1A) ön ucu arasında yaklaşık yarım baş organını. </li><li> Bir neşter kullanılarak, yaklaşık yarım kuyruk hayvan sonu ve yutak (Şekil 1A) arka ucu arasında yapılan tek bir kesim tarafından kuyruk bölgesi organını. Neşter kestikten sonra% 70 etanol ile ıslatılmış kağıt havlu ile aşırı mukus çıkarın. Neşter fazla etanol silin. </li><li> Kaynak suyu içeren bir Petri kabı (100 x 25mm derinlik) içine forseps aracılığıyla filtre aktarın. (Yaranın kapanması için, yara pinching ve koyulaşması tarafından gözlemlenebilir) ~ 3 dakika bekleyin. </li><li> Petri kabı içeren termostatlı inkübatör rejeneratif tahlil ve transfer (24 ° C) için istenen orta gövde parçalarının içine filtre kağıdı durulayın. </li><li> ~ 1 hafta sonra yeniden yapılar tanımlanabilir (Şekil 1A) Puan rejeneratif fenotipi. </li></ol> 2. Farmakolojik manipulasyon praziquantel tarafından uyarılan iki kutupluluk: rejenerasyon <ol><li> DMSO çözülebilmesinde ilaç (62.4mg PZQ 200mm hisse senedi için 1 ml) praziquantel (PZQ) stok hazırlayın. Aynı gün kullanın. </li><li> Tamponlu Montjuch tuzları ilaç içeren solüsyon (90 mcM PZQ) 50ml olun. ~ Dağılım sağlamak için 1 dakika karıştırın. </li><li> [Protokol # 1], son adım [1.7] PZQ gövde parçalarının bir kohort açığa, yukarıda ayrıntılı olarak gövde parçası rejeneratif tahlil gerçekleştirin. </li><li> 24-48 saat sonra, döviz PZQ içeren, kaynak suyu için medya solucanlar birkaç kez çamaşır (&gt; 3). </li><li> Inkübatör için solucanlar dönün. Puan iki kutupluluk (iki başkanları, Şekil 1B) bir hafta sonra kesme. </li></ol> 3. Rejenerasyon Genetik manipülasyon: in vivo RNAi besleme protokolü <ol><li> Önce tahlil, tavuk karaciğeri Homojenat hazırlar. Gıda stoklarının gelen yağ, sarı renkli bölümler, ve püresi kalan karaciğer atın. Depolama için örgü süzgeç ve alikotu süspansiyon (1.5mL tüpler, -20 ° C) süzülür püresi. </li><li> Tahlil için, önce 1mL örnekleri -20 ° C&#39;de saklanan, arz aliquoting sığır kırmızı kan hücreleri (eritrositler) hazırlamak </li><li> RNAi için solucanlar seçin. Üç kohortlarında kullanılır: ilgi gen, pozitif kontrol (bilinen RNAi fenotip gen Şekil 1C, D &amp; E) ve negatif kontrol (hiçbir RNAi fenotip gen, aynı zamanda deneysel kohort göre demonte seviyelerinin değerlendirilmesi için yararlı). Her kohort için, ~ 250 solucanlar (en az 5 gün açlıktan sonra uzun ~ 8-10 mm) kullanın. Plastik küvet kaynak suyu saklayın. </li><li> Ilgi dsRNA hedef gen ifade E. coli her RNAi kohort, çözülme stok için [8], tavuk karaciğeri Homojenat bir tüp ile birlikte [3,1] ve eritrositlerde bir tüp [3,2]. </li><li> Pelet bakteriler (13.000 g, 1 dakika). Süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet 2xYT medya (~ 700μl) çıkarın. Recentrifuge buz üzerinde supernatant, yer pelet atmak. </li><li> Büyük bir delik P200 pipet ucu sonu keserek oluşturun. RNAi beslenme karışımı oluşturmak için tavuk karaciğeri Homojenat (150 mcL) ve eritrosit (50 mcL) oluşan bir karışım iyice bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Santrifüj hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Besleme için (~ 1 inç derinlikte terk) solucanları içeren plastik küvet suyun çoğunluğu çıkarın. Swirl küvet, solucanlar, bu kabın merkezinde konsantre ve solucanlar corralling bir daire içinde pipet RNAi beslenme karışımı. Diğer Diners rahatsızlık vermesini dikkatlice RNAi beslenme karışımı üzerine geri kaçakla koaksiyel bir transfer pipet kullanın! </li><li> Beslemeden sonra (~ 1 saat), iyi beslenen Planaryalar belirlemek. Bu solucanlar yutulur eritrositlerde koyu kırmızı bir renklenme gösterir. Diğerleri atın. </li><li> Dikkatle, taze bahar su ile çözüm beslenme, gıda egestion önlemek için rahatsızlığı en aza indirmek değiştirin. Bunu yapmak için, hafifçe bir tarafa transfer pipet kullanarak tüp, bulanık su dökmek ve dikkatli bir şekilde küvetin Karşı duvarda dökülen tatlı su ile değiştirin solucanlar yerelleştirmek. Resubmerge Planaryalar hızla havaya uzun süre maruz kalma olarak da gıda egestion sonuçları. </li><li> Gevşek seal konteyner kapağı ve kuvöz dönüş (24 ° C) </li><li> Rejeneratif döngüleri [protokol # 1] RNAi fenotipleri için ekran ile serpiştirilmiş çok sayıda döngüleri üzerinden RNAi besleme protokolü (~ 2-3 gün arayla), tekrarlayın. Şekil 2, toplam süresi yaklaşık 1 ay sürüyor, birçok genin etkili beslenme ve yenilenme için standart bir protokol gösterilmiştir . </li></ol> Optimum protokol mRNA stabilitesini, doku yerelleştirme, protein perdurance, ya da birden fazla besleme döngüleri rejenerasyon sonra önleyen bir fenotip gelişimi gibi faktörlere bağlı olarak, farklı genler için bu şemaya değiştirin. Sadece negatif kontrol kohort ile hedef mRNA düzeylerini karşılaştırmak için fenotipi (görünen eğer) penetrans tarama, veya qPCR yaklaşımlarla tarafından demonte seviyeleri değerlendirin. 4. Temsilcisi sonuçları: Gövde parçası rejenerasyon tahlil tüm solucanlar normal ön-arka (&#39;baş-kuyruk) polarite ile yeniden gerektiği gibi sağlam. Bu kısa sürede, ön eyespots (asterixed Şekil 1A) ortaya çıkması kolaylaştırılmış kesme beş gün sonra, atılır . Ancak, kayıp yapıların morfolojik restorasyon tam bir hafta sonra ortaya çıkar. Iki başlı solucanlar verim PZQ gövde parçası yenilenme Farmakolojik manipulasyon (Şekil 1B) aynı zamanda güçlü (EC 50 = 87 (+ -)% 11 bipolar parçaları, 48 saat 20 70μM PZQ). Iki kutupluluğun tek bir rejeneratif döngüsü boyunca ortaya çıkar. Bu testleri daha düşük etkinlik, büyük olasılıkla uyuşturucu çözünürlük ve / veya depolama, veya PZQ etkisiz bir farklı flatworm türlerin kullanımı ile ilgili sorunlar ile ilgilidir. Penetrasyonun daha düşük olan ilaçlar için, bir anteriorization indeksi genellikle tam iki kutupluluk 22 kenara ara fenotipleri puan için kullanılır. Pozitif kontrol yapıları RNAi fenotipleri Şekil 1&#39;de gösterilmiştir: japonica Dugesia RNAi altı-1 (D j-six-1), gözsüz bir fenotip 23 (Şekil 1C), Dugesia japonica PC2 RNAi (Dj-PC2) sonuçları ışık kaçınma tepkisi 24 (Şekil 1D) ve RNAi kaybı sonuçları Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1), iki başlı bir gövde parçaları (Şekil 1E) fenotip 16-19, 21 sonuç . Bu fenotipleri aşağıdaki basit RNAi protokolleri kullanarak elde edilebilir: Dj-altı-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), F = besleme döngüsü ve x = rejeneratif döngüsü sırasıyla. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1:... Trunk parçası rejenerasyon tahlil Sol, planarian (üstte) ve şematik (orta) Image eksize gövde parçası yerini göstermek için sağ, gövde parçası yenilenme timecourse belirtilen zamanlarda yenileyici parçası görünümünü gösteren (gün) B PZQ maruz tarafından üretilen iki başlı planarian Image Dj-altı-1 RNAi. mobil kontrol solucan göre hareketsiz Dj-PC2 RNAi solucanlar (lekeli kırmızı) ışık kaçınma tepkisi D kaybı, (lekeli tarafından üretilen C &#39;gözsüz&#39; solucan Dj-βcatenin-1 RNAi tarafından üretilen yeşil) E Bipolar planarian. BE, RNAi solucanlar orijinal anterior ucu sola yönelik. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2: D. birçok genin etkili olduğu demonte için birden fazla beslenmeleri oluşan tipik RNAi protokolü (F) ve rejeneratif döngüleri (x) için devir besleme ve kesim sırası japonica. Bireysel genler için bu protokol Modifikasyonu kullanarak, örneğin, en iyi sonuçlar için gerekli olabilecek daha az (parantez) veya besleme ve rejeneratif döngüleri daha büyük bir sayı.

<ol>
	<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata.">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 .</li><li>Robb, S. M., Ross, E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD:+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li><li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+in+planarian+regeneration.">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li><li>Adell, T., Cebri&#224;, F., Sal&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis.">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration.">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li><li>Newmark, P. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+needed+for+regeneration,+stem+cell+function,+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria.">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li><li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians.">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li><li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development.">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians!.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!.</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li><li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Model+Organisms.">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li><li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians:+translations+to+mammals.">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li><li>S&#225;nchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration.">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li><li>Gurley, K. A., Rink, J. C., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis.">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li><li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Hedgehog/Patched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling.">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li><li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration.">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li><li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Sal&#243;, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians.">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li><li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2++channel+beta+subunits:+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity.">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li><li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration.">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li><li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration.">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li><li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Djeyes+absent+(Djeya)+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1.">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li><li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+(CNS)+revealed+by+neuronal+cell+markers.">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protokolleri japonica planarian Dugesia yenilenme eğitim ve işlenmesi için burada ayrıntılı testlerin nitelendirdi. Bunlar basit ve kolayca laboratuar veya sınıf yapılabilir gibi özel ekipman gerektirmez. Tahliller ayrı ayrı ya da kombine (kimyasal ilaç etkinliklerinin in vivo genetik tarama için) ve aday gen düzeyinde yapılabilir, ya da tarafsız, daha yüksek verim tarama 8 adapte olabilir. Kendi sağ Planaryalar ilginç biyoloji eğitim için olsun, ya da doku rejenerasyonu çalışmak için alternatif bir model memeli homologları in vivo fonksiyonu değerlendirmek için, araştırmacılar bu yaklaşımların çeşitli faiz katalize edilmelidir .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Satıcı </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Kaynak suyu </td><td> Kandiyohi. Premium Waters A.Ş. Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> Kaynak suyu diğer formları da iyi çalışır. Canlılığı testlerin ilk deneme. </td></tr><tr><td> (1,6) NaCl, CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0.1mm), KCl (0.1mm), NaHCO3 (1.2mm), Hepes (1.5mm): 1 x Montjuich tuzları tamponlu. 24 pH 7.4 ° C. </td><td> Birden çok tedarikçiden </td><td> n / a </td><td> PH tampon sağlamak için rejeneratif deneyleri sırasında ilaç tedavileri için yapay su. 5 / 8 Holtfreter çözümü bir alternatiftir. </td></tr><tr><td> 2xYT Broth </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2467-500 </td><td> Medya = 31 g / L. Otoklavlı. </td></tr><tr><td> Petri Dish (100x25mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11 </td><td> Yenilenme döngüleri sırasında Konut solucanlar </td></tr><tr><td> Kare Bulaşık (100x100x15mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11A </td><td> Solucan kesim yüzeyi buz tepsisi olarak kullanılan su, dondurma ile doldurun </td></tr><tr><td> Plastik küvet: Ziploc Büküm &#39;n Loc (16oz). </td><td> Çeşitli perakendeciler </td><td> n / a </td><td> RNAi kohortlarında için uygun su geçirmez kaplarda </td></tr><tr><td> Tavuk Karaciğer </td><td> Ticari bakkal </td><td> n / a </td><td> Antibiyotik kaçınma nedeniyle organik kaynakları önyargılı. </td></tr><tr><td> Blender </td><td> Herhangi bir mutfak tedarikçisi </td><td> n / a </td><td> Tavuk karaciğeri püresi yapmak için kullanın. </td></tr><tr><td> Tel 1mm Mesh süzgeç </td><td> Herhangi bir mutfak tedarikçisi </td><td> n / a </td><td> Tavuk karaciğeri püresi süzme için kullanın </td></tr><tr><td> Sığır kırmızı kan hücreleri </td><td> Lampire Biyolojik Laboratuvarları </td><td> 7240807 </td><td> % 100 eritrosit süspansiyonu Yıkanmış ve havuzlu </td></tr><tr><td> Dairesel filtre kağıtları </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> Transferi Pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> Steril, cerrahi bıçaklar </td><td> Birden çok tedarikçiden </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4668 </td><td> 4 karanlıkta saklayın toz alikotları ° C Birbirinden ayrılacak. </td></tr><tr><td> Dj-altı-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> RNAi &quot;göz&quot; fenotip 23 için pozitif kontrol </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> Iki başlı fenotip 17 RNAi pozitif kontrol </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> RNAi, ışık kaçınma fenotip 24 kaybı için pozitif kontrol </td></tr></tbody></table>

pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian dugesia japonica

Serbest yaşayan planarian flatworms olağanüstü rejeneratif kabiliyetleri 1 deneysel kullanım nedeniyle uzun bir geçmişi var. Bu hayvanların eksize Küçük parçaları eksik vücut yapıları yenilenme orijinal vücut planı reformu. Örneğin, eğer sağlam bir solucan bir &#39;gövde&#39; parçası kesilir, yeni bir &#39;kafa&#39; anteriora yeniden ve &#39;kuyruk&#39; (Şekil amputasyon öncesindeki özgün vücut yapılarının &#39;baş-kuyruk&#39; kutupluluk geri posteriora yeniden 1A). Yenileme, &#39;normal vücut homeostazı ve uygulanan doku rejenerasyonu sırasında ~ 30 farklı hücre tipleri haline ayırt neoblasts&#39; olarak bilinen planarian kök hücreleri tarafından tahrik edilmektedir. Bu rejeneratif sürecinin sağlam ve göstermek için kolay. Şimdi birkaç öncü laboratuarları, birçok araç ve fonksiyonel genetik yöntemler bağlılığı sayesinde bu model sistemi için optimize edilmiştir. Sonuç olarak, önemli son gelişmeler planarian gelişimsel plastisite 2-9 temelini oluşturan moleküler olayları anlama ve manipüle yapılmıştır. Planarian model sistem bilim adamlarından oluşan geniş bir ilgi olacaktır. Sinirbilimciler için, model, bütün bir sinir sisteminin rejenerasyon çalışması yerine, sadece tek bir sinir hücresi süreci genellikle birçok kurulan modellerde çalışmanın odak regrowth / tamir için fırsat tanıyor. Planaryalar bir bolluk ifade nörotransmitterlerin (10), merkezi sinir sistemi 11, 12, evrim eğitimi için önemli bir sistem temsil ve davranış tarama potansiyeli 13, 14 . Rejeneratif sonuçlarını, farmakolojik ve genetik apparoaches tarafından manipülasyon için uygun. Örneğin, uyuşturucu, sadece gövde parçaları yerleştirerek amputasyon sonra uyuşturucu içeren farklı zaman noktalarında çözümler rejenerasyon üzerindeki etkileri için taranmalıdır. Mikroenjeksiyon, devir veya dsRNA yapıları 8, 9, 15, bakteriyel ifade beslenme yoluyla da elde edilebilir demonte yöntemleri (in vivo RNAi), bireysel genlerin rolü incelenebilir . Her iki yaklaşım, bipolar hayvanlar 16-21 yüksek penetrans-örneğin, rejenerasyon görsel olarak çarpıcı fenotipleri üretebilir . Bu model ve bu yöntemlerin uygulanması benimsenmesini kolaylaştırmak için, biz, planarian Dugesia japonica kullanarak, farmakolojik ve genetik testlerin (in vivo RNAi ile besleyerek) Bu video makale protokollerde vitrin.

Watch this Scientific Journal Video about Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica at JoVE.com

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

, Canlı hayvan içinde kök hücre farklılaşması çalışmak için cazip bir model planarian flatworm. Yenileme, temel laboratuvar kolayca yapılır basit amputasyon deneyleri ile çalışılmış ve farmakolojik ve genetik (uygun<em&gt; In vivo</em&gt; RNAi) Bu makalede protokolleri tarafından ayrıntılı olarak manipülasyon.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

pharmacological-functional-genetic-assays-to-manipulate-regeneration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

36.8K Görüntüleme.  University of Minnesota Medical School. , Canlı hayvan içinde kök hücre farklılaşması çalışmak için cazip bir model planarian flatworm. Yenileme, temel laboratuvar kolayca yapılır basit amputasyon deneyleri ile çalışılmış ve farmakolojik ve genetik (uygun In vivo RNAi) Bu makalede protokolleri tarafından ayrıntılı olarak manipülasyon.

Video: Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Biyoloji

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Gelişim Biyolojisi

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Nörobilim

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biyokimya

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Tıp

DRG Kültürlerinde Nöronal Aşırı Duyarlılığı İncelemek için İleri İn Vitro Model

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia (DRG). One proposed cause of this hypersensitivity is associated with the interaction between immune cells in the peripheral tissue and neurons. In vitro models have provided foundational knowledge in understanding how these mechanisms result in nociceptor hypersensitivity. However, in vitro models face the challenge of translating efficacy to humans. To address this challenge, a physiologically and anatomically relevant in vitro model has been developed for the culture of intact dorsal root ganglia (DRGs) in three isolated compartments in a 48-well plate. Primary DRGs are harvested from adult Sprague Dawley rats after humane euthanasia. Excess nerve roots are trimmed, and the DRG is cut into appropriate sizes for culture. DRGs are then grown in natural hydrogels, enabling robust growth in all compartments. This multi-compartment system offers anatomically relevant isolation of the DRG cell bodies from neurites, physiologically relevant cell types, and mechanical properties to study the interactions between neural and immune cells. Thus, this culture platform provides a valuable tool for investigating treatment isolation strategies, ultimately leading to an improved screening approach for predicting pain.

Yazar Spotlight: Kronik Ağrı Tedavisinin Etkinliğini Artırmak için In Vitro ve İn Vivo Modeller

This protocol provides a technique to harvest and culture explanted dorsal root ganglion (DRG) from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device.

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin Dugesia

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi