Yazarlar intravital film, Dr. Jonathan Lindquist yazının dikkatle okunması için optimize yardım için Dr. Lars Philipsen teşekkür ve Gunzer laboratuvar yönteminin geliştirilmesi sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için tüm üyeleri. Bu çalışma MG Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) bağışları ile finanse edilmiştir

1. Enfeksiyon <ol><li> Şişmiş konidya küf Aspergillus (suşu ATCC 46.645) ile desteklenmiş RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ön-inkübasyon tarafından üretilen% 5 FCS (v / v). 2x10 7 dinlenme konidya 5 ml ortamda yeniden süspanse ve 6-iyi doku kültürü plakası (DYP AG; Trasadingen, İsviçre, katalog # 92.006) inkübe 37 ° 7h ° C </li><li> 6-iyi de içeren her Aspergillus; şişme döneminin ardından, sporlar floresan calcofluor beyaz stok solüsyonu (DMSO [25 mg / ml] Sigma Aldrich, Deisenhofen, Almanya, katalog # F3543) 10 ul ekleyerek etiketlenir plaka, son bir calcofluor konsantrasyonu 50 mcg / ml RPMI ulaştı. Nazik karıştırma, sporlar, 37 ° C&#39;de 15 dakika ek bir inkübe </li><li> Bir sonraki adımda, sporlar, 70 mikron hücre süzgeç (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) ile filtrasyon ile hasat edilir. Pelet 2 ml PBS ve şişmiş Konidyumların Neubauer odasına sayma tarafından belirlenen toplam sayısı 10 ml PBS (oda sıcaklığında 5 dakika 900xg santrifüj) ile bir kez yıkadıktan sonra yeniden süspanse. Son olarak, spor süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika 900xg aşağı bükülmüş, süpernatantı dikkatle kaldırılır ve pelet nihai konsantrasyonu 100 ul PBS başına 1x107 sporları için yeniden süspanse. </li><li> Enfeksiyon, spor çözüm ul dişi farelerde (C57/BL6, eski 8-10 hafta, Harlan, Almanya) 100 intratrakeal uygulanır. Nötrofillerin yanı sıra dikkat edilmesi gereken ise, lizozim Promotor 1 altında EGFP taşıyan Lys-EGFP farelerin kullanımı tavsiye edilir. 150 ul Ketamin / Rompun çözüm (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya (Ketamin) ve Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] başlayın hayvan tek bir IP enjeksiyonu ile anestezi + 0.5 ml Rompun% [2] + 3.5 ml steril NaCl [% 0.9]). 5 dakika sonra anestezi fare dişleri entübasyon (ek Şekil 1) kolaylaştırmak için rampa (yani bir eğimli yüzey) elastik bir bant ile sabit olabilir. Forseps kullanarak, dil, tek taraflı ve 22G kalıcı venöz kateter (B. Braun AG, Melsungen, Almanya, Vasofix Braunüle) hafifçe kalıcı bir kaz boyun lamba ile aydınlatma altında trakea içine eklenebilir çekilir. Kateterin başarılı ekleme, mekanik ventilatör frekans hayvanın göğüs kafesi düzenli hareketlerini izleyerek tarafından doğrulanmadı. Başarılı entübasyon onaylandığı zaman, 100 ul spor süspansiyon, 100 ul mikropipet kullanılarak uygulanır. Bu ses 1-2 sn içinde herhangi bir ek yardım almadan hayvan tarafından inhale edilmelidir Mekanik olarak 2 dakika boyunca dakikada 250 nefes oranı ve 300 inhalasyon hacmi küçük bir hayvan respiratör (MiniVent Hugo Sachs, Mart-Hugstetten, Almanya) ile enfekte hayvan havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir ul nefes başına (ek Şekil 2). Enfeksiyon hayvanlar kendi kafesine geri döndü ve tekrar ayaktan kadar her 5 dakikada bir gözlenen sonra. Fare aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında ağrı veya sıkıntı herhangi bir kanıt yoktur. </li></ol> 2. Akciğer hazırlık <ol><li> Sporlarla birlikte enfeksiyon 7 saat sonra, hayvanın aşırı dozda tarafından ötenazi izofluran (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Almanya) hareketleri ve solunum 30 saniyeden fazla durdurdu kadar. Bu daha sonra, ikincil bir yöntem olarak klinik ölüm sağlamak ve görselleştirme ve trakea ve akciğerler erişim için izin torakotomi takip edilmektedir. Sonra göğüs, akciğer ve üst solunum yolu açığa çıkarmak için dikkatle açıldı. Sonra başka bir 22G kalıcı venöz kateter maruz epiglot başlayarak trakea içine sokulur. Bu borucuk aracılığıyla akciğerlere 1 ml Omnifix şırınga (B. Braun) ile 1 ml önceden ısıtılmış düşük erime agaroz (2% w / v, Promega, Mannheim, Almanya) ile doldurulur. Trakea, akciğerler dolu olarak kısa bir parça dikiş ipliği ile bağlıdır ve tüm hayvan 4 bir buzdolabı koymak ° C. </li><li> 15 dakika sonra, agaroz katılaşmış, tüm akciğer, trakea itibaren eksize edilir. Bir çift sivri makas kullanarak, sağ akciğer lob daha sonra kaldırılır, alt yüzeyi kısa süre içinde bir yaprak kağıt mendil kurutulur ve daha sonra tüm lob vibratome (Chipping Instruments, İngiltere, 752M Vibroslice hazırlanması blok yapıştırılmış ) fiksasyon için doku yapıştırıcısı (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya, Roti-Coll 1) bir damla. 1 dakika sonra blok önceden soğutulmuş (4 ° C) PBS ile doludur vibratome, kesme odasında yüklenir. Vibratome orta sınıf bir titreşim (10 max 5) ve aynı zamanda orta hızı (5, 10 max.) Böyle bir yatay kesitiakciğer üretilmektedir. Organ üst yarısında daha sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı Kendi kendine yapılan bir düz rondela (iç çapı 1 cm) ile ters ve sabit bir küçük plastik Petri kabı (5 cm çapında), aktarılır dışında her 1 mm (tamamlayıcı şekil 3). Son olarak Petri kabı 10 ml PBS ile desteklenmiş 10 ul DNA boya Sytox Turuncu 5 mcM son bir boya konsantrasyonu [5 mM] (Invitrogen, Almanya) ile doludur. </li></ol> 3. 2-foton lazer mikroskopisi <ol><li> Akciğer örnek içeren Petri kabı sonra tampon bir sıcaklık sensörü kontrollü ısıtıcı (ek Şekil 4) ile 37 ° C ısınmış olabilir, böylece mikroskop objektif altında yüklü. 2-foton mikroskopi sonra 20xNA1.0 suya daldırma lens (Zeiss Jena, Almanya) ile donatılmış bir dik Axio Examiner sahnede Zeiss LSM 710 NLO mikroskop kullanarak tüm kesim yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Görüntüleme için, bölüm boyunca farklı alanlarda tespit yeşil (530 nm) ve kırmızı (580 nm) floresans yanı sıra, ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyal ve 800 nm dalga boyunda bir aydınlatma ile 400 mikron derinliğe kadar taranır mavi calcofluor floresan olmayan harici descanned dedektörleri (NDD) (400-470 nm emisyon). 2-D görüntü ve zaman atlamalı filmleri (1 resim her 5-10 saniye) yanı sıra, tek veya tekrarlayan 3-boyutlu resim yığınlarını sonradan voksel kaplamalar kullanarak ya da tek uzun odak görüntü veya 4-D (zamanla 3D) olarak işlenecek farklı yazılım paketleri. Bu mikroskobik kurulum havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası oluşturur, muazzam bir immünolojik alaka, neredeyse bozulmamış bir ortamda hücresel davranış gözlem sağlar. Hücre motilite, fagositoz ve küf Aspergillus enfeksiyonu takiben endojen nötrofil NET üretim yerinde koşullarda kolayca bu altında incelenebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Eğer yapılırsa düzgün görüntüleme 2 üretecektir - veya 3-renkli dia veya film. Boyama sonrası bir işleme prosedürü yapılır ve böylece özgürce adapte olmasına rağmen, genelde göreceli kanal tespit boya / sinyal, doğal renk yansıtan bir boyama düzenini seçin. Böylece, Sytox boyalar varsa, EGFP-işaretli hücrelerin yeşil lekeli, kırmızı, mantar gibi SHG sinyal mavi ile gösterilmiştir tasvir ve. İlk örnekte (Şekil 1) mavi SHG sinyali ile enfekte olmayan akciğer dokusu lifleri ve kırmızı Sytox sinyal, akciğer yerleşik hücrelerinin çekirdekleri tarafından üretilen vibratome tarafından kesilerek açılır gösteriyor. Hem de alveoler yapıların yanı sıra mantar kitlelerin, mavi renkte görünmesi, çekirdek ve NET&#39;ler kırmızı lekeli ikinci örnekte (Şekil 2) virüslü bir akciğer, gösterilir. Üçüncü örnek (Şekil 3), yeşil, mavi ve kırmızı yapıların yanı sıra nötrofiller de görülebilir Lys-EGFP transgenik hayvan. Nötrofil ve zaman atlamalı dizileri bireysel mantar elemanlarının fagositoz göç tamamlayıcı film gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Enfekte olmayan akciğer dilim 2-renkli bir görünüm 2-foton mikroskopi. Akciğer dilim olmayan enfekte fare C57/BL6 hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülü. Alveoler doku yapısı (A) SHG sinyal burada Sunan akciğer dilim (B) ve iki kanal (C) bir yerleşim hazırlanması sırasında, hücre çekirdeğinin Sytox sinyal açık kesti. (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Akciğerin alt kısmında fibröz doku olarak yukarıdaki akciğer solunum aktif alanlar içinde açıkça alveoler organizasyona kıyasla dilim dikkat ediniz. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Aspergillus enfekte vahşi tip hayvan akciğer dilim 2-foton mikroskopi 2-renk görünümü. 7 saat enfekte C57/BL6 fare akciğer dilim A. önce fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveolar doku (A), DNA NET&#39;ler Sytox sinyal yanı sıra hücre çekirdekleri hazırlanması sırasında (B) akciğer dilim kesilerek açılır ve iki kanal kaplama (C) . (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Lütfen dikkat, mantar kitleler, alveoller ve NET-yapıları açıkça farklı alanlarda sırasıyla E, A ve N harfleri ile işaretlenir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. 3-renk akciğer dilim Aspergillus enfekte Lys-EGFP hayvan bir görünüm 2-foton mikroskopi Lys-EGFP fare akciğer dilim 7 saat önce enfekteA. fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveoler doku (mavi), hücre çekirdekleri ve NET&#39;ler (kırmızı) Sytox sinyal, yanı sıra yanı sıra çok sayıda nötrofil (yeşil). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Şekil 4" /> Tamamlayıcı rakam 1. Entübasyon için Fare fiksasyonu. Ketamin / Rompun anestezi altında hayvan dişlerini 22G kalıcı venöz kateter ile entübasyon kolaylaştırmak amacıyla elastik bir bant ile sabitlenir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Şekil 5" /> Tamamlayıcı rakam 2. Mekanik fare ventilasyon entübe fare 100 ul PBS içinde yeniden süspanse 1x10 7 sporların bir uygulama tarafından bulaşır. Mekanik, küçük bir hayvan solunum ile enfekte fare havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Şekil 6" /> Tamamlayıcı rakam 3. Akciğer lob fiksasyon organ sağ akciğer lob ön hazırlıktan sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı bir laboratuvar yapımı düz rondela kullanmak bir Petri kabındaki sabit . <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Şekil 6" /> Tamamlayıcı rakam 4. 2-foton görüntüleme kurulum sağ akciğer lob içeren Petri kabı, boya Sytox Orange DNA eklenmesinden sonra 2-foton mikroskop altında bir ısıtma matı yüklü . Ek film: yaşayan bir mantar enfeksiyonu sonrası akciğer dilim 7 saat 2-foton mikroskopi zaman atlamalı görüldüğü gibi göç ve Aspergillus enfekte akciğerlerde mantar elemanları phagocytosing Nötrofiller Nötrofiller yeşil, mantar elemanları ve SHG mavi ve hücre çekirdekleri gibi NET yapıları kırmızı olarak tasvir edilmektedir. Deney gerçek zamanlı sağ alt köşesinde gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mm gösteriyor. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">videosunu izlemek için tıklayın</a>

<ol>
	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

In vivo ya da sağlam organlarda Gerçek-zamanlı 2-foton mikroskopi, son 10 yılda, bağışıklık hücrelerinin fizyolojisi ile ilgili çalışmalarda derin önem kazanmıştır. T-hücre aktivasyonu, lenf düğümleri içinde dinamikleri gibi önemli olaylar ilk 2-4 görünür hale geldiği, bu tekniği ile oldu . Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar da, bu yaklaşımın 5 kullanarak lenfatik dokular efektör hücrelerinin üretimi ilk adımları gibi spesifik hücresel fonksiyonları analiz etmeye başladık . Ancak, bu yöntemi kullanarak bir dizi yeni biyolojik kavramların ortaya olmasına rağmen, hala zorlu ve hiçbir intravital görselleştirme çalışmaları şimdiye kadar yayınlanmış olan hangi önemli sorular vardır. Özellikle bu memeli akciğer için de geçerlidir. Bu organ ilginç yönü, havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası olarak, immünolojik süreçleri memeli vücutta yer aldığı en önemli yüzeylerin biri yapar. Bütün ömrü boyunca her nefeste, istenmeyen parçacıklar olan ve hayatı tehdit eden enfeksiyonlara 6 neden potansiyeline sahip bazı solunması. Savunma mekanizmalarının böyle bir hassas ve nesilleri tükenme tehdidi altında olan bir yerinde sıkı bir ağ bağışıklık yanıtlarını tüm repertuar sergileyen bulunması gereken bu kendi kendini açıklayıcı. Öte yandan, böyle bir &quot;kirli&quot; bir yerde potansiyel patojenlere karşı uyarılan immünolojik mücadele sıkı kontrol olması çok önemlidir. Bağışıklık sisteminin abartılı tepkiler, kitlesel belirsiz immün hücre eylemleri 7,8 uyarılması üzerine organ doku yaralanmasına kendi bedeni zarar yüksek bir risk taşımaktadır . Bu düşünceler ışığında, in vivo koşullarda gerçek altında memeli akciğerlerde hücre davranışı araştırmak için son derece ilginç ve yararlı olacaktır. Ancak, böyle bir sistemin şimdiye kadar başarılı bir çalışma protokolü kurma çözülmesi gereken çok büyük zorluklar açıkça noktaları uygulamaya henüz sahip olduğu bir gerçektir. En zorlu meydan muhtemelen odak istikrar. Nefes sorumlu organı olarak akciğer inhalasyon gerçekleştirmek için alan her üç yönde sürekli hareket altındadır. Bu durum tek başına, ciddi görüntüleme sorunlara neden olur ve bir intravital görüntüleyiciler &quot;kabus&quot; olarak kabul edilebilir. Zaten uzayda herhangi bir boyut için hafif bir hareket, mikroskobik görüntüsü, anlamlı görüntüler oluşturmak için 9 mikrometre hassasiyetle kararlı olması gereken büyük bir bozulan bir etkiye sahiptir. Doğal sıkı yerel odak göz önüne alındığında, 10, 2-foton mikroskopi, odak kararsızlıkları bile daha duyarlı Z-yönünde sadece birkaç mikrometre aralığında belirli bir yapının bir çıkığı olarak tam bir odak kaybına eşdeğerdir ve dolayısıyla başarısız bir deneme. Fare akciğer içinde bağışıklık hücreleri, gözlem için bu çalışmada sunulan protokol, işlevsel sağlam akciğer 11 durum in vivo uygulama değil, yakın bir değildir. Eksplante lenf örneğin görüntüleme lenfositler için ex vivo yaklaşımları , düğümleri, in vivo gözlemler 12 gerçek eşdeğer sonuçlar gösterilmiştir ve bu nedenle 5 derece alakalı. Yaklaşımı ile mümkün olan akciğer dilimleri, yerinde gözlemler, virüslü bir akciğer, kısa bir süre eksizyon sonra gerçekleşecek . Kesme işlemi sırasında 3D bütünlüğünü agaroz matris, akciğer tam kontrollü kesme işlemi sağlamak için önemli bir adım tarafından sağlanmaktadır. Agaroz matris bir katılaşma izin vermek için kısa bir süre için eksplante akciğer soğutmak için gerekli olmasına rağmen, kesme ve doku rewarming sonra hücreleri için yakın fizyolojik koşullara dönmek mümkün. Bu açıkça, bu koşullar altında nötrofillerin son derece aktif ve Aspergillus enfeksiyonu etkili bir şekilde temizlenmesi için gerekli olan çevik fagositler, potansiyellerini tam olarak sergilemek olduğunu göstermek bizim veri gösterilir. Bunlar alveoller iç bölgelerine ulaşmak için epitel engelleri geçerek akciğer dokusunda devriye ve bunun da ötesinde, mantar sporlarının aktif 11 kadar sürebilir. Bu çalışmanın bir anahtar bulgu Aspergillus enfekte organ Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) benzeyen yapılar görünümünü oldu. NET&#39;ler nötrofil 13 yeni savunma mekanizması çok yakın bir bulgudur . Ancak, 2004 yılında ilk açıklamasını bu yana, hayvan modellerinde ya da bu fenomeni gözlenmiştir veya eksik olan insanlarda fizyolojik veya patolojik koşullar sayısı patlayarak 14-16 artan olmuştur. İlginçtir ki, çok çalışma, bu yapıların çok farklı gruplar tarafından harcanan olmasına rağmen, çoğu raporda hala çok açıklayıcı bir seviyede ve çok değilNET sürümü mekanizması ve düzenlenmesi ile ilgili bilinir. Protokolü ile virüslü bir akciğer NET lifler göstermek için ilk kez başardık. Ayrıca, biz, kendi oluşumu veya inhibisyonu 11 için taze işe nötrofil yanı sıra moleküler mantar yapıların önemini göstermek . Bu yöntemi daha ayrıntılı NET oluşumu tek adımları araştırmak için potansiyeli açık bir şekilde göstermektedir. Bir evlatlık transfer deneylerde NET oluşumu becerilerini gözlemlemek için uygun fareler knock-out nötrofil kullanmak örneğin düşünebiliriz. Böylece periferik kan nötrofil göç doğrudan gözlem Organ eksplantasyonunun sonra kan arz eksikliği nedeniyle bu sistem ile mümkün olmamasına rağmen, biz hala bizim protokol görüntüleme sağlayan bir işlemek için değerli ve nispeten kolay bir yaklaşım olduğuna inanıyorum akciğer enfeksiyonlarına karşı bağışıklık savunma erken veya geç adımlar. Bu nedenle, canlı hayvanların solunum akciğer içinde bu fenomenin incelenmesi yönünde önemli bir adımdır.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Gastrointestinal sistem, akciğer, omurgalı vücut ve çevre arasındaki etkileşim için en büyük ikinci yüzey. Burada, aynı zamanda, normal solunum sırasında inhale birden fazla patojenlerin enfeksiyon kaçınarak etkili bir gaz alışverişi, bakımlı olmalıdır. Bunu başarmak için, savunma stratejileri, humoral ve hücresel immün mekanizmaları birleştirerek mükemmel bir set var. Akut akciğer savunma için en etkili önlemlerden biri ya da inhale patojenleri fagosite veya sitotoksik kimyasalların serbest bırakarak onları öldürmek nötrofil, işe alım. Nötrofil cephanelik için yeni bir ek bakteri veya mantar yakalanan veya inaktive NET serbest hücreleri öldü sonra bile olabilir ekstrasellüler DNA NET&#39;ler patlayıcı sürümüdür. Biz, burada kısa bir süre önce enfekte akciğer içinde göç yanı sıra enfekte doku boyunca ürettiklerini geniş NET&#39;ler görselleştirmek gibi fungal patojenlerin phagocytosing nötrofil biri doğrudan gözlemlemek için izin veren bir yöntem mevcut. Bu yöntem, çok renkli zaman atlamalı 2-foton mikroskopi kalıp Aspergillus ve sınav konidya ile farelerin intratrakeal enfeksiyon 7 saat sonra, kalın yaşayabilir akciğer dilimler hazırlama açıklamaktadır. Bu yaklaşım, bir doğrudan yerli akciğer dokusunda antifungal savunma araştırmak için izin verir ve böylece pulmoner dokunulmazlık ayrıntılı soruşturma için yeni bir caddeye açılır.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy at JoVE.com

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K Görüntüleme.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Video: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Tıp

Nötrofil hücre dışı tuzakları görselleştirmek için boyama ve görüntüleme

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Yazar Spotlight: İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Görüntüleme 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Çift Boyalı Canlı Hücre Analizi Kullanarak NET Oluşumunun Ölçülmesi

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that neutrophils play in the pathogenesis of cancer, autoimmune diseases, and various acute and chronic inflammatory conditions by contributing to the initiation and perpetuation of immune dysregulation through multiple mechanisms, including the formation of neutrophil extracellular traps (NETs), which are structures crucial in antimicrobial defense. Limitations in techniques to quantify NET formation in an unbiased, reproducible, and efficient way have restricted our ability to further understand the role of neutrophils in health and diseases. We describe an automated, real-time, high-throughput method to quantify neutrophils undergoing NET formation using a live cell imaging platform coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach using two different DNA dyes to image intracellular and extracellular DNA. This methodology is able to help assess neutrophil physiology and test molecules that can target NET formation.

Yazar Spotlight: Çift Renkli Canlı Hücre Görüntüleme Kullanarak Hastalık ve İlaç Taramasında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Ölçülmesi

We present an automated high-throughput method to quantify neutrophil extracellular traps (NETs) utilizing the live cell analysis system, coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği