Yazarlar ile ona yardım için bu video makale üreten Dr. Birgit Werner kabul etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF KARİYER Ödülü tarafından finanse edildi.

Bölüm 1: Deneysel Hazırlık At nalı yengeçleri üzerinde yapılan deneysel prosedürleri Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar düzenlenmiş bir ışık-karanlık döngüsüne maruz kalan bir oda Deniz Biyoloji Laboratuarları (Woods Hole, MA) veya başka bir satıcı satın alınan ve gazlı bir tuzlu su tankı ev sahipliği yapmaktadır. Aydınlatma rejimi yengeç sirkadiyen saat sürükleyici ve gündüz ve gece devletler arasındaki günlük göz bisiklet için önemlidir. Iki paslanmaz çelik zehir yerleştirilen vida ve opisthosoma iki hareketi yavaşladı ve daha sonra tahta bir platform sağlanana kadar hemen hiçbir invaziv işlemler başlamadan önce, hayvan, 10-15 dakika süreyle bir buz kovası soğuk. Su lavabolar, böylece platform granit altında ağırlıklı. Terminal deneylerden sonra hayvan yine buz bulamaç içine çeker ve bir neşter ile ağız yukarıda yer alan beyin, pithing tarafından ötenazi. Bölüm 2: Çözümler Limulus Zil Kullanıcı çözümü 430 mm NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM Hepes, ve 10 ml / L Kalem-Strep mix (Penisilin-Streptomisin, 10000 birimleri / ml) oluşur . Bölüm 3: elektroretinogram Kaydı Bu prosedür için gerekli araçlar, tornavida, vazelin, Ringer solüsyonu, bir transfer pipeti yeşil bir LED, bir kayıt odası, paslanmaz çelik vida ve bir pamuklu çubukla. <ol><li> Bir el yapımı oda ERG (Şekil 1A) kaydetmek için kullanılır. Odasına vücut, göz ile temas halinde tuzlu su rezervuar tutmak için tasarlanmıştır. Kapak, bir LED barındıracak büyüklükte bir amplifikatör ve küçük bir delik iletken çözüm bağlamak için gümüş klorür tel içerir. 520Nm çevresinde tepe emisyon LED bir yanabilme Ultraparlak iyi çalışır. </li><li> Başlatmak için, odanın alt vazelin ile kaplı ve iki adet vida ile göz üzerinde güvenli bir. </li><li> Odasına sonra tuzlu su ile doldurulur ve kapak ile kapatılmış. </li><li> Odasına eklenti sonra yengeç, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> LED kablo haznesi kapağının içine eklenir. </li><li> Sinyal kurşun klorür tel kırpılır ve referans kurşun implante vidalar kırpılır. </li><li> Her iki yol açar sinyal amplifikasyonu ve amplifikatör filtresi 10Hz altındaki frekanslarda geçmek için yüksek empedans diferansiyel amplifikatör başkanı evre (X-cell 3x4, FHC Inc.) Bağlanır. </li><li> Amplifikatör çıkışı görüntülemek için bir osiloskop ve bilgisayar analizi ve depolanması için bir veri toplama kuruluna beslenir. </li><li> Kurulumundan sonra kafes kapı, oda ışığında hayvan ulaşmasını engellemek için kapalı. </li><li> Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, LED yanıp söner, uyarılmış ERG sinyal kayıtları, ve tepeden-tepeye tepki genlik önlemler. Flaş paradigmanın seçim deneysel hedef bağlıdır. Örneğin, kısa bir 5V (100ms) darbe, uygulanan her 10 dakikada bir LED ışık uyum etkileri göz hassasiyeti sirkadiyen değişiklikleri izleme önler. </li></ol> Bölüm 4: Optik sinir kayıt Bu işlem için gerekli araçlar, bir tornavida, iplik, trefin, Ringer solüsyonu, rongeurs, vannas makas, bir kayıt odası, kavisli bir forseps, ince iğne probları, sıkıcı bir neşter, cerrahi makas ve bir emme elektrot içerir. <ol><li> Bir el yapımı oda, optik sinir yanıtları (Şekil 1B) kaydetmek için kullanılır. Odasının iç sinir karşılamak ve onu çevreleyen doku izole alt duvarında ince bir yarım daire oluklu açılış 2cm çaplı açık kuyu. </li><li> 16-gauge iğne oda takmadan önce kalbin içine menteşe kaslar arasındaki eklenir ve kan ~ 20cc hayvan boşaltılır. Exsanguination gerekli değil ama optik sinir diseksiyonu kolaylaştırır. </li><li> Optik sinir konumu karapaksta lateral ve median gözler arasında hafif kavisli bir çizgi çizerek tahmin edilmektedir. </li><li> Dairesel bir delik daha sonra bir trefin karapaksta kesilir. Delik de oda olarak aynı çapa. 2-3 cm lateral göz ve sinir iyi ventral kısmı boyunca uzanan hat böylece biraz dorsal anterior deliğin merkezi yer almaktadır. </li><li> Bağ dokusu, sinir tamamen görünür ve çevresindeki doku ve altta yatan ücretsiz kadar temizlenir. </li><li> Thread bir iplikçik sinir çevresinde dolanmıştı ve altındaki yuvası ile odasına çekilir. Bu aynı açıklıktan sinir hafifçe dize çekerek odasına yönlendirilir. Aynı zamanda odanın deliğe sokulur. Odasının karapaksta sonra yapıştırılmıştırvida ve iyi Ringer solüsyonu ile doludur. </li><li> Odasına eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> Kuyu Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc) ve pamuk odasının içine ya da dışına ve tuzlu kan sızıntısını önlemek için alt açılış etrafında doldurulur altında görüntülenmiştir. </li><li> Artık sinir çevresinde bağ dokusu ince makas ve cımbız ile kaldırılır ve oda taze Ringer solüsyonu ile doldurulur. </li><li> Bir nick bu açıklıktan sinir dikkatle, ince makas, cımbız, iğne probları kullanarak uzunluğu boyunca desheathed, sinir kapsüller ve kan damarı yapılır. </li><li> Küçük bir elyaf demeti, afferent lif kayıt için göz uzak sonunda ve efferent lif kayıt için göze yakın sonunda prob ve kesme kullanarak sinir ayrılır. Video afferent lif kayıtları için son kesilir. </li><li> Zil çözümü ile dolu bir microsuction elektrot (AM Sistemleri A.Ş.), optik sinir kayıt için kullanılır. Elektrot ucu 1mm çapında borosilikat cam sonuna kapiller parlatma yangın sinir demetine takılmıştır. </li><li> Elektrot ucu manuel manipülatör (TEFE A.Ş.) ile de odasına indirdi ve kesik elyaf demeti ucu içine çekilir. Emme boru üzerinden elektrot bağlı bir Gilmont şırınga tarafından sağlanmaktadır. </li><li> Bir BNC bağlantısı sinyal yol sağlar ve gürültüyü azaltmak için elektrot sarılı bir gümüş klorür tel referans kurşun sağlar. İki yol açan sinyal amplifikasyon ve gürültü filtreleme (X-cell 3x4, FHC Inc.) Için bir diferansiyel amplifikatör başkanı sahneye bağlanır. Amplifikatör çıkışı bir osiloskop bilgisayar analizi ve depolama için görüntüleme ve veri toplama kartı gönderilir. </li><li> Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Program, bir dijital video işlemcisi ile hafif uyaranlara kontrol (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri A.Ş.) ve başak trenler kayıtları dijital başak discriminator (APM, FHC A.Ş.) arayüzleri. Işık, bir fiber optik ışık borusu yoluyla ya da tüm göz göz, bilgisayar kontrollü bir video ekranı üzerinden tek hücrelere teslim edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: İntraretinal kayıt Bu prosedür için gerekli araçlar, bir tornavida, dişli vida delikleri ile L şeklinde Lucite platformu, bir cam pipet ile mikroelektrot tutucu, paslanmaz çelik vidalar, cımbız, ve ince bir neşter. <ol><li> Lucite, önceden ayarlanmış vida deliklerini bir el yapımı tabak intrasellüler yanıtları kaydetmek için kullanılır. Delikleri motorlu mikromanipülatör (PPM5000, TEFE Inc) montaj için aralıklı. Plaka tarafta iki vida ve üstüne bir hayvan eklenir. </li><li> Plaka eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> Micropositioner gözün üzerine dizilen hareketli kol ile plaka içine vidalanır. </li><li> 1-mm OD borosilikat cam, cam mikropipetler bir parti çekti ve ipuçları 3M KCl çözeltisi küçük bir flakon mikropipetler koyarak kapiller eylem yoluyla yeniden toprakla. </li><li> Pipetler geri kalanı daha sonra elle tuz çözeltisi ile doldurulur ve bir elektrot tutucu içine yerleştirilir. </li><li> Elektrot tutucu micropositioner koluna iliştirilmiş bir hücre içi amplifikatör başkanı evre (IR-283, Cygnus Technology Inc) bağlıdır. </li><li> Retinanın küçük bir bölümü (yaklaşık 1mm2), bir jilet ile kornea arayüzü keserek maruz kalmaktadır. </li><li> Kurumasını önlemek ve mikropipet ucu retina dokusunun içine açıklığından ileri bir damla Ringer çözeltisi maruz retina üzerine yerleştirilir. </li><li> Ucu çözüm girdiğinde, hücre içi amplifikatör mevcut enjeksiyon modu devreye girer ve elektrot empedansı ölçülür. 20-70 MW aralığının dışında empedansı ile mikropipetler atılır. Bu aralıkta olanlar mikron adım ileri, elektronik ya da mekanik pipet titreşimli hücre içine kazığa. </li><li> Üç tip hücrelerin göz karşılaştı olabilir. Retinular hücreleri sadece ışığa karşı bir depolarizan tepki gösterir, eksantrik hücreleri depolarize yanıt sürme aksiyon potansiyelleri bir tren ve pigment hücreleri hiç ışık tