Bu araştırma, hibe sayısı 1-DP2-OD004309-01 ile NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü Programı, Tıbbi Araştırma NIH Yol haritasının parçası kısmen desteklenmiştir. SBS-N. Yüksek Lisans Araştırma Bursu için NSF teşekkür etmek istiyorum.

1. Ön işleme Doku hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Bu protokol kullanmadan önce, biri zaten seçim doku decellularized sahip olmalıdır. Bu örnek için, hipotonik ve hipertonik durular deiyonize (DI) su ve sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanarak taze domuz ve insan perikard örnekleri decellularized. </li><li> Özellikle, ilk 30 dakika için domuz perikard DI suyla yıkayın, daha sonra% 1&#39;lik SDS fosfat sürekli karıştırın salin (PBS), 5 saat DI suyla durulama, 24 saat boyunca tamponlu. Insan pericardia, ilk kez bir gecede DI durulama ardından, 60-65 saat süreyle PBS içinde% 1 SDS sürekli karıştırın, sonra 30 dakika boyunca DI suyla durulayın. Nihai çözüm tüm örnekler çıkarın ve DI su 1 altında tekrar yıkayın. </li><li> Decellularization doğrulamak için, Ekim dondurma orta dondurma taze, küçük bir parça çıkarmak ve 10 mikron doku kesitlerinde boyunca her 100 mikron histolojik analizi ile inceleme için örnek almak, daha önce 34-36 bildirdi. </li><li> Hematoksilen ve eosin (H &amp; E) lekeleri çekirdeğinin olmaması için doku incelemek için kullanın. Bir de H &amp; E sonuçları doğrulamak için DNA&#39;nın bir floresan Hoescht 33.342 leke (1.0 mcg / mL) kullanmak olabilir; kısaca bölümleri düzeltmek rehidrate ve su ile durulayın, 10 dakika boyunca leke, ve sonra iyi durulayın ve karanlıkta saklayın. Alternatif olarak, bir örnek toplam DNA içeriği ölçmek için tasarlanmış olan Qiagen DNeasy Kan ve Doku kiti, kit gibi kullanabilirsiniz. </li></ol> 2. Enjektabl ECM hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Liyofilizasyon <ol class="lroman"><li> Uygun ön hazırlıktan sonra, sıvı nitrojen ya da -80 ° C&#39;de saklayarak decellularized örnekleri dondurma Tamamen kuruyana kadar örnekleri Lyophilize. Sistemi ve su içeriği örneklerinin bağlı olarak, bu yerden 12 ila 72 saat arasında sürebilir. </li></ol></li><li> Frezeleme <ol class="lroman"><li> Bir kere tamamen kuru bir Wiley Mini Mill ince bir toz haline kuru ECM öğütmek için kullanılır. Amaçlarınız için uygun elek boyutunu seçin, burada, 40 gauge örgü kullanılır. Örnek çoğunluğu filtre aracılığıyla geldi sonra, öğütülmüş ECM toz toplama kavanozu çıkarmak. Sadece küçük bir örnek varsa, numunenin geri kalanı çeşitli şekillerde değirmen ayıklanır; burada, bir Q-tip değirmen sabit bıçakları arkasına takılıp ECM kaldırmak için kullanılır. </li><li> Her zaman değirmen temiz ve enkaz serbest olduğundan emin olun. Değirmen ve örnek tamamen kuru olduğundan emin olmak için de önemlidir; Kalan nemi başarılı freze önlemede bir araya gelme agrega ve ECM neden olacaktır. ECM havadaki nem pick up ve değirmen lyophilizer doğrudan gitmek gerekir. </li></ol></li><li> Sindirim <ol class="lroman"><li> Enjektabl ECM oluşturmak için, toz pepsin sindirilir. Aşağıdaki protokol ve ark, Freyetes güncellenmiştir. (2). </li><li> In vivo olarak enjekte edilir ve kirlenme komplikasyonlara neden olabilir, mümkün olduğu kadar steril bir ürün olarak korumak için önemlidir. Bu nedenle, steril flakon kullanımı ve kaşık tartmak ve kullanmadan önce tüm çözümleri filtre. Freze sonra ve sindirim önce liyofilizasyon adım da kısırlık korumaya yardımcı olacaktır. </li><li> ECM tozu istenilen miktarda, uygun bir sintilasyon şişenin içine tartılır. Daha küçük toplam hacim 1 ml, 2 ml flakon kullanımı önerilir ve daha büyük miktarlar için, 20 ml flakon Bu, etkili bir şekilde karıştırmak için flakonun alt yeterince sıvı olduğunu sağlar. </li><li> Pepsin istenilen miktarda bir parıldamanın şişenin içine tartılır. Pepsin 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon olduğu gibi 0.1 M HCl ekleyin. Pepsin çözüm vorteks hızlandırdı olabilir kullanmadan önce pepsin tamamen çözülür (partiküller) emin olun. </li><li> ECM 10 mg / ml konsantrasyonda böylece ECM tozu ile sintilasyon flakon pepsin / HCl çözeltisi ekleyin. </li><li> Ağırlığında bir kaşık veya spatula ile periyodik flakonun tarafı aşağı kazıma, 60-65 saat boyunca sürekli çözüm karıştırın. </li></ol></li><li> pH Ayarı <ol class="lroman"><li> Bu adım, fizyolojik pH sıvı matris malzemesi getirmek ve daha fazla ECM yarma tutarak, pepsin inaktive etmek için yapılır. Yine, Millipore su ile yapılan süzülmüş çözümler kullandığınızdan emin olun. </li><li> 1 M NaOH 1 / 10 orijinal ses eklenir. Bu noktada pH Test ve istenilen pH (7.4) ulaşmış olduğu NaOH veya HCl gibi az miktarda (2-10 ul) ekleyin. Nötralizasyon için eklenen ya da pH testi için çıkarılan tüm küçük miktarlarda takip edin. Sonra çözüm nötralize olmuştur, 10x PBS son hacmi (1 / 9 geçerli ses) 1 / 10 &#39;u ekleyin. Enjektabl ECM konsantrasyonu belirlemek ve daha sonra istenilen son işbirliği ulaşmak için 1x PBS eklemekncentration, burada 6 mg / ml. </li><li> Enjektabl ECM Karakterizasyonu SDS-PAGE Blyscan Kolorimetrik GAG Testi, ve kütle spektroskopisi ile yapılabilir. </li><li> Bu noktada, matris malzemesi in vivo olarak miyokard doku mühendisliği için bir iskele oluşturacak şekilde enjekte edilir. </li></ol></li><li> Biotin-etiketleme <ol class="lroman"><li> ECM enjekte ECM daha kolay görsellik için enjeksiyon önce biotin ile etiketlenmiş olabilir. </li><li> Biotin bir 10mM çözüm hazırlayın ve 0.3mg/mg bir oranında enjektabl ECM ekleyin. ECM enjeksiyon için istenilen konsantrasyonda olmalıdır. 6 mg / ml konsantrasyonda enjekte ise, ECM 1 ml başına 40 mcL Biotin ekleyin. Enjeksiyonu öncesinde, en az 1 saat buz biotin-ECM çözümü tutmak. </li></ol></li><li> Tüm işlem adımları, oda sıcaklığında yapılabilir. Jelleşme enjektabl matris tutmak için, pH ayarı adım, buz üzerinde yapılabilir. </li></ol> 3. Miyokard Enjeksiyonlar <ol class="lalpha"><li> Enjeksiyon hazırlık <ol class="lroman"><li> Burada kullanılan dişi sıçan (225-250 g), pH 7.4 enjektabl ECM 75 mcL enjeksiyonları 0,1 ml şırınga 30 gösterge iğne uçlu olarak hazırlanmıştır. Erkek sıçanlar (375-400 g) kullanılmış olsaydı, 90 mcL enjekte olabilir. </li><li> Tüm cerrahi malzemeleri, cerrahi öncesi sterilize edilmelidir; burada tüm gerekli araçları içeren bir otoklavlanmış cerrahi paketi kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Ameliyat günü, bir Harlan Sprague-Dawley sıçan% 5 izofluran kullanarak anestezi otoskop kullanılarak entübe ve daha sonra işlem boyunca% 2.5 izofluran muhafaza. </li><li> Kuruluk ve saç karşı korumak için suni gözyaşı merhemi hayvanın gözleri ekleyin. Ameliyat sırasında hidrasyon için 3 mL Laktatlı Ringers çözüm yönetme. Bu alt karın bölgesinde subkütan enjeksiyon yoluyla yapılmalıdır. </li><li> Hayvan uzuvları aşağı cerrahi tablo ve hafifçe bant yatar pozisyonda yerleştirin. Karın ve ovma için önce vakum ücretsiz saç saç kaldırmak için kesme makineleri kullanın. </li><li> Zyphoid süreci karnın sağ alt tarafta köşegen boyunca lidokain% 2 küçük enjeksiyonlar (yaklaşık 50 mcL her) bir dizi olun. Sonra ortasında başlayan ve dışa doğru hareket, betadin ile üç kez fırçalayın. % 70 etanol ile tekrarlayın. Kapak önceden yapılmış yuvarlak bir pencere ile bir cerrahi örtü kullanarak hayvan; gerekirse, havlu kelepçeler ile güvenli. </li><li> No 10 neşter xiphoid süreci karnın sağ alt taraftan 3-4 cm&#39;lik kesi yapmak. Xiphoid sürecini bulun ve sağ kas dikey olarak aşağı teşrih, sağda büyük damar önlemek için dikkatli olmak. Kas disseke, diyafram açığa, kas ile yanal kesmek için makas kullanmak. Karaciğer önlemek için dikkatli olun. </li><li> Zyphoid süreci boyunca 3-0 Vicrile sütür 36 inç uzunluğunda ve hemostat bir çift, sürücü bir iğne kullanma ve yarım yoluyla sütür çekin. Teyp dikiş birlikte sona erer ve aslında zyphoid yukarı kaldırarak ve diyafram açığa hayvan üstünde ve arkasında bir noktaya kadar bunu düzeltmek. 3-0 Vicrile dikiş başka bir 36 inç uzunluğu ile, bir iğne xiphoid süreci yakın kas sürücü ve, yine, tam cerrahi kavite açıklamanızı, cerrahi tablonun sağ başka bir noktaya sonlarına doğru çekin ve düzeltmek. </li><li> Bu noktada, diyafram ile kalp görmek gerekir. Küçük bir sıçan diş microforceps çifti, diyafram merkezi kapmak, kendinize doğru çekin ve künt makas ile çok küçük bir kesi yapmak. Akciğerlere alay önlemek için çok künt makas kullanmak son derece önemlidir. Bu delik yapıldıktan sonra, akciğerler, kalp görselleştirmek için diyafram üzerinden dikey 2-3 cm&#39;lik bir kesi yapmak için izin, geri çekilecektir. </li><li> Boşluğunun sol yol akciğerlerden dışarı itmek için bir 3-inç S-ucu yerleştirin. Q-ucu yerinde sabitlemek için havlu kelepçe kullanın. Perikardiyal kese bulmak için yolun sağ akciğer dışarı taşımak için başka bir Q-tip kullanın. Microforceps bir çift ve bir çift büyük dişli forseps kullanarak, kalp apeksi açığa perikardiyal kese ile gözyaşı. Hayvanın daha önce enfarktüs prosedürüne tabi varsa, perikard zaten yok olacaktır. </li><li> Sıçan diş microforceps kalbin apeks alın ve apeks sıvı matris malzemesi üçüncü bir yol enjekte. Epikardiyal yüzeyine paralel iğne takın ve sol iğne kesik kenar ile enjekte. Büyük kalp damar önlemek için emin olun. Iğne çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin. Enjeksiyon yerinde doku bir beyazlatma göreceksiniz. </li><li> Temizlik boşluğunda kan ve sağ akciğer tutuyordu havlu kelepçe ve Q-tip kaldırmak. Kavisli microhemostats ve sıçan kullanın.diş diyafram kapatmak için microforceps. Bir ilk düğüm yapın ve sonra sürekli bir dikiş ve konik bir iğne ile diyafram kapatmak için tırtıklı forseps ve microhemostats kullanın. Tamamen kapatmadan önce, PE160 emme boru takın ve dikiş sıkılır gibi göğüs boşluğuna tahliye için 10 ml şırınga kullanın. </li><li> Düzgün bir şekilde boşaltıldı ve kapandığı zaman, diyafram iç bükey olmalıdır. Bir konveks diyafram boşluğunda hala hava olduğunu gösterir. </li><li> Bu noktada% 1 izofluran açılabilir. </li><li> Boşluğuna açık tutarak hem 3-0 Vicrile sütür dışarı atın. Q-tip veya steril gazlı bez ile silerek fazla kas hidrat steril su kullanın. Aralıklı sütürler ile kas tabakası kapatmak için yeni bir 3-0 dikiş uzunluğu kullanın. </li><li> Bu noktada, izofluran kapalı olabilir. </li><li> Temizlik steril su ve cilt kapatmak için kullanılması zımba alan. Zımba çalışmaya engel olacak ise, 5-0 prolin dikiş de kullanılabilir. Bu durumda, aralıklı sütürler ile deriye yakın bir ters kesme (RC) iğne kullanınız. Her iki durumda da, kapalı kesi üzerinden cerrahi yapıştırıcı nokta. </li><li> Kesi yeri üçlü bir antibiyotik merhem sürersin bir Q-ucu kullanın. </li><li> % 100 oksijen altında hayvan kurtarmak için izin verin. </li><li> Hayvanlar ventilatör geçici bir nefes almaya başladığında, trakea tüp çıkarın. </li><li> Hayvanlar sternal sonra, 0,05 mg / kg buprenorfin hidroklorür bir subkütan enjeksiyon yönetmek ve steril bir havlu onları evlerine kafesine geri dönmek. </li><li> Hayvanlar, post-operatif gözlem ve bakım almalıdır. </li><li> Ilgi zaman noktalarında, hayvanların ötenazi ve kalpleri analiz için kaldırılmıştır. Kısa eksen kesitleri alınır ve brüt doku analizi için hematoksilen ve eosin (H &amp; E) ile boyandı. Kısa zaman noktalarında, enjekte edilen bölgede interstisyel yayıldı pembe bir fibröz bir ağ olarak görünecektir. Daha sonraki zaman noktalarında, tek bir hücre akını ve 2 ila 3 hafta sonra enjekte edilen matris nihai bir bozulma gözlemlemek olacaktır. ECM enjekte önce biotin ile etiketlenmiş ise, HRP-konjuge streptavidin biotin boyama ile daha doğrudan görüntülenmiştir olabilir. Immünohistokimyasal boyama slaytları burada bir Alexafluor ikincil endotel hücreleri ve fluoresces yeşil ve bir anti-düz kas aktin antikor bağlanır FITC-konjuge isolectin ile birlikte lekeli olan, enjeksiyon bölgesinde belirli hücreleri veya yapıların tanımlamak için kullanılır. kırmızı SMC&#39;lere raporlar antikor. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Bu şekilde hazırlanan matris malzemelerin Önceki karakterizasyonu makromoleküllerin çeşitli tutma gösterdi. Özellikle, birden fazla lifli proteinler ve glikoproteinler kütle spektrometresi (Tablo 1) ile tespit edildi. Bu protokole göre işleme matris malzemeleri makromoleküllerin karmaşık bir dizi içeren artık tespit edilirse, istihdam decellularization protokolü çok sert olabilir. Bir kez tam liyofilize, kurutulmuş perikardiyal ECM, çok sert, buruşuk kağıt gibi görünüyor. Diğer doku tiplerinin fıstık paketleme benziyor. Eğer iyi öğütülmüş, ECM elekten düşmeli ve altındaki kavanoza toplanabilir. ECM, nem örnek bırakılırsa, bir araya gelme ve freze odasında yapışmış olsun. Sindirim sonra, ECM çözümü sütlü bir renk ve görünür partiküller tamamen ücretsiz olmalıdır. Aynı zamanda HCl sadece biraz daha viskoz olacaktır. ECM sindirimi değilse, flakon büyük parçacık hala orada; alternatif olarak, ECM çözümü çökebilir. PH ayarlaması sonra, gözle görülür hiçbir değişiklik çözüm ve ECM hala bulutlu, homojen bir sıvıdır. Jel başlarsa, viskozite artacak ve malzeme bir şırınga içine çekmek için zor ya da imkansız olacaktır. Bu durumda, önceden soğutulmuş çözümleri ile, buz üzerinde pH ayarlaması adım gerçekleştirin. Enjeksiyonları hazırlanmıştır sonra, kullanılıncaya kadar buz üzerinde saklayın. Enjeksiyon başarılı olursa, iğne ucu çevresindeki bölgede beyazlatır ve küçük bir bolus görülebilir. Eğer bu görülmez, enjeksiyon yerine duvara doğru odasına gitmiş olabilir. Enjeksiyonundan sonra hayvan dikilmesi, diyafram dikkatli kapanış en önemli adımdır. Doğru yapılırsa, diyafram, akciğerler karşı sıkı olacak ve içbükey görünecektir. Akciğerler içinde kalan herhangi bir hava varsa, diyaframın konveks kalır, ya da balonları bir alana sahip olacak. Erken bir zaman noktası (4 saat enjeksiyon sonrası 30 dakika) enjeksiyon bölgenin histoloji incelerken, bir yeniden birleştirilen matris malzemesi, enjeksiyon sonrası (Şekil 2) hücrelerinden yoksun bir pembe, lifli alan görmelisiniz . Ağ genellikle interstisyel yayılır ve birçok bölüm boyunca mevcut olabilir. Bir possmatris jel sadece çok küçük bir alanda görmek için ible açıklama enjeksiyon bir kısmı intramural hedef cevapsız ve ya LV odasına enjekte veya enjeksiyon yerini dışarı sızdırılmış. Buna ek olarak, interstisyel yayılması, jelleşme süresi bağlı olarak değişebilir. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) sonuçları. (A) Molekül ağırlığı standart. (B) (C) çözünür insan ve domuz (D) perikardiyal ECM (7 mg / ml) ile karşılaştırıldığında Sıçan kuyruğu Kollajen Tip I (2.5 mg / ml). Kollajen varlığı yanı sıra diğer birçok protein ve perikardiyal matris örnekleri peptidler unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="Tablo 1" /> Tablo 1: ECM bileşenlerini kütle spektroskopisi ile belirlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Miyokard enjeksiyonları in vivo jelleşme. H &amp; E insan (A) ve domuz leke (B) perikardiyal matris enjeksiyonları in vivo 45 dakika sonra jel var. Oklar matris konumu, lekeli açık pembe miyokard daha göstermektedir. Ölçek çubuğu 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Vasküler hücre infiltrasyonu. Enjekte insan (AC) ve iki hafta domuz (DF) matris jeller gemiler için Floresan lekeleri. Endotel hücreleri, düz kas hücrelerinin kırmızı (B, E) etiketli ise, yeşil (A, D) olarak etiketlenir. Birleştirilen görüntülerin gösterildiği gibi C ve F. Ölçek çubuğu 100 mikron. H &amp; E analizi yakındaki bir bölümü tarafından belirlenen matris enjeksiyon alanında, beyaz noktalı çizgiler gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 matris enjeksiyon bölgesi içinde hücreler Kök. Hoescht çekirdekleri leke (mavi) ve c-kit (yeşil), insan ve domuz (A) (B) matris enjeksiyon bölgelerinde kök hücreleri tanımlayan. Ölçek çubuğu 50 mm.

<ol>
	<li>Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+an+injectable+pericardial+matrix+gel:+A+potentially+autologous+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Tissue Engineering. , (2009).</li><li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix.">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).</li><li>Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+decellularization+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+the+porcine+aortic+valve+leaflet.">Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet.</a> Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).</li><li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).</li><li>Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+fibrin+scaffold+improves+cell+transplant+survival,+reduces+infarct+expansion,+and+induces+neovasculature+formation+in+ischemic+myocardium.">Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).</li><li>Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+alone+and+skeletal+myoblasts+in+a+fibrin+scaffold+preserve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).</li><li>Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rodent+model+of+myocardial+infarction+for+testing+the+efficacy+of+cells+and+polymers+for+myocardial+reconstruction.">A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction.</a> Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material.">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li></ol>

Hayvan kullanın: Bu çalışmadaki tüm deneyler, California Üniversitesi, San Diego ve Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından yayımlanan kurallarına uygun olarak yapıldı.

Bu yöntem miyokardiyal doku mühendisliği için biyolojik olarak türetilmiş, enjektabl iskeleleri üretimi sağlar. Bu yöntemlerin ilk imalatı için geliştirilmiştir ve miyokard matris perikardiyal matris jel ile burada sunulan jel ve in vivo testler, bu protokolü, herhangi bir doku ile kullanım için adapte edilebilir olmasına rağmen, dokuya uygun decellularized olabilir. Decellularization yapılır ve matris jel DNA varlığı istenmeyen bir immün yanıt neden olabilir, bu yöntemlerin kullanılması için önce doğrulanmış olmalıdır. Malzeme decellularize çeşitli şekillerde ve çok iyi eleştiriler söz konusu 3, 4 yazılmıştır. Bir matris jel hazırlanırken, kalan herhangi bir nem freze önleyecek şekilde örnek tamamen liyofilize olduğunu esastır. Ayrıca, freze, ECM tozu solumaktan kaçınmak için, her zaman maske takınız. Son olarak, matris jel In vivo bir çalışmada amaçlanan, enfeksiyona neden olabilecek kontaminasyon riskini azaltmak için mümkün olduğu kadar steril bir şekilde hazırlanması gerçekleştirilen olması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Eğer farklı bir doku tipi için bu protokol değiştirerek, bazı parametreler optimize edilmesi gerekecektir. Örneğin, bir ECM konsantrasyonu düşük konsantrasyonlarda bile, jel ve bazı olabilir jel oluşturmak için bazı dokularda yüksek konsantrasyon gerektiren değişebilir. Ayrıca, kullanılan pepsin gücünü önemli ölçüde farklı olması durumunda gerekli sindirim süresi ve pepsin konsantrasyonu değişebilir. Bu protokol açıklanan küçük hayvan cerrahisi modeli herhangi bir yerinde jelleşme malzeme LV serbest duvar içine enjeksiyon için kullanılabilir. Kalp hücre tabanlı doku mühendisliği tedavileri incelemek için, bu protokol hücreleri ve biyolojik olarak türetilmiş bu jeller bir kombinasyon enjekte etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntemler hazırlanması ve miyokard doku mühendisliği için biyolojik olarak türetilmiş jeller in vivo karakterizasyonu esnek bir çerçeve sağlar .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pepsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>p6887-1G</td>
<td>Lyophilized </td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>21217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutravidin-HRP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>21130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equipment: </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiley Mini Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>3383L10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Labconco Lyophilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco, Inc</td>
<td>7670520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products, L.P.</td>
<td>67618-154-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lactated Ringers Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>003966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KY Jelly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>28658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lidocaine, 2%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>17767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd.</td>
<td>12496-0757-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Artificial tear ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>NC9860843</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triple antibiotic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19082795</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>60307-120-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Otoscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>008699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stop cock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>006245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-0 Vicrile suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>J327H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 Proline suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>s-1173</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reverse cutting (RC) needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8684G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microhemostats </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>13013-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat tooth microforceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11084-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>No. 10 scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10110-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blunt scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14108-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp, curved scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large, serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>1106-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE160 suction tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427430 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clippers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>21608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin staples/stapler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>PRR35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>General supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stir plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 M HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 M NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10x PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1x PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 mL syringes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Q-tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical drape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Towel clamps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small hand-held vacuum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of biologically derived injectable materials for myocardial tissue engineering

Bu protokol, miyokard doku mühendisliği uygulamaları için bir enjektabl ekstrasellüler matriks (ECM) jel hazırlanması için yöntemler sağlar. Kısaca, decellularized doku, liyofilize öğütülmüş, enzimatik sindirilir ve sonra fizyolojik pH getirdi. Liyofilizasyon küçük bir değirmen ile ince bir toz haline zemin kuru ECM sonuçlanan doku tüm su içeriği kaldırır. Freze sonra, ECM tozu enjektabl bir matris pepsin ile sindirilir. PH 7.4 düzeltmeler yapıldıktan sonra, sıvı matris malzemesi miyokard içine enjekte edilebilir. Önceki karakterizasyonu testlerinin sonuçları decellularized perikardiyal ve miyokardiyal doku üretilen matris jeller, çeşitli proteinler, peptidler ve glikozaminoglikanlar dahil olmak üzere, yerli ECM bileşenleri, korumak olduğunu göstermiştir. Doku mühendisliği için bu malzemenin kullanımı göz önüne alındığında, in vivo karakterizasyonu, özellikle yararlıdır; burada, sol ventrikül içine intramural bir enjeksiyon yapmak için bir yöntem (LV) serbest duvarında matris jel konak cevabı analiz aracı olarak sunulmuştur küçük bir hayvan modeli. Diyafram göğüs boşluğuna erişim yoluyla kazanılan ve enjeksiyon, hafif sol ventrikül serbest duvarında apeks yukarıda yapılır. Biyolojik olarak elde edilen iskele, enjeksiyondan önce biotin etiketleme görüntülenebilmekte ve sonra bir at turp peroksidaz-konjuge neutravidin diaminobenzidin (DAB) boyama ile boyama ve doku kesitlerinde görselleştirme. Histolojik ve immünohistokimyasal boyama ile enjeksiyon bölgesi analizi de yapılabilir. Bu şekilde, daha önce incelenmiş perikardiyal ve miyokardiyal matris jeller, lifli, gözenekli ağlar formu damar oluşumu ve enjeksiyon bölgesi içinde teşvik etmek gösterildi.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering at JoVE.com

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Enjektabl bir matris jel decellularized doku hazırlanması ve sıçan miyokardın içine enjekte Yöntemleri<em&gt; In vivo</em&gt; Tarif.

Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

fabrication-biologically-derived-injectable-materials-for-myocardial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Enjektabl bir matris jel decellularized doku hazırlanması ve sıçan miyokardın içine enjekte Yöntemleri In vivo Tarif.

Video: Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Biyomühendislik

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cilt Doku Mühendisliği

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biyomedikal Uygulamalar için Mekanik ayarlanabilir ve Biyoaktif Metal iskelelerinin Fabrikasyon

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Ters Kolloidal Kristal Poli (etilen glikol) İskele imalatı: Karaciğer Doku Mühendisliği için Üç boyutlu Hücre Kültürü Platformu

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...