Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık Grants NS-38.849 ve DK-076.160, Diyabet Komplikasyonları Çalışması Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Merkezi tarafından desteklenen, Nöroloji Araştırma ve Keşif ve The A. Alfred Taubman Tıp Araştırma Enstitüsü Programı Michigan Üniversitesi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü Sağlık Hibe 5P60 DK-20.572 tarafından finanse edilen Michigan Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi, Morfoloji ve Görüntü Analizi Core kullandı. Yazarlar onun değerli tavsiyeler Moleküler Problar / Invitrogen Scott T. Clarke teşekkür çeşitli tıklayın iT kitleri ve reaktiflerin cömert bağış Edu amplifikasyon tekniği ilk gelişimini desteklemek için etiketleme Edu.

1. Nöronların hazırlanması <ol><li> Dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar 24 kuyu kültür plaka steril (otoklavlanmış) 12 mm cam lamelleri yetiştirilmektedir. </li><li> EDU 10 mM stok (DMSO tıklayın-iT edu Mikroplaka Assay Kit) tipik olarak (örneğin 30 10X Edu çözüm (100 mcM) yapmak için kültür ortamı 1:100 seyreltilir ve sonra kültür kuyulara 01:10 seyreltilmiş toplam 300 mcL bir kültür ortamı içine 10X Edu çözüm) mcL. DRG nöronlar 37 10 mcM Edu son bir konsantrasyon ile inkübe ° C ve% 5 CO 2 2-24 saatleri arasında. Süresinin uzunluğu tedaviler mtDNA sentez hızı nasıl etkilediğini bağlıdır. </li><li> 1 aya kadar 4 davlumbaz, DRG nöronlar, oda sıcaklığında 10-15 dakika süreyle% 2 paraformaldehid sabit Her yıkamadan 1X PBS 2-5 dakika içinde iki kez yıkanmış ve taze 1X PBS içinde saklanan ° C </li><li> Lameller ince uçlu forseps ile hazırlanmış bir nemli odasına aktarılır (Corning kontrast siyah papered alt Biyoassay çanak, ışığa duyarlı bileşenleri ve su doymuş Kimwipes ile nemlendirilmelidir korumak için alüminyum folyo ile sarılmış) ve bir Parafilm M kağıda yerleştirilir sağladığı lamel çözümler sınırlandırmak için hidrofobik bir yüzey. Aşağıdaki protokol 28 lamelleri için tasarlanmıştır ve çözümleri 32 lamelleri (% 14 ekstra hacim hakkında) için hazırlanmıştır. Pahalı veya sınırlı bileşenleri ile çözümler 75-80 mcL her lamel kullanılır böylece yapılır. Aksi takdirde, 200-300 mcL Önceki çözümler iyice yıkayın, yıkama ve blok çözümler için kullanılır. </li><li> 1X PBS (200-300 mcL) her lamel yüzeyinde kapsayacak şekilde yeniden uygulayın. Click-iT tahlil ve aşağıda üreticinin talimatlarına açıklanan tyramide sinyal amplifikasyon kitleri hazırlayın. </li></ol> -IT Edu Mikroplaka Testi Seti Hazırlanması Click-iT Edu Mikroplaka Assay Kit bileşenleri gelen önceden yapılmış ve 4 saklanır ° C [tıklayın 2x-iT Reaksiyon Tamponu (10x Bileşen E), CuSO4 (100 mM, Bileşen F), Click-iT Edu fiksatif ( Bileşen D) ve Engelleme Buffer (2x Bileşen H)]. Zaman içinde sarı-kahverengi dönmesini önlemek için tıklayın-iT Edu Tampon Katkı (10x Bileşen G) -20 ° C&#39;de saklanır. Bu bileşen, tekrarlanan donma-çözülme döngüleri göz yumuyor. Oregon Yeşil 488 azid (B Bileşeni), küçük alikotları (10-20 mcL), donma-çözülme çevrimleri en aza indirmek için bölünmüş ve -20 ° C&#39;de saklanan olmalıdır Anti-Oregon Green HRP konjuge (Bileşen) stok solüsyonu hazırlamak için, flakon Milli Q dH 2 O 75 mcL ekleyin. Köpük önlemek ve 4 mağaza ° C&#39;ye kadar nazik pipetleme veya tersine çevirerek karıştırın Girdap değil. TSA Seti Hazırlanması HRP keçi anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488 Tyramide Kiti ile # 12, Tyramide stok solüsyonu hazırlamak için, DMSO (Komponent B) 150 mcL (Alexa Fluor 488 tyramide, Komponent A) katı madde çözülür. Flakonun tarafı çözmek için herhangi bir tyramide kaplama flakon birkaç kez ters çevirin. ≤ -20 küçük alikotları Mağaza stok solüsyonu (10-20 mcL) ° C, kurutulmuş ve ışıktan korunmalıdır. 2. Click-5-ethynyl-2-dezoksiuridin (EDU) Etiketleme NOT: Tüm çözümler olmadan sıvı kaybetme hücreleri hafifçe kaldırmak için sonuna kadar yapıştırılmış 200 mcL ucu ile bir ampul transfer pipet yardımıyla kaldırılır. , Genellikle çok güçlü bir şekilde çözümler kaldırmak bir vakum hattı, kullanmaktan kaçının. Bir ampul pipet yavaşça önceki çözüm iyice yıkayın, yıkama çözümleri 200-300 mcL ile lamelleri sel kullanılır. <ol><li> Hücreler% 0.1 &#39;lik bir kapalı nemli odasında oda sıcaklığında 10 dakika için 1X PBS çözüm Triton X-100 ile permeabilize. % 1 Triton X-100 stok solüsyonları kullanın. <ul><li> 2700μL 1X PBS Triton-X-100 stok 300 mcL% 1 ekleyerek% 0.1 Triton X-100 3000 mcL olun. </li><li> Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın. </li></ul></li><li> Triton X-100 çözümü çıkarın ve 1X PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Endojen peroksidaz aktivitesi% 1 H 2 O 2 oda sıcaklığında 30 dakika için 1X PBS çözüm söndürülür. 1X PBS ile% 30 H 2 O 2 çözeltinin. Bu çözüm, taze yapılmalıdır ancak yukarıdaki 10 dakika permeabilization adım (adım 3.1) sırasında yapılabilir. <ul><li> 2900 mcL 1X PBS 100 mcL% 30 H 2 O 2 ekleyerek% 1 H 2 O 2 3000 mcL olun. </li><li> Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın. </li><li> Peroksidaz çözümü çıkarın ve 1X PBS ile iki kez yıkayın. </li></ul></li><li> Click-iT Edu Reaksiyon <ul><li> 32 lamelleri (32 x 80 mcL =2560 mcL) toplam 2560 mcL bir ihtiyaç vardır. 2x tepki, reaksiyon toplam hacminin yarısı 1280 mcL yapılır. </li><li> Taze 5 dakika sonrası düzeltme (Adım 3.5) başlamadan önce Click-iT Reaksiyon Kokteyl hazırlamak. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme kokteyl karıştırın. Bu reaksiyon verirken vorteks etmeyin. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x Reaksiyon Kokteyl Bileşenler tıklayın iT Edu Mikroplaka Assay Kit </td><td> Yarım Cilt: 1280 mcL </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 mcL </td></tr><tr><td> 2x tıklayın iT Reaksiyon Tamponu (10x Bileşen D) </td><td> 100,3 mcL </td></tr><tr><td> Click-iT Edu Tampon Katkı (10x Bileşen G) </td><td> 25.6 mcL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mM, Bileşen F) </td><td> 25.6 mcL </td></tr><tr><td> Oregon Yeşil Azid (A Bileşeni) </td><td> 6.4 mcL </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 1290,7 mcL </td></tr></tbody></table> NOT: Yukarıda kullanılan birimleri tıklayın-iT Edu Mikroplaka Assay kiti yönde listelenen hacimleri ile doğru orantılıdır. Reaksiyon Kokteyli son hacmi 1280 mcL biraz daha. </li><li> 2X tıklayın-iT reaksiyon tıklayın iT eşit hacmi Edu fiksatif (Bileşen D) kullanmadan önce seyreltilir. Karıştırma bu arada tüm lamelleri için tek tip bir reaksiyon çözüm haline getirir. </li><li> 1290,7 mcL tepki kokteyl 1290,7 mcL tıklayın iT Edu fiksatif (Bileşen D) ekleyin. Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın. </li></ul></li><li> -IT oda sıcaklığında 5 dakika Edu fiksatif (Bileşen D) ile nöronların post-düzeltin. </li><li> Kaldır düzeltmek ve (adım 3.4) Yukarıdaki reaksiyon kokteyl eklemek. Işıktan korumak ve oda sıcaklığında 25 dakika inkübe örtün. Reaksiyon Kokteyl yavaşça çıkarın. Seyreltilmiş 1X Engelleme Buffer (2X Bileşen H) ile iki kez yıkayın. <ul><li> 2600 mcL Engelleme Buffer (2x Bileşen H) MilliQ d H 2 O (2600 mcL) eşit hacmi ile seyreltilmesi ile 1X Engelleme Tampon 5200 mcL olun. Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın. </li></ul></li><li> Epi-floresan mikroskop altında, mitotik aktif kontrol hücrelerinin çekirdekleri Oregon Yeşil boyama kontrol edin. </li></ol> 3. Edu Sinyal Tyramide Sinyal Amplifikasyon (TSA) <ol><li> Her lamel,% 1 TSA blok çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. <ul><li> TSA Engelleme Reaktif (TSA kit # 12, Bileşen D) 0.06 g ağırlığında ve 6000 mcL 1X PBS ekleyerek% 1 TSA blok çözüm 6000 mcL olun. Karıştırmak için Vortex. % 5 keçi serumu% 1 TSA blok çözüm eklenmesi genellikle non-spesifik bağlama azaltmaya yardımcı olacaktır. </li></ul></li><li> Kısaca anti-Oregon Yeşil horseradish peroksidaz konjuge antikor stok (Bileşen tıklayın-iT Edu Mikroplaka Testi), TSA önceden hazırlanan 2-24 saat dönerler. % 1 TSA engelleme çözümü birincil antikor 1:300 seyreltilir ve ters ya da karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetle. HRP-konjuge antikor bozmamak için vorteks etmeyin. % 1 TSA blok çözüm çıkarın her lamel 75 mcL ekleyin ve 4 gece inkübe ° C <ul><li> Antikor örneğin 1:150 olarak daha yoğun olabilir, ancak sınırlı miktarda verilir, bu yüzden idareli kullanmak. Yine,% 5 keçi serumu% 1 TSA blok çözüm ek genellikle anti-Oregon Yeşil horseradish peroksidaz konjuge antikor non-spesifik bağlanma azaltmaya yardımcı olacaktır. </li><li> 1:300 antikor çözüm stok Tavşan, anti-Oregon Yeşil-HRP (8.53 mcL ekleyerek 2560 mcL olun tıklayın-iT 2560 mcL% 1 TSA Engelleme Edu Mikroplaka Testi). Nazik pipetleme veya tersine çevirerek karıştırın. </li></ul></li><li> Ertesi gün, antikor çözüm kaldırmak ve 1X PBS ile üç kez yıkayın. Lamelleri için son yıkama bağlanmamış primer antikor kaldırılmış olduğundan emin olmak için ek bir oda sıcaklığında 30-60 dakika inkübe edin. </li><li> 2560 mcL (32 lamelleri x 80 mcL) Tyramide reaksiyon hazırlayın. <ul><li> 398 mcL Amplifikasyon Buffer (TSA kiti # 12, Bileşen E)% 30 H 2 O 2 (TSA kiti # 12, Bileşen F) 2 mcL ekleyerek% 0,15 H 2 O 2 çözeltisi (100X) 400 mcL olun . Bu hak etmeden önce gereken yapılmalıdır. </li><li> 2560 mcL son bir birim için bir araya getirir: <ul><li> 25.6 mcL Tyramide-488 (TSA kiti A Bileşeni) </li><li> 2508,8 mcL Amplifikasyon Buffer (TSA kiti Bileşen D) </li><li> 25.6 mcL% 0.15 H 2 O 2 (nihai 0.0015% H 2 O 2 için yukarıdaki) </li><li> 1X PBS ve Tyramide reaksiyonu ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe çıkarın. </li></ul></li></ul></li><li> Tyramide tepki çıkartın ve oda sıcaklığında 30-60 dakika önce olduğu gibi son yıkama kuluçka, 1X PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> MtDNA etiketlenmesi için bir epi-floresan mikroskop altında kontrol edin. <ul><li> Gibi bir antifade montaj orta, cam mikroskop slaytlar Mount lamelleri DAPI Altın uzatır. Alternatif olarak, Edu etiketleme ve amplifikasyon, diğer hücresel belirteçleri etiket standart floresan immünsitokimya tarafından takip edilebilir. </li></ul></li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Mitokondrial DNA replikasyonu Görselleştirme Mitokondrial Biyogenez için Marker Biz duyusal nöronları (Şekil 1) mitokondri sayısını düzenleyen nasıl ilgilendi. Bu protokol, yeni mitokondrinin ölçme bir yolu olarak floresan işaretleyici ile yeni sentezlenmiş mtDNA etiket. Oregon Yeşil-azid ve takip eden yeşil flüoresan bir sinyal (Şekil 2) ile mtDNA etiketleme Alexa Fluor 488 tyramide sonuçları ile amplifikasyon tıklayarak kimya takip sentetik nükleotid Edu dahil. Eğer doğru yapılırsa, güçlendirilmiş yeşil sinyal yeterince eşiğe (hücresel otofloresans veya HRP-TSA reaksiyonun bir yan etkisi olarak) daha yüksektir. Bu teknik, nöron (Şekil 3) sar bölmeleri içinde mtDNA biyogenezi görselleştirmek ve ölçmek için yeni çoğaltılmış mtDNA etiketlemek için tasarlanmıştır. Edu etiketleme nörofilaman (Şekil 3 boyutlu) gibi diğer hücresel belirteçleri etiket sonraki floresan immünsitokimya sağlar. TSA tepki Alexa Fluor 594-tyramide gibi diğer floresan Alexa Fluor tyramides ile de yapılabilir. Bu sonuçlar bir yeşil floresan nükleer sinyal çekirdeğinde Oregon Yeşil-azid tıklama tepki ama, önce TSA belirlenemeyen mtDNA, herhangi bir yeşil sinyal. Alexa Fluor 594-tyramide amplifikasyon nükleer etiket yoğunlaştırır ve bir kırmızı floresan sinyal (Şekil 4) ile mtDNA dahil Edu ortaya koymaktadır. Benzer bir büyütme işlemi, yeni sentezlenmiş mtDNA (Şekil 5) içine BrdU birleştirmek görselleştirmek için kullanılır, ancak, bu yöntem ek bir adım Edu için gerekli değildir ya da sert bir asit (HCl) veya enzim sindirimi, BrdU epitopu kurtarmak için gerekli etiketleme. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Temsilcisi diferansiyel girişim kontrast (DIC) embriyonik bir görüntü (sol) ve yetişkin (sağda) genellikle analizi. Barlar = 10 mm için kullanılan dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Yeşil floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketleme prosedürü temsil eden şematik diyagramı. Şematik bir yeşil floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketlenmesi için üç adımlı bir protokol temsil eder . Mitotik F11 nöroblastoma hücreleri aktif bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve nükleer ve mitokondriyal DNA kurulmuştur Edu etiketleme desen göstermektedir. Ilk adım (P1), Edu varlığı hücrelerin kuluçka, yeni sentezlenmiş mtDNA bir timidin analog dahil etmektir. İkinci adım (P2), Oregon Yeşil-azid dahil Edu etiketlemek için tıklayın kimya dayanmaktadır. Yeşil sinyal nükleer DNA çoğaltılan hücrelerin çekirdekleri görünür. Oregon Gr yükseltmek için son adım (P3)Oregon Yeşil karşı HRP-konjuge tavşan antikoru ile inkübe een azid sinyal Alexa Fluor mtDNA yeşil sinyal görselleştirmek için hidrojen peroksit varlığında 488 etiketli tyramide (H 2 O 2) ile inkübasyon izledi. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Dorsal kök ganglion mtDNA Edu etiketleme (DRG) nöronlar. Nöronlar edu ile inkübe edilir ve sinyal daha sonra dahil Edu mtDNA olduğunu ortaya çıkarmak için yükseltilir . Amplifiye Edu (EDU-OG-TSA, yeşil), embriyonik (A) ve yetişkin (BD) DRG nöronlar hem yeni sentezlenmiş mtDNA içine yeşil noktalı sinyalleri gösteren iletilen ışık kaplamış Temsilcisi floresan görüntüler. Edu etiketleme prosedürü nörofilaman (D, αNF, kırmızı) gibi nöronal belirteçlerin sonraki immünofloresan boyama sağlar. Ölçek bar = 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Kırmızı floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketleme prosedürü temsil eden şematik diyagramı. Şematik kırmızı floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketlenmesi için üç adımlı bir protokol temsil eder . Mitotik F11 nöroblastoma hücreleri aktif bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve nükleer ve mitokondriyal DNA kurulmuştur Edu etiketleme desen göstermektedir. Ilk adım (P1), Edu varlığı hücrelerin kuluçka, yeni sentezlenmiş mtDNA bir timidin analog dahil etmektir. İkinci adım (P2), Oregon Yeşil-azid dahil Edu etiketlemek için tıklayın kimya dayanmaktadır. Yeşil sinyal nükleer DNA çoğaltılan hücrelerin çekirdekleri görünür. Oregon Yeşil karşı HRP-konjuge tavşan antikoru ile inkübe Oregon Yeşil-azid sinyali yükseltmek için son adım (P3) Alexa Fluor görselleştirmek için hidrojen peroksit varlığında 594 etiketli tyramide (H 2 O 2) ile kuluçka mtDNA kırmızı sinyal. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. BrdU etiketleme ve mtDNA yeşil veya kırmızı floresan sinyal tyramide sinyal amplifikasyon. Şematik diyagramı ya da yeşil ya da kırmızı floresan sinyali ile yeni sentezlenmiş mtDNA BrdU etiketleme prosedürü temsil eder. Edu etiketleme için gerekli değildir ya da asit (HCl) veya enzim sindirimi, BrdU epitopu kurtarmak için bir ilk adım gereklidir. Bir sonraki adım, bir fare primer anti-BrdU antikor ile inkübe. Bu horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge keçi anti-fare antikor ile inkübe tarafından takip edilmektedir. Son olarak, sinyal mtDNA sinyal görselleştirmek için hidrojen peroksit varlığında bir yeşil ya da kırmızı floresan etiketli tyramide (H 2 O 2) ile yükseltilir .

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

Biz duyarlı bir tahlil Edu bir tyramide sinyal amplifikasyon kullanarak tek tek hücreleri yeni sentezlenmiş mtDNA etiket geliştirdi. Bu protokolün optimizasyonu sırasında en büyük sorunlarından biri lamelleri arasındaki tutarsız sonuçlar oldu. Değişiklikler bireysel lamelleri küçük birimler karıştırma ve ana çözümleri tüm lamelleri için kullanılacak önlemek için Invitrogen kiti protokolleri yapılmıştır. 75-80 mcL her 12 mm yuvarlak cam lamel için kullanılan örnekleri arasında tutarlı sonuçlar vermek için yeterli bir çözüm sağlarken tamamen yüzey alanı kapsayacak şekilde ideal bir hacim. Kuluçka süreleri ve reaktif konsantrasyonları optimize edilmiştir, ancak gelişmeler onlara ayarlamaları ile görülebilir. Protokol, her süreç bir kez çalıştırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bazı adımları, ilk denemeden sonra başarısız örnekleri kurtarmak için yeni çözümler ile tekrar edilmiştir. Özellikle, Edu tıklama reaksiyon adımları (3.4-3.6) eşiğe önemli bir artış olmadan tekrar edilmiştir. Anti-Oregon Yeşil-HRP antikor inkübasyon (4,1-4,3) ve tyramide amplifikasyon (4,4-4,5) adımları tekrar, ama daha çok zayıf bir sinyal gürültü oranı nedeniyle artan eşiğe sonuçları. Edilmiştir En hassas reaktifler tıklayın-iT Edu Mikroplaka Assay kiti tıklayın-iT Edu Tampon Katkı (Bileşen G) ve tavşan anti-Oregon Yeşil-HRP antikor (Bileşen). 4 ° C ve 6-12 ay arasında oldukça koyulaştırır saklandığında tıklayın-iT Edu Tampon Katkı zamanla sarıya döner. -20 ° Click-iT Edu Tampon Katkı Depolama C bu sorunu hafifletmek olacak. Etiketleme ve tyramide amplifikasyon adımları tavşan anti-Oregon Yeşil-HRP antikor MilliQ dH 2 O yeniden oluşturmak 4-6 ay içinde kullanıldığı zaman en iyi çalışmalarınızı MtDNA içinde Edu hafif etiketleme ile doğrudan karşılaştırmalar için ek hücre işaretleyicileri 9-11 sağlar ve sert bir tedavi kurtarmak için gerekli 5-bromo-2-dezoksiuridin (BrdU), gibi diğer timidin analogları üzerinde bu tekniğin yardımcı artırır DNA&#39;da epitop. Laboratuvarımız 11-12 ve diğerleri 13-15 mtDNA etiket BrdU başarıyla kullanmıştır. BrdU etiketleme tekniği, Edu için kullanılan bir benzer fakat bazı önemli farklılıklar vardır (Şekil 5). Yukarıda listelenen permeabilization adım (3,1-3,2) sonra, BrdU epitopu denatürasyon bir adım geri (37 30 dakika için 2 N HCl ° C 1X PBS içinde üç yıkar). BrdU sonra BrdU karşı primer antikor ile etiketlenir (Vektör Laboratuvarları TSA kiti% 1 engelleme çözüm 01:50 seyreltilmiş ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe). İkincil antikor adım önce BrdU sinyali (keçi anti-fare IgG% 1 engelleme çözüm 1:100 sulandırılmış TSA kitleri # 2 ve # 5, HRP konjuge ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe) yükseltmek için gerekli olan TSA adımları (yukarıda 4,3-4,5). Iki timidin analogları, Edu ve BrdU, etiket mtDNA mtDNA sırayla darbe etiketleme paradigmalar 11 etiketli olabilir çift etiket deneyler için avantajlı. Laboratuvarımız, diyabetik nöropati, diyabetin sık rastlanan bir komplikasyonudur bağlamında mitokondriyal biyotekvinin düzenlemeyi incelemek için Edu ve mtDNA BrdU etiketleme kullanıyor. Biz başarıyla bireysel nöronlar 11-12 mtDNA biyogenezi değişiklikleri ölçmek için sinyal amplifikasyonu kullandık. Bu teknik diğer deneylerde mtDNA çoğaltma ve ciro veya mtDNA sentezini inhibe eden ilaçların belirlenmesi için mekanizmalarını keşfetmek için tasarlanmış yararlı olacaktır. Buna ek olarak, yükseltme Edu ve BrdU sinyalleri temel ilkelerini diğer çalışmalar uygulanabilir önlem DNA replikasyonu veya onarım.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Mitokondri, hücresel enerji ve mitokondriyal biyogenezi temel düzenleyiciler 1-3 sağlıklı hücrelerde mitokondri sayıları düzenleyen önemli bir bileşenidir . Mitokondriyal biyogenezi izlenmesi için bir yaklaşım, mitokondriyal DNA (mtDNA) çoğaltma 4 hızını ölçmek için . Biz tek tek hücrelerin içinde yeni sentezlenmiş mtDNA mtDNA biyogenezi çalışmak üzere etiketlemek için hassas bir teknik geliştirdi. Tekniği, nöronların hücre içi bölmeleri içinde mtDNA çoğaltma tyramide görselleştirmek için bir sinyal amplifikasyon (TSA) 8 protokol ile 5-7, 5-ethynyl-2&#39;-dezoksiuridin (EDU) ile birleşmesiyle bir araya getiriyor. 5-7 etiket Edu ilk tıklama reaksiyon BrdU epitopu sergilemek için gerekli olan, sert asit tedavileri veya enzim digests gerektirmez, çünkü Edu 5-bromo-2-dezoksiuridin (BrdU) gibi diğer timidin analogları, üstün . Edu, hafif etiketleme diğer hücre işaretleyicileri 9-10 kuruluşunun doğrudan karşılaştırma sağlar. MtDNA biyogenezi görselleştirmek ve sayısal yeteneği mitokondriyal biyogenezi düzenlemek ve ilaç zehirlenmesi, yaşlanma, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili patogenezinde içgörü sağlayacak mekanizmaları araştırmak için gerekli bir araç sağlar. Bizim teknik duyumsal nöronları gibi diğer hücre türleri için geçerli. MtDNA biyogenezi ölçmek için bu tekniğin kullanımı, her ikisi de normal hücresel fizyoloji yanı sıra engelli hastalık durumlarında anlayışı sürdürmek önemli etkileri vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Biz mtDNA biyogenezi araştırmak için tek tek hücrelerin içinde yeni sentezlenmiş mitokondriyal DNA (mtDNA) etiket hassas bir teknik geliştirdi. Bu teknik, nöronların hücre içi bölmeleri içinde mtDNA çoğaltma görselleştirmek için bir tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) protokolü ile birlikte, Edu ile birleşmesiyle birleştirir.

Edu Sinyal Amplifikasyon Bireysel Hücrelerde Mitokondriyal DNA replikasyonu Görselleştirme

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.9K Görüntüleme.  University of Michigan. Biz mtDNA biyogenezi araştırmak için tek tek hücrelerin içinde yeni sentezlenmiş mitokondriyal DNA (mtDNA) etiket hassas bir teknik geliştirdi. Bu teknik, nöronların hücre içi bölmeleri içinde mtDNA çoğaltma görselleştirmek için bir tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) protokolü ile birlikte, Edu ile birleşmesiyle birleştirir.

Video: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Hayvan İletişim Araştırmaları Otomatik Etkileşimli Video Oynatma

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Nörobilim

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in cytosolic Ca2+ buffering, and the ATP production in mitochondrial can be mediated by intramitochondrial free Ca2+ concentration. Ca2+ retention capacity can be regarded as the capability of mitochondria to retain calcium in the mitochondrial matrix. Accumulated intracellular Ca2+ leads to the permeability of the inner mitochondrial membrane, termed the opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which leads to the leakage of molecules with a molecular weight less than 1.5 kDa. Ca2+-triggered mitochondria swelling is used to indicate the mPTP opening. Here, we describe two assays to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+-triggered mitochondrial swelling in isolated mitochondria. After certain amounts of Ca2+ are added, all steps can be completed in one day and recorded by a microplate reader. Thus, these two simple and effective assays can be adopted to assess the Ca2+-related mitochondrial functions.

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

This protocol aims to describe a method to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+- triggered mitochondrial swelling of isolated mitochondria of SH-SY5Y cells step-by-step.

Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Edu Sinyal Amplifikasyon Bireysel Hücrelerde Mitokondriyal DNA replikasyonu Görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hayvan İletişim Araştırmaları Otomatik Etkileşimli Video Oynatma

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem

Eşzamanlı

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasitesi tahlil ve Ca^{2 +}-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların