Lens epitel eksplant hazırlanması Dr John McAvoy 9 laboratuvar kökenli yöntemler adapte edilmiştir. Bu çalışma, İntramural Araştırma Programı Z01-EY000238-22 Ulusal Göz Enstitüsü tarafından finanse edilmektedir

Bölüm 1: lenslerin kaldırılması Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Mikro-diseksiyon makas, eğri, künt ipuçları, (böyle as.RS-5983, Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD); mikro diseksiyon cımbız, kavisli ucu (Roboz # RS5137 gibi). </li><li> Süspansiyon orta: Orta 199, 100 ünite sığır serum, albumin / ml penisilin% 0.1, 100μg/ml streptomisin, 2.5 mikrogram / ml Amfoterisin B Reaktifler içeren Invitrogen, Carlsbad, CA mevcuttur. </li></ol> Prosedür: <ol><li> National Institutes of Health, Bethesda, MD tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak yeni doğan ratlarda Euthanize (2-4 gün arası). </li><li> Cerrahi makas ile göz kapaklarını çıkarın. Dışarıya doğru çıkıntı göz zorlamak için göz soket ters tarafta kavisli cımbız ile hafifçe basın. Makas ile gözün arka tarafında küçük bir kesi olun. Kesi karşısında göz kenarına cımbız ile basarak, lens ve bağlı vitreus küçük bir miktar daha sonra objektif kıvrımlı cımbız ile alınır sağlayan, rüptür sonucu zorla olabilir. Bakım lens kapsül kırmak için değil alınmalıdır. </li><li> 5ml sıcak, steril süspansiyon orta içeren bir 60mm plastik doku kültürü çanak lensler aktarmak için kavisli bir cımbız kullanın. </li></ol> Bölüm 2: eksplant Mikrodisseksiyon Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Mikro Diseksiyon cımbız, 0,1 mm ipuçları, (Roboz RS-4976 gibi). Biz çünkü ucu esneklik Dumostar alaşım kullanabilirsiniz, ancak diğer çelik alaşımları de kabul edilir. Bu işlem sırasında mola veya viraj eğilimindedir 0.1mm daha ince ipuçları ile cımbız, tavsiye edilmez. </li><li> Süspansiyon orta (bkz. Bölüm 1) </li><li> Ham F12 orta veya Orta 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Unsupplemented </li></ol> Prosedür: <ol><li> Aşağıdaki adımları steril kesme aletleri ve steril ortamda kullanarak, temiz, taslak ortamda yapılmalıdır. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, 0.1 mm uçlu cımbız ile yapışan herhangi bir doku lenslerinizi temiz ve 5ml steril süspansiyon orta (bu adım kirliliği azaltmak için yardımcı olur) içeren ikinci bir 60mm kültür çanağı aktarabilirsiniz. Cımbız ile istenilen sayıda lens, 35mm kültür çanak 5ml steril, unsupplemented orta içeren bir transfer. (Daha düşük boya konsantrasyonu diseksiyon daha kolay hale getirir, çünkü Biz sık sık, bu adım için Ham F12 (Invitrogen) kullanmak; Ancak, Orta 199 de kabul edilebilir olan bu adımı sırasında yok antibiyotik ya da diğer ekleri ihtiyaç duyulmaktadır..) 12 eksplantlar yapılmış olması. Gibi gibi birçok Bu boyuttaki bir çanak merkezi. Ancak, daha az eksplantlar kesme aletleri küçük bir tabak içinde kolayca manipüle edilebilir, çünkü yapılması bile 35 mm çanak kullanılmalıdır. 37 az bir doku kültürü inkübatör kalan lensler içeren çanak Transfer ° C kadar ihtiyaç vardır. </li><li> Lensin arka tarafında belirleyin. Bunu tanımak için birçok yol vardır: 1) posterior, anterior, daha hafif basık yuvarlak, diseksiyon sırasında oda sıcaklığı gibi serin 2) Yenidoğan sıçan lensler soğuk katarakt formu. Soğuk katarakt lensi tamamen dolu değilse, arka tarafı opak bölgeden uzak tarafı. Opacity çanak 37 ısınma, objektif doldurdu ° C&#39;de birkaç dakika için tersine dönecektir. Arka tarafında soğutma üzerine katarakt reformlar olarak tespit edilebilir. 3) tunika vaskulosa lentis İzleri arka tarafında görülebilir. 4) posterior sütür arka tarafında görülebilir. Kapsül açılacak bu yana doğru arka tarafında belirlenmesi esastır. Ön tarafında Açılış lens epitel gözyaşı. </li><li> Arka tarafında tespit edildikten sonra, yukarı doğru açın ve sol cımbız lensi kavramak (sağ elini kullanan bir işçi için). Sonra küçük bir kıvrım üretmek doğru bir cımbız ile arka kapsül tutam. </li><li> Sağ cımbız ile arka kapsül tutarken, sol cımbız ile kapsül kat kavramak ve kapsül küçük bir gözyaşı yapmak zıt yönlerde iki çift cımbız çekin. </li><li> Cımbız ile geri çekilmeden kapsül kenarından kavrayarak, plastik cımbız ile çanak içine basarak, daha sonra diğer tarafta, bir tarafta ilk aşağı doğru çekin. Kapsül birçok noktada plaka sıkıca bağlı olduğu kadar, bütün lensin ekvator etrafında hareket, bu işlem birkaç kez tekrarlayın. Kapsül sol cımbız ile tutarak yavaşça sağ cımbız ile lens ekvatorda fiber hücreleri ve epitel hücreleri arasındaki eki kırmak için lif kütle kaya. Sonra alt takılı kalır kapsül / epiteli, haddeleme, uzak fiber kitle itinçanak. Çanak tüm lensler ile bu süreç devam etmektedir. Fiber kitleler (veya onlara lens proteinlerinin diğer çalışmalar için bir kaynak olarak dondurulmuş kaydetmek) çıkarın ve atın. </li></ol> Bölüm 3: Mikrodisseksiyon ve kültür merkezi eksplant Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Steril tek kullanımlık bisturi, # 15 bıçak, (Cincinnati Cerrahi Co Cincinnati, OH) </li><li> Kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile steril fosfat tamponlu salin </li><li> Kültür orta: Süspansiyon orta içeren 100ng/ml FGF-2 (Sigma Aldrich, Inc St Louis, MO). </li></ol> Prosedür: <ol><li> Steril bir neşter kullanılarak, sadece (CE) (Şekil merkezi epitel hücrelerinde oluşan merkezi bir meydanı yaklaşık 2.0mm, bir tarafta bırakarak, farklılaşma (Şekil 1A) erken aşamalarında hücreler içeren periferik epitel (PE), uzak trim 1B). </li><li> Bir biyogüvenlik kabine merkezi eksplantlar içeren çanak aktarın. Steril PBS ile bir kez 1ml taze, dengelenmiş (37 ° C,% 5 CO 2) süspansiyon orta kalsiyum ve magnezyum içeren ve 3 kere yıkayın. Bu bulaşma olasılığını büyük ölçüde azaltır yıkar. </li><li> Farklılaşma 1 neden ve 37 nemlendirilmiş, doku kültürü inkübatör eksplantlar kültür ortamı 2mL ekle ° C,% 5 CO 2. Kültür dönemleri birkaç saat gibi kısa ya da çalışılan parametreye bağlı olarak, 2-3 hafta gibi uzun uzatmak. Orta 2-3 günde bir değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Bölüm 4: farklılaşma ile ilişkili olayların analizi için eksplantlar Hasat 1. Protein veya RNA analizi için Hasat eksplantlar Malzemeler: <ol><li> Microdissecting cımbız </li><li> SDS Lizis Tampon veya RNA daha sonra </li></ol> Prosedür: <ol><li> Kuluçka dönemi sonunda, kültür ortamı çıkarın. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak her eksplant kenarlarını hafifçe gevşetin. </li><li> Cımbız ile her eksplant kaldırın ve 100μl SDS lizis tamponu (protein analizi için) veya RNA daha sonra (RNA analizi için) ile ilgili içeren bir tüpe transfer. Eksplant cımbız sadık olmadığından emin olmak için çözüm cımbız ucu çalkalayın. </li></ol> 2. Immünofloresan için Hasat eksplantlar Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Fosfat, kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile tamponlu salin </li><li> Fosfat (Invitrogen, Carlsbad, CA) tamponlu tuz (kalsiyum ve magnezyum olmadan) </li><li> % 4 paraformaldehid (Boston Bioproducts, Worcester, MA) </li><li> Microdissecting cımbız </li><li> Hidrofobik işaretleme kalemi </li><li> Cam mikroskop lamı </li><li> Fosfat% 0.25 &#39;lik Triton X-100 tamponlu salin. </li></ol> Prosedür: <ol><li> PBS, kalsiyum ve magnezyum içeren kısaca eksplantlar durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid ekleyerek doku sabitleyin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve fosfat tuzlu tamponlu ile değiştirin. Sabit eksplantlar onları immün kaldırdı ve cam slaytlar transfer sağlayan, biraz sert olur. </li><li> PBS, doku pozisyonu yardımcı ve kıvrık önlemek için slaytta küçük bir damla (kalsiyum ve magnezyum olmadan) yerleştirin. Microdissecting cımbız kullanarak, eksplant asansör ve slayt açılan takın. Eksplant dokunmadan dikkatlice camına eksplant düzleştirmek için bir kağıt fitil ile sıvı çıkarın ve oda sıcaklığında 3 ila 5 dakika süreyle havada doku kurumaya bırakın. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 A periferik epitel farklılaşması spesifik proteinlerin ifade eder. Mikrodiseksiyon hemen sonra N-kaderin gösterilen eksplant immunohistokimyasal oldu. İfade bu bölgedeki hücrelerin periferik epitel hücreleri çıkarmak için kesilmiş olabilir. B. ayırt başlamış olduğunu gösteren, bir grup çevre epitel hücreleri görülür ifade N-kaderin ve diğer farklılaşma spesifik proteinlerin. Kırmızı annulus hücrelerin yerini açık gri belirtilen küçük kare panel 1A gösterilen epitel kadranda temsil ederken N-kaderin, temsil eder. Periferik epitel ayırt etmek için henüz başlamamış tek hücreleri içeren merkezi bir kare bırakarak dört neşter kesimler tarafından kaldırılabilir.

<ol>
	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

Sıçan lens eksplant sistemi, laboratuvarlar, objektif lifleri 21,3,4,5 lens epitel hücrelerinin terminal farklılaşma çalışma bir dizi başarıyla kullanılır olmuştur. 100ng/ml FGF-2 maruz eksplantlar morfolojisi ve birkaç gün 3,4,5 içinde sırayla görünmesini gen ekspresyon değişiklikleri dakika 6 içinde sinyalizasyon değişiklikler göstermeye başlayacaktır. Bulaşmasını önlemek için bakım alınırsa kültürler 2-3 hafta için geçerli kalır. FGF-2 önce farklılaşma işaretleri ifade herhangi bir hücre 1,5 eklenir az içerdikleri için bu protokolü açıklanan merkezi eksplantlar, farklılaşma ile ilişkili olaylar dizisi çalışmak için özellikle yararlıdır. Bu hücreler daha sonra farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon ve transkripsiyonel olayların zaman seyrini takip etmek mümkün hale, bir kohort olarak, eş zamanlı olarak ayırt. Zaman farklı uzunluklarda kültür eksplantlar böylece sıra olaylar hakkında doğru Temporal bilgiler sağlar. Özel inhibitörleri ilgili sinyalizasyon yolları belirlemek için kültür ortamına ilave edilebilir. SDS jel elektroforezi ve immün eksplantlarındaki protein ekspresyonu analiz ya da RT-PCR ile spesifik mRNA&#39;ların ifade analiz etmek için kullanılıyor olabilir. - 20-50 mikrogram / eksplant ve RNA verim protein verimi aralığı yaklaşık 200 kültür döneminin uzunluğuna bağlı olarak 600 ng / eksplant. Biz genel olarak ortalama 5-6 eksplantlar çanak birkaç deneyleri için yeterli protein veya RNA sağlayacak bulabilirsiniz. Eksplantlar RNA gen ekspresyonu farklılaşması için kritik olabilecek yeni genlerin belirlenmesi mikroarray analizi, değerlendirilmesi için cDNA hazırlamak için kullanılabilir. Eksplantlarındaki da transfekte olabilir. Transfeksiyon verimliliği genellikle düşük olsa da, o muhabir genler assaying 4 için yeterli; 7, 8. Eksplantlar immünofloresan mikroskopi ilgi proteinlerin hücre içi yerinin belirlenmesi için yararlı bir ek biyokimyasal yöntemler sağlar. Böylece, sıçan lens eksplant hazırlanması ve kültür, in vivo teknikleri, transgenik ve knock-out farelerde üretimi gibi tamamlayıcı memeliler terminal objektif farklılaşma çalışmak için güçlü bir sistem sağlar.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

Oküler lensin ön yüzeyinde siliyer cisim altta yatan bir anüler bölgesi prolifere epitel hücreleri, bir tek tabaka ile kaplıdır. Retina difüzyon FGF, onları uzatılmış objektif lens toplu oluşturan lif hücreleri, posterior diziye ayırt etmek için indükler bölümü takiben, bu hücrelerin, posteriora göç. FGF-2 varlığı ön epitel merkezi bölgenin kültür eksplantlar lens liflerinin içine lens epitel hücreleri farklılaşma in vitro olarak uyarılabilir. Eksplantlarındaki neonatal sıçanlarda lensler, gözün lensi çıkarmadan ve lens kapsülünün diseksiyon cımbız ile arka tarafındaki kavrama hazırlanmıştır. Daha sonra arka kapsül hafifçe açık parçalanmış ve plastik bir doku kültürü çanak dibine basılı. Eksplant periferik bölgelerinde bir neşter ile silinir ve daha sonra merkezi bir bölgede, incelenmesi gereken parametreler bağlı olarak 2-3 hafta gibi uzun bir FGF-2 100ng/ml varlığında kültüre. Hafta günlük bir süre içinde yaklaşık senkronize kültürlü eksplantlar epitel hücreleri ayırt bu yana, sinyalizasyon ve gen ekspresyonu zaman ders, moleküler, biyokimyasal ve farmakolojik teknikler kullanılarak tespit edilebilir. İmmünofloresan mikroskopi, bu yöntemlerin güçlü bir yardımcı ilgi proteinlerin hücre içi lokalizasyonu gösterir ve sinyal yolları deneysel manipülasyon fizyolojik sonuçlar ortaya çıkarabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation at JoVE.com

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

FGF-2 varlığı kültüre sıçan lens epitel merkez bölgesi eksplantlarındaki eşzamanlı ayırt. Gibi kültürlerin İmmünofloresan mikroskopi gen ekspresyonu ve terminal farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon olaylar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

12.6K Görüntüleme.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). FGF-2 varlığı kültüre sıçan lens epitel merkez bölgesi eksplantlarındaki eşzamanlı ayırt. Gibi kültürlerin İmmünofloresan mikroskopi gen ekspresyonu ve terminal farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon olaylar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Video: Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Biyoloji

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...