Yazarlar, işbirliği ve lojistik destek için, Analitik Kimya, Roma Üniversitesi &quot;Tor Vergata&quot; laboratuvar Nancy Downer ve tüm üyelere teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, AB projesi &quot;BioCop&quot; tarafından desteklendi.

1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk: Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin: <ol><li> 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak; </li><li> (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize </li><li> Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul; </li><li> Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt 1 ml ekleyin; </li><li> Dönen örnek karıştırıcı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe manyetik boncuk edelim; </li><li> Çözümü engelleme kaldır: 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp bunu dikkatle boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle; </li><li> PBS + NaN 3 + BSA her tüp için depolama çözümü olarak 1 ml ekleyin; </li><li> 4 kaplı ve bloke manyetik boncuk Mağaza ° C (kaplı manyetik boncuk 4 ° C &#39;de en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın); </li></ol> 2) kalibrasyon eğrisi inşaat ve numune analizi için manyetik boncuk İmmünolojik zinciri Ölçümü için hazır manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin: <ol><li> Kaplı ve bloke çözüm, analiz için gidiyoruz her örnek ayıklamak için bir Eppendorf tüp (2 ml) ele alalım; </li><li> Her çalışma kalibrant çözeltisi için ekstra bir Eppendorf tüp; </li><li> Manyetik boncuk, kullanmadan önce dönen bir örnek karıştırıcı 2 dakika süreyle homojenize; </li><li> Manyetik parçacık konsantratör kullanarak depolama sıvı çıkarın; </li><li> PBS / BSA yıkama solüsyonu ile manyetik bilyeler üç kez yıkayın. Sıvı çamaşır çıkarın; </li><li> Rekabet adım: yıkanmış manyetik boncuk, örnek hazırlanmış ayıklamak 200μl içeren her tüp için ekleyin; her bir örnek için bir manyetik boncuk tüp kullanın. Her bir standart çözüm için aynı prosedürü tekrarlayın. Her manyetik boncuk tüp 200 ul monoklonal antikor çözüm ekleyin. Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim; </li><li> Eppendorf tüpleri rekabet adım için kullanılan çözüm çıkarın; </li><li> Adım Etiketleme: Her bir manyetik boncuk Eppendorf tüp etiketli ikincil antikor 400μl ekle . Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim; </li><li> Eppendorf tüpleri çözümü etiketleme çıkarın; </li><li> Manyetik boncuk, PBS / TWEEN ® 20 yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Sıvı çıkarın; </li><li> DEA tampon 100μl manyetik boncuklar her kısım süspanse edin. Şimdi manyetik boncuk elektrokimyasal ölçüm adım için hazır; </li></ol> 3) Meclis Çoklayıcı (Mux) seçenekleri ile PalmSens Lütfen dikkat: substrat hidrolizi enzimatik ürün elektrot yüzeyi fauller, bu nedenle yeni bir elektrot her bir ölçüm için gerekli. <ol><li> PalmSens seri kablo aracılığıyla bir PC dizüstü bağlayın; </li><li> PalmSens CH8 Multiplexer 9-DIN fişini. </li><li> CH8 Multiplexer ile sekiz kanal Mux elektrik kontağı seri kablo bağlayın; </li><li> Sekiz mıknatıs blok yerleştirin elektrot şerit. Mıknatıs her çalışma elektrotları altında her yere dikkat edin (not, her elektrot için tek bir mıknatısın manyetik parçacık aksi çalışma elektrot alana konsantre olmaz şarttır); </li><li> Sekiz kanal Mux elektrik temas elektrotlar şerit takın; </li></ol> DPV ölçümü için uygun kutulara aşağıdaki parametreleri kullanın: E başlar: 0 (V); E sonu: 0.6 (V); D adım: 0.016 (V); E darbe: 0,0339 (V); E Klima: 0 (V); E birikimi: 0 (V); Tarama hızı : 0.1 (V / s); T darbe: 0.06 (lar); T Klima: 0 (lar); birikimi T: 0 (s), T dengeleme: 8 (ler). 4) Enzimatik reaksiyon ve Elektrokimyasal Ölçüm <ol><li> Eppendorf tüp manyetik boncuk iyi dağılmış bir süspansiyon elde etmek için elektrokimyasal ölçüm adım için hazır manyetik boncuk içeren her hafifçe sallayarak homojenize; </li><li> Homojenizasyon sonra hemen her Eppendorf Pipet, ilgili çalışma elektrot yüzeyine manyetik boncuk dağılım 20 ul bir kısım. 20 farklı Eppendorf tüpleri (örneğin sekiz elektrot kullanımı sekiz farklı Eppendorf) alınan manyetik boncuk ul bir şerit kullanımı her elektrot için; </li><li> Ilk elektrot üzerinde 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. 2 dakika geri sayım başlayın. 14 saniye sonra ikinci bir elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Daha fazla 14 saniye sonra, üçüncü elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Aynı zamanda int devamerval son elektrot (: 14 sn aralıklarla substrat her bir kısım düşmesi anlamına gelir) kadar (14 saniye). 14 saniye zaman aralığı potansiyostat ölçüm gerçekleştirmek için gerekli olan süre olarak hesaplanır; nota, her bir sensör 80 ul çözüm, çalışma ve referans elektrot kapsamalıdır. Ayrıca, her bir sensör için çözümler komşu elektrot çözümleri ile temas edilmemelidir. </li><li> 2 dk enzimatik substrat çözeltisi ilk ek geri sayım sonra, elektrokimyasal ölçümü başlatmak; </li><li> Her çözüm için geçerli zirveleri (uA) elde etmek için PalmSens Lite yazılımı kullanın. </li></ol> 5) Hesaplama Bir lojistik 4 parametreleri denklemi kullanarak bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması ve bilinmeyen numuneyi içeren her Eppendorf tüp mililitrede nanogram HT-2/T-2 toksin miktarı toplam konsantrasyonu hesaplamak. Calibrants konsantrasyonu (ng / ml) karşı tepe yüksekliği (uA), deneysel veriler, doğrusal olmayan dört parametreli lojistik Sigma Arsa 8.0 veya kullanarak denklem arsa (1) ((4-PL) kullanarak takılacak Kaleidagraph). Doğrusal olmayan 4-PL modeli genellikle ligand bağlayıcı deneyleri (LBAs) 6 tanımlamak için benimsenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> (1) Sigma Arsa eğrisi uyum programı tarafından verilen a, b, y0 lojistik parametreleri x0 vardır. Seyreltilmiş numune ekstresi çözümü HT-2/T-2 toksin toplam miktarın içeriğini hesaplamak için açiklanabilir formülü kullanın <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> (2) x milliltre ortalama nanogram lojistik 4 parametreleri Denklem (ng / ml) hesaplanan Seyreltilmiş ekstrakt çözüm HT-2/T-2 toksinlerin toplam miktarın kütle konsantrasyonu y uA geçerli değeri bilinmeyen numune için elde edilen Ek 6) Kaplı Manyetik Boncuklar Kaplamalı Manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin: Prosedürü Yıkama <ol><li> Tosylactivated Dynabeads homojenize ® M-280 (stok solüsyonu 2 x 109 boncuk / ml) 1 dakika (köpük kaçının) (lütfen manyetik boncuk konsantrasyon sağlamak için tekrarlanabilirliği her zaman aynı olması gereken sallayarak ve vorteks (maksimum hız) ölçümü); </li><li> Hemen 2 ml Eppendorf tüpe 1 mL pipetle yukarıdaki homojenize boncuk; </li><li> 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp Yeri; </li><li> Dikkatlice boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle; </li><li> Eppendorf tüp manyetik parçacık konsantratör çıkarın ve 1 ml 0,1 M borat tamponu pH 9.5 boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. 2 dakika süreyle, 2 dakika süreyle dönen örnek mikserde yavaşça karıştırın; </li><li> Süpernatantı kapalı Pipet; </li><li> Pipet borat tampon çözelti Eppendorf tüp içine 1 ml. Manyetik boncuk kaplama adım için hazır; </li></ol> Kaplama prosedürü <ol start="8"><li> Inkübe manyetik boncuk ve HT-2-KLH çözümü için; KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok manyetik boncuk, 1 ml çözelti) (375 mg / ml son HT-2-KLH konsantrasyon) ile HT-2 konjuge 600 ml 20h 37 ° C * Örnek mikser dönen yavaş eğim rotasyon; </li><li> Inkübasyon yer süpernatantı kapalı manyetik parçacık konsantratör ve pipet tüp sonra; 1 ml PBS / BSA tampon çözelti ile kaplı boncuklar iki kez yıkayın. Her yıkama arasında PBS / BSA çözüm çıkarın. Tüm yıkama adım 5 dakika boyunca devirli manyetik boncuk ve PBS / BSA yapıldı; </li><li> 1 ml TRIS / BSA tampon çözeltisi kullanılarak manyetik boncuk bir kez yıkayın. TRIS / BSA çözüm çıkarın. 37 az 4 saat süreyle mikser dönen manyetik boncuk ve TRIS / BSA tampon ayarlayarak bu adımı yürütmek ° C; </li><li> Yenilenir 1 ml (4 ° C) PBS / BSA tampon çözelti buzdolabında saklanır kullanarak manyetik boncuk bir kez yıkayın PBS / BSA çözüm çıkarın. Oda sıcaklığında 5min için mikser dönen manyetik boncuk ve PBS / BSA tampon bu adımı yürütmek; </li><li> Adım, tüm yıkama sıvı eklemek kaldırmak ve yıkadıktan sonra 1 ml PBS + NaN 3 + BSA depolama sıvı olarak; </li><li> Kaplı manyetik bilye Mağaza, 4 ° C (kaplı manyetik boncuk 4 en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın ° C); </li></ol> * Bu amaç için güç kaynağı için kablo ekleme sağlayan bir delik ile donatılmış fırında karıştırıcı yerleştirilir. Alternatif olarak, mikser ° C 37 ° mostatlı bir odada yer olabilir 7) Numune hazırlama ve ekstraksiyon 25 g (bebek maması ya da kahvaltılık tahıllar) ince öğütülmüş örnekblender kavanoza ighed ve yüksek-hızlı blender 3 dakika asetonitril / su solüsyonu (86/14) 100 ml ile ekstrakte. 5 dakika için 4000 rpm (3000 gr), 8 ml süpernatant Mycosep sütun ile çekilen ve saflaştırılmış santrifüj sonra, temizlenmiş özü 4 ml azot akışı altında kurutuldu. Kurutulmuş numuneler -30 ° C&#39;de birkaç ay saklanabilir. 8) Örnek sulandırıldıktan Kahvaltılık tahıl ürünleri Sulandırın 40 ml PBS pH 7.4 ile kuru kahvaltı gevreği ekstresi (tahıl bazlı gıda yetişkin tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (200 ng / g) eşit toksin konsantrasyonu ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir. Bebek maması 4 ml PBS ile sulandırın kurutulmuş bebek maması ekstresi (tahıl bazlı gıda bebek tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (20-25 ng / g) eşit toksinlerin bir konsantrasyon ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA&#39;larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda 7 platformlar arasında, günümüzde,. Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur. <p...

Reaktifler <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum dihidrojen fosfat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodyum hidrojen fosfat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 susuz </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (% 99.5) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroksimetil] aminomethane </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (sığır serum albumin) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> TWEEN 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfat disodyum tuzu </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Yağsız süt engelleme çözümü olmayan yağlı süt kuru maddesi </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge: </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH konjugatı HT-2 toksin pozisyon 3 ve 4 serbest OH grupları N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ve aktif HT-2 toksin tarafından aktive edilmiştir CDI yöntemi ile elde edildi protein (KLH) aminogroups ile istikrarlı bir carbammate bağ oluşturmak için tepki sağlar. </td></tr><tr><td> İkincil etiketli antikor atı anti-fare IgG (H + L) ile konjuge Alkalen Fosfataz, konsantrasyonu 1 mg / ml. </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 toksin </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Manyetik boncuk: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Konsantrasyon 2 x 10 9 boncuk / ml. </td></tr></table> Çözümler <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Hazırlık </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 </td><td> 900 ml su, 0.20 g, potasyum klorür, potasyum dihidrojen fosfat 0.20 g, 1.16 g disodyum hidrojen fosfat ve 8.00 g sodyum klorür çözülür </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine tampon, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 </td><td> MgCl 2 susuz ve su ~ 300 ml KCl 7.3.59 g 0.0476g çözülür. Dağılmasından sonra 51 ml (% 99.5), DEA ekleyin. HCl (6 M) ile pH 9,8 &#39;e ayarlayın. 500 ml su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> Borat tamponu, 0.1 M, pH 9.5 </td><td> 3.09 g H 3 BO 3 ~ 300 ml distile su içinde çözülür, NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile 9.5 pH ayarlamak. 500 ml saf su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tampon, 0.2 M, pH 8.5 </td><td> 3.85 g Tris [hidroksimetil] 100 ml su-aminomethane çözülür. NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile pH 8.5 &#39;e ayarlayın. 200 ml su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tamponu + BSA solüsyonu (% 0.1), pH 8.4 </td><td> TRIS tampon pH 8,4 50 ml BSA 0.050 g eritin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> PBS + TWEEN ® 0.05% </td><td> Önceden hazırlanmış PBS, pH 7.4 500 ml 0.250 g TWEEN 20 çözülür </td><td></td></tr><tr><td> PBS + BSA çözüm% 0.1 </td><td> PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA 0.050 g eritin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> PBS + BSA% 0.1 + NaN 3 0.02% </td><td> PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA g 0.050 ve 0.010 NaN 3, eritin . </td><td> Depolama solution </td></tr><tr><td> Enzimatik substrat </td><td> DEA tampon pH 9.8 100 ml, 0.010 g 1-naftil fosfat sodyum tuzu eritin. Sıkı şişeyi alüminyum folyo ile sarın. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> Yağsız süt bloke çözüm </td><td> Sınıf Engelleyicisi Non-Fat Kuru Süt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Blot PBS pH 7.3 200 ml 0,20 g ekleyin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> HT-2 stok solüsyonu </td><td> 10 ml vermek asetonitril, trikotesen HT-2 toksin flakon 10 mg çözülür 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile bir çözüm. </td><td> 30 ml tek kullanımlık alikotları bu çözüm Split ve -30 ° C&#39;den daha az saklayın </td></tr><tr><td> HT-2 standart çözüm Çalışma </td><td> Pipet 20 ml HT-2 toksin stok solüsyonu 2 ml ölçülü balona kalibre ve 10 mg / trikotesenler toksin ml içeren bir HT-2 çözüm elde etmek için asetonitril ile seyreltilmiş. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmalıdır. </td></tr><tr><td> HT-2 Çalışma kalibrant çözümler </td><td> Kalibrant çözeltisi 100 ng / ml hazırlamak için HT-2 standart solüsyonu (10 mg / ml) sulandırınız. Sulandırınız HT-2 kalibrant çözeltisi çalışan 100 ng / ml aşağıdaki konsantrasyonları 0 (boş), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml kalibratörü çözümler çalışmaya hazırlamak için. </td><td> Bu çözümler, kullanım gün taze olarak hazırlanması gerekir. </td></tr><tr><td> HT-2 KLH ile konjuge </td><td> 350 ul tek kullanımlık alikotları KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge Böl. </td><td> -30 ° C&#39;de saklayın alikot </td></tr><tr><td> Spesifik Monoklonal Antikor </td><td> Rekabet adımda kullanmak için PBS monoklonal antikor stok konsantrasyonu (1,383 mg / ml): 1:350 (v v) sulandırınız </td><td> Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. Son bir hacim 3,5 ml PBS 10 ml antikor stok solüsyonu, 17 standartları ve / veya numune analiz etmek yeterli değildir. </td></tr><tr><td> İkincil Etiketli Antikor </td><td> PBS içinde rekabet adımda kullanmak için: Alkalen Fosfataz ile konjuge anti-fare IgG (H + L) 1:100 (v v) seyreltilir. </td><td> Son hacim 10 ml PBS 100 ul antikor stok solüsyonu, 25 standartlara ve / veya numune analiz için yeterli. Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr></table> Cihaz <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens enstrüman </td><td> PalmSens </td><td> Seri kablo bağlantı PC dizüstü bilgisayar ve Mux seçenekleri yazılım PalmSens Lite, ile birlikte verilen </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Sekiz kanal Mux elektrik kontağı </td><td> el yapımı </td><td></td></tr><tr><td> Sekiz serigrafi elektrotlar (SPES) ile sıyırın </td><td> el yapımı </td><td></td></tr><tr><td> Elektrotlar şerit için özel olarak tasarlanmış destek </td><td> el yapımı </td><td> SPE her çalışma elektrot yüzeyinin altında yerleştirilmiş, her biri 8 neodim mıknatıslar </td></tr><tr><td> Kalibreli mikrolitrelik pipetler </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Manyetik karıştırıcı ve heyecan bar. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cam bardak (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volumetrik şişeler (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ve 2 ml Eppendorf tüpleri. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> 5ml, 15ml Falcon ™ tüpleri. </td><td> Şahin </td><td></td></tr><tr><td> Laboratuvar Vorteks Karıştırıcı </td><td></td><td> Proteic parçalarının denatüre önlemek için HT2-KLH ile kaplanmış veya bağlantılı manyetik boncuk immünolojik zinciri ile tekrar süspansiyon vorteks mikser kullanmayın </td></tr><tr><td> Laboratuvar fırın veya mostatlı oda </td><td></td><td> 37 ± 3 ° C lik bir sıcaklık tutmak için bir fırın seçin </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC 1 2 yöntem, gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri 3 ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir. Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı 4 için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet 5 ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar . Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar. Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize. Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K Görüntüleme.  University of Rome, Tor Vergata. Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Video: ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biyoloji

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...