Bu çalışma bir RO1 NIH (NINDS) hibesi ile desteklenmektedir.

1. Enjeksiyon için hazırlanması virüsler <ol><li> rAAVs önerilen ticari bir satıcıdan satın alındı, ancak kişinin kendi laboratuarında imal edilebilir onlar da (aşağıya tartışma bakınız). Virüs çözümü genellikle mililitrede ~ 1x10 12 genom kopya (GC / ml) bir titrede üretilir ve tam titresi hücrelerinin çok sayıda işlemek için kullanılan olabilir. Alternatif olarak, seyrek etiketleme istenilen düzeyde üretmek için seyreltilmiş olabilir. Kullanıcı tarafından belirlenen uygun seyreltme gerekir, ancak 1:10 seyreltme başlanması tavsiye edilir. </li><li> Kullanmadan önce buz üzerinde virüs hemen çözülmesini sağlayın. Virüs çözümü istenen ön sulandırma hacmi küçük bir (~ 250μl) PCR tüp içine aktarın. Bir doku kültürü kaputu steril DPBS uygun bir hacmi kullanarak virüs çözümü sulandırınız. Sulandırılmış virüs çözümü gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın. </li></ol> NOT: tüm virüsleri taşıma, kurum tarafından onaylanmış bir biyogüvenlik protokolü uyarınca yapılmalıdır 2. Şırınga yükleme ve ekipman montajı <ol><li> Cam şırınga pistonu hafifçe çekerek yükleme iğne bağlayın ve PCR tüp virüs çözümü hazırlamak. Hava çok küçük bir kabarcık şırınga görülebilir kadar pistonu çekerek, bu çözüm şırınga ve yükleme iğne sol olmadığını gösterir. Alternatif olarak, küçük bir miktarda inert boya görünür hale getirmek için çözüm olabilir. NOT: küçük bir PCR tüp olarak kullanılmalıdır yükleme iğne genellikle çoğu diğer tüplerin alt ulaşmak için yeterince uzun değildir. </li><li> Kaldır yükleme iğne ve şırınga tutucu ile güvence, bir şırınga pompası şırınga blok şırınga. </li><li> Şırıngaya bağ hortumun bir ucunu nazikçe, iğne tutucu diğer ucunu takın. Iğne tutucu içine bir iğne takın. Enjeksiyon iğne ucu, doğrudan iğne tutucu bağ tüp içinde sonuna başvurmalısınız. </li><li> Yavaş yavaş bağ tüp yoluyla çözüm itmek için piston elle bastırın. Çözüm küçük bir damla, bir iğne ucu görünür kadar itin. </li><li> Dikkatle itici blok yanında piston konumu ve itici blok dirseğini ile sabitleyin. </li><li> Enjeksiyon parametrelerini ayarlayın: enjeksiyon oranı yaklaşık 8μl/min (~ 130nl / s); enjeksiyon hacmi genellikle 1-2ul; şırınga boyutu için (kılavuzlar için şırınga pompası kılavuzuna bakın) kullanarak uygun şırınga çapı seçin. </li><li> Ocak ayarlayın ~ 38 ° C ve iyileşme döneminde yavrular korumak için, bir kağıt havlu veya ince bir bariyer ile kaplayın. </li></ol> 3. Enjeksiyon prosedürü ve yavru kurtarma <ol><li> P0 ve P1 fare yavrular, bir IACUC onaylanan protokole soğuk anestezi onlara tabi enjeksiyon için hazırlayın. Birkaç kağıt havlu, su ve buz üzerinde yer ile nemlendirin. Yavrular istenilen sayıda (4-5) (ayrı tutmak) kağıt havlu yerleştirin ve hafifçe nemli kağıt havlu ile kaplıdır, böylece yavrular üzerine kağıt havlu kat. Kağıt havlu üstüne hafifçe ezilmiş buz bir miktar yerleştirin ve yavrular yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe edin. Yavrular 15 dakika kadar buz üzerinde saklanır ve daha sonra ince kurtarmak olabilir. </li><li> Yavru yeterince uyuşturulduktan sonra, bir montaj bloğu yerleştirin (normalde 15ml tüpleri tutan plastik bir blok kullanın) ve enjeksiyon için en iyi erişim için pozisyon. Korteks için beyincik için blok kenarına yavru kafatasının arkasına daha iyi bir erişim sağlamak için baş pozisyonu yardımcı olur, karın hayvan düz koymak için en kolay yoldur. Istenirse yavru bir bant yardımı ile yerine sabitlenir olabilir. </li><li> Iğne elle diğer elinizle istediğiniz siteye kafatası yoluyla takılı iken tek elle yerde yavru kafa tutun. Enjeksiyon sırasında hareket etmesini engellemek için cildin sıkı çekmek için yararlıdır. Korteks için gelecek enjeksiyonları yardımcı olacak, kafatası lambda dikiş gibi iyi tanımlanmış bir anatomik işaretine göre enjeksiyonları yapmak için yararlıdır. Beyincik dokusu colliculus doğrudan kaudal yatan ince bir şerit olarak kafatası yoluyla görülebilir. Iğne takılı olmalıdır derinliği bireysel hayvanlar ve suşları arasında biraz değişir ve iğne üzerinde önceden belirlenmiş belirteçleri ile ölçülür olabilir, ancak biz korteks ve serebellum ~ 0.5 derinliği bulmak yüzeyinden 1mm genellikle uygundur. Diğer siteler için ekleme derinliği son kullanıcı tarafından deneysel olarak tespit edilmelidir. NOT: iğne kafatası kolayca nüfuz gerektiğini, yoksa bu hayvan zarar verebilir, çok zor TMEY. Iğne yeniden konumlandırmak ve yavaşça tekrar deneyin. </li><li> Virüs çözümü enjekte edilir. Enjeksiyon başlatmak.pompa START düğmesine basarak veya bir ayak pedalı karartıcı, enjektör kullanılan basınç model bağlı ed. Bir ayak pedalı yokluğunda bir meslektaşım enjeksiyon etkileyebilir gereksiz el hareketleri en aza indirmek için düğmeye basarak yardımcı olması tavsiye edilir. </li><li> Seçilen hacim enjekte edildikten sonra, birkaç saniye için iğne yerde tutmak ve daha sonra yavaşça yavaşça kaydırarak iğneyi çıkarın. Gereksiz hareketleri en aza indirmek için yavrunun kafasını tutmak için emin olun. Enjeksiyon ekipmanı temizlenmeli ve sterilize etanol ile deneyler arasındaki yara küçük olduğundan, antiseptik kullanımı gereksizdir. </li><li> ~ 38 sıcaklık set ile kapalı ocak yavru yerleştirin ° C kurtarma, genellikle 5-10 dakika kadar sıcak. Bu süre zarfında diğer yavrular enjekte devam edebilir. </li><li> Yavruların hepsi iyileşti sonra (bunlar pembe ve hareketli olmalıdır), ev yataklar bir kısmını almak ve yavrular hafifçe ovalayın. Bir grup olarak yavrular anne dönün. </li></ol> NOT: Bu yavrular anne onları geri dönen ve bir grup olarak onlara geri dönmek için önce sıcak ve ev yataklar maruz emin olmak için çok önemlidir. Bunu yapmadığınız takdirde yavrular yaralanmasına ya da öldüren anne neden olabilir. 4. Ekipman temizliği <ol><li> Enjeksiyon tamamlanır ve yavrular annelerinin iade edilmiş sonra, tam olarak aseton veya% 70 etanol ile şırınga yükleyerek enjeksiyon kurulum temiz. Her zaman taze solüsyon kullanarak çözüm, enjeksiyon kurulum birkaç kez yıkayın. Bu kalan virüs çözümü kaldırmak ve çökeltileri. Aseton veya etanol buharlaşır. NOT: Aseton temizlik için tercih edilen, ancak kurulum siyanoakrilat yapıştırıcılar gibi herhangi bir aseton duyarlı bileşenleri kullanır, o zaman bu adımlar için% 70 etanol kullanın. </li><li> Biohazard uygun bir kap içinde, çamaşır suyu ve iptal atık ile çalışma alanı dezenfekte edin. </li></ol> 5. Analiz <ol><li> IACUC onaylanmış bir ötenazi yöntemi kullanılarak istenilen yaşta hayvanların Kurban. Perfüzyon fiksasyon, özellikle yetişkin hayvanların enfekte nöronlar, daha sonra görselleştirme yardımcı olmak için tavsiye edilir. </li><li> Standart immün prosedürleri floresan sinyalini yükseltmek için kullanılıyor olabilir. Kısaca, PBS +% 1 Triton X-100 ile 100 mikron vibratome bölümleri yüzen permeabilize ve PBS +1% Triton X-100% 10 normal keçi serumu bloke. Bölüm 4 geceleme primer antikorlar ° C, yıkama ve engelleme ek çözüm engelleme inkübe edilir. Bölüm, sonra oda sıcaklığında 2 saat için sekonder antikor ile çözüm engelleme inkübe iyice yıkanır, kızaklar üzerinde monte edilmiş ve anti-solmaya montaj medya dakika muamele edilir. Cryosections etiketli nöronlar da görselleştirmek için kullanılabilir, ancak endojen floresan kaybolabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Başarılı bir enjeksiyon prosedürü gözlemlenebilir doku hasarı veya hayvansal diğer kötü etkileri ile enjeksiyon yerinde bölgedeki nöronların sağlam enfeksiyonu üretecektir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, enfeksiyonun yayılmasını çeşitli anatomik siteleri rAAV8-Cre enjekte Cre-muhabiri fareler (ROSA26R) 12 görülebilir. Korteks ve üstün colliculus gibi belirli bölgelerde, içine enjeksiyon, genellikle komşu bölgeler (Şekil 1A-B) minimal yayılması ile yerel enfeksiyonlar oluşturur. Yüksek titreye virüs çözümü kullanılması daha muhtemeldir (Şekil 1A) hipokampus gibi bitişik olan alanlarda, enfeksiyon yapar. ROSA26R muhabiri fareler (Şekil 1C-D) orta hat serebellar rAAV8 Cre enjeksiyon gösterildiği gibi, tipik olarak enjeksiyon yeri yakınında kalır seyrek enfeksiyon düşük titreye virüs çözümü sonuçları, Enjeksiyon. Biz muhabiri genler enfeksiyon, rekombinasyon ve ifade nispeten hızlı bir şekilde oluşabilir düşündüren, rAAV8-Cre enjeksiyondan sonra 2 gün içinde ROSA26R muhabiri farelerde rekombinasyon gözlemledik. Ayrıca, başarılı floxed koşullu allel olmayan bir ROSA lokustaki gen silme etkilerini incelemek amacıyla bu tekniği kullandık, sonuçları başka bir yerde ilan edilecektir. Enfekte hücrelerin sayısı enjekte viral çözüm titresi ile ilişkili olmalıdır. Örneğin, yüksek titresi çözümleri, beyincik farklı floresan proteinleri ifade iki rAAV8 virüslerinin bir karışımı enjekte farklı (Şekil 2A) etiketli birçok Purkinje hücreleri bozar. Aksine, düşük titresi virüs solüsyon enjekte tek hücre (Şekil 2B) görselleştirmek yardım etmek için seyrek enfeksiyona neden olabilir. Floresan etiketli nöronlar taze kesilmiş, canlı doku (Şekil 2B) doğrudan gözlenemeyen veya geniş alan veya ortak, daha sonra görüntü elde etmek için endojen floresan sinyalleri güçlendirmek için immün tabi tutulabilirnOdak floresan mikroskobu (Şekil 2A, Şekil 3A-C). Son olarak, rAAV8 ince süreçlerin güçlü etiketleme (Şekil 3A-C) ile kortekste nöron tipleri çeşitli bulaştırma yeteneğine sahiptir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> Şekil 1: P0 rAAV8-Cre enjekte edildi ROSA26R muhabiri farelerin beyin LacZ boyama Cre aktivite ve enfeksiyon yerini göstermektedir. <ol type="A"><li> P14 beyin yüksek titresi (1x10 12 GC / ml), korteks ve üstün colliculus içine enjeksiyon gösteren bir geniş alan sagital görünüm . Yüksek titresi virüs komşu alanlarda aynı zamanda enfekte olacağını daha olası hale getirir. </li><li> Alt titresi (1x10 11 GC / ml) enjekte P14 korteksin sagital kesiti, virüs yaymak için daha az bir lokal enfeksiyon gösterir . </li><li> Düşük titreye sahip orta hat (1x10 9 GC / ml) virüs çözümü enjekte P28 beyincik wholemount görünümü enfeksiyon seyrek ve genellikle enjeksiyon yerinde yakın kaldığını gösterir. </li><li> C beyinciğin orta hat sagittal görünüm). Genellikle sadece Purkinje hücreleri rAAV8 tarafından enfekte unutmayın. </li></ol><img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> Şekil 2: floresan proteinleri ifade rAAV8 yüksek ve düşük titreleri ile enjeksiyon Serebellar etiketleme. <ol type="A"><li> EGFP (yeşil) ve DsRed (kırmızı) ifade eden bir karışımı iki virüs ile enfekte P21cerebellum sagital bölümü. Purkinje hücreleri çok sayıda enfekte virüslerin yüksek titresi karışımı kullanılmıştır. </li><li> Çok düşük titreye viral enfeksiyon canlı P14 beyincik Purkinje hücre diseksiyonu sonra hemen görüntülenmiş. </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> Şekil 3: rAAV8-DsRed Kortikal etiketleme. P0 az rAAV8-DsRed bulaşmış olan bir P21 korteksin koronal bölümlerde çeşitli kortikal nöron tipleri örnekleri.

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yenidoğan viral enjeksiyon yöntemi, doğum sonrası beyin gelişimi ve çalışması için in vivo mozaikleri oluşturmak için basit ve hızlı bir şekilde sağlar . Bu yöntem yanı sıra şu anda proje 6 Hedefleme Yüksek Verimli Gen yoluyla alınıyor olduğunu mevcuttur floxed allellerin yararlanır . Cre transgenik ifade kullanımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem floxed allel taşıyan fareleri deneyler için doğrudan kullanılabildiği gibi, çeşitli hücre tipleri gen fonksiyonunu test etmek için hızlı bir yol sağlar ve tüm virüs enjeksiyon prosedürü baştan sona. bir saatin altında gerçekleştirilir. Buna ek olarak, enfekte hücrelerin sayısı, bireysel nöronların seyrek etiketleme sağlayan virüs, titresi değiştirerek kolayca kontrol edilebilir. Biz sadece örnek görüntüler nöronal morfoloji açıklanan rağmen, enfekte olmuş nöronların analiz dallanma ve döşeme, yanı sıra, omurga morfolojilerinden gibi sinaptik gelişme, aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere birçok önemli gelişim süreçleri, genişletilebilir. Prosedürün üç en kritik parçalar enjeksiyon yerinde, enjeksiyon ekipman güvenilirlik, ve yavruların hayatta kalma hedefleme doğruluğu. Ilk boy - doğruluk - en iyi deneyimi ile öğrenilir. Enjeksiyon ekipman güvenilirlik, aslında bir takunya, sızıntıları, ya da enjeksiyon öncesinde ekipmanları ile diğer sorunları olmadığından emin olmak gerektiğini ifade eder. Son olarak, Adım 3.7 &#39;de belirtilen ipuçlarını takip eğer yavruların hayatta kalma genellikle bir sorun değildir. Bu yordamı belirgin bir değişiklik, farklı genler ifade virüslerinin bir karışımı kullanmaktır. Örneğin, tek bir hayvan seyrek etiketli nakavt (yeşil) ve kontrol (kırmızı) hücreleri bir mozaik üretmek için iki virüs, rAAV-Cre-GFP ve rAAV-RFP, bir karışım enjekte edilebilir. Bu, özellikle yabani tip ve mutant allel aynı fare beyindeki nöronların morfolojik analizi için yararlı hale geleneksel gen tırnakları üzerinde tek hücre analizi için ayrı bir avantaj sağlamaktadır. Bu aynı zamanda bir sınırlama olabilir, ancak, gözlemlenebilir bir etkisi üretmek için çok sayıda nöron işlemek için gerekli olabilir hangi davranış çalışmaları, bir dilek gerçekleştirmek için. Biz yaş P4 Ancak, biz genellikle postnatal yaş 3 (P3) enjeksiyonları kadar gerçekleştirmek olduğunu bulmak ve kafatası genellikle çok kalın bir iğne ile kolayca ponksiyon. Ancak, belirli bir yaşta kafatası kalınlığı hayvandan hayvana değişebilir, bu nedenle bu sorun deneyci tarafından değerlendirilmesi gerekir. Cre ifade virüs loxP-STOP-loxP allel ile çok sayıda floresan muhabiri fareler 13 üretilen edilmiştir ve floxed alleli ile dahil edilebilir ifade floresan proteinleri kullanarak ek olarak . Yeni allel de dahil olmak üzere uygun genotipler ile fareler elde etmek için gereken süreyi ekler olsa da, bu muhabir fareler aynı anda Cre aktivite ve etiket bireysel nöronlar izleyebilirsiniz. Çünkü rekombinant rAAVs seçici tropizm, belirli bir rAAV serotip (Şekil 1D) seçerek farklı nöronal hücre tipleri anatomik bölgelerde etiketli olabilir. Özgüllük de farklı rehberleri kullanarak elde edilebilir. Buna ek olarak, böyle bir lentivirüs gibi diğer virüsler, nöronlar 10 bulaştırmak için kullanılabilir . Buradaki avantaj, bu virüsler Cre değil, aynı zamanda, shRNA baskın ve aktif genler gibi diğer genetik materyal, sadece ifade etmek için daha büyük DNA ekler taşıyabileceği. Ayrıca, yöntem koşullu ifade Cre hatları iyi kurulmuş yeni geliştirilen transgenik sıçan 14, kullanılabilir. Son olarak, bu kez tekniği laboratuarı kurulmuştur, daha fazla gibi in vivo olarak diğer analitik araçlar, iki-foton görüntüleme 11 ve / veya elektrofizyoloji, nöral devre gelişimi ve işlevi her genin işlevini çalışma ile kombine edilebilir

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre, GFP, DsRed </td><td> Vektör Biolabs </td><td> # 7060 # 7061, özel sipariş </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pompa 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702.208 </td><td> (Hayır ayak pedalı bağlantı noktası) </td></tr><tr><td> Retina pigment epiteli Enjeksiyon Kiti </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> RPE-KIT </td><td> Bağ boru, enjeksiyon iğneler (36G) ve iğne tutucu </td></tr><tr><td> NanoFil Şırınga, 100μl </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Yeniden kullanılabilir yükleme iğne içerir </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP antikor </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed antikor </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Isıtma Blok </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R fare </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Normal beyin fonksiyonu, sinir devreleri olgunlaştı ve rafine zaman doğum sonrası gelişim üzerinde de sadece büyük nöronal yollarda kurulan embriyonik gelişim dayanır, ama. Bu aşamada Misregulation gibi otizm ve şizofreni 1,2 gibi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklara yol açabilir. Birçok genin prenatal beyin okudu ve birçok gelişim süreçleri 3-5 için çok önemlidir bulundu. Ancak, doğum sonrası beyin işlevi farelerde silinmesi genellikle neonatal gelişim sırasında ölümcül götüren kısmen ve erken gelişim kendi ihtiyacı postnatal analiz engellemektedir kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu engelleri aşmak için, bu genlerin floxed allel farelerde 6 oluşturulan ediliyor. Ifade Cre recombinase belirli hücre tipleri, koşullu silme postnatal beyin gen fonksiyonu çalışma elde edilebilir ki transgenik allel ile birleştirildiği zaman. Ancak bu yöntem, böylece fare beyni büyük bir ölçekte genetik analiz genişleme sınırlama, uygun genotipler ile fareler üretmek için ek allelleri ve ekstra zaman (3-6 ay) gerektirmektedir. Burada postnatal beyin geliştirme, hızlı ve sistematik bir şekilde bu floxed allel çalışma viral-ifade Cre kullanan tamamlayıcı bir yaklaşım göstermektedir. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) 7,8 kodlama Cre neonatal beyin içine enjekte edilerek, beynin farklı bölgelerinde ilgi gen silebilir. Viral titresi kontrol ve floresan protein işaretleyici coexpressing, biz aynı zamanda mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, erken geliştirme birçok genin gereksinimi, dallanma ve döşeme, sinaps oluşumu ve arıtmanın yanı sıra, atlar ve bize aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere, doğum sonrası beyin gelişiminde çok kritik süreçlerin kendi hücre otonom fonksiyon, çalışma sağlar. Bu yöntem, kendi laboratuvarı (yayınlanmamış) ve diğerleri 8,9 başarıyla kullanılmaktadır ve lentivirüs 9 yanı sıra, shRNA veya baskın olarak aktif proteinlerdeki 10 ifade gibi diğer virüsler, uzatılabilir . Ayrıca, elektrofizyoloji bu tekniği birleştiren yanı sıra yakın zamanda geliştirilen optik görüntüleme araçları 11 genetik yollar fare ve sıçanlarda sinir devresi gelişimi ve işlevi nasıl etkilediğini incelemek için yeni bir strateji, bu yöntem sağlar .

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Bir<em&gt; In vivo</em&gt; Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Görüntüleme.  Keck School of Medicine, University of Southern California. Bir In vivo Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Video: Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Gelişim Biyolojisi

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Nörobilim

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a powerful model system for the investigation of cell type-specific mechanisms of neuronal morphogenesis and connectivity. The organization and composition of retinal subtypes are well-defined, and genetic tools are available to access specific types during development. Many retinal cell types also constrain their dendrites and/or axons to narrow layers, which facilitates time-lapse imaging. Mouse retina explant cultures are well suited for live-cell imaging using confocal or multiphoton microscopy, but methods optimized for imaging dendrite dynamics with temporal and structural resolution are lacking. Presented here is a method to sparsely label and image the development of specific retinal populations marked by the Cre-Lox system. Commercially available adeno-associated viruses (AAVs) used here expressed membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner. Intraocular delivery of AAVs in neonatal mice produces fluorescent labeling of targeted cell types by 4-5 days post-injection (dpi). The membrane fluorescent signals are detectable by confocal imaging and resolve fine branch structures and dynamics. High-quality videos spanning 2-4 h are acquired from imaging retinal flat-mounts perfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF). Also provided is an image postprocessing pipeline for deconvolution and three-dimensional (3D) drift correction. This protocol can be used to capture several cellular behaviors in the intact retina and to identify novel factors controlling neurite morphogenesis. Many developmental strategies learned in the retina will be relevant for understanding the formation of neural circuits elsewhere in the central nervous system.

Here, we present a method for investigating neurite morphogenesis in postnatal mouse retinal explants by time-lapse confocal microscopy. We describe an approach for sparse labeling and acquisition of retinal cell types and their fine processes using recombinant adeno-associated virus vectors that express membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Gelişmekte Olan Fare Beyninde Nöronal ve Glial Hücre Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

Yazar Spotlight: Gelişmekte Olan Beyinde Hücre Göçünü ve Gen Rollerini Keşfetmek

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ'una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi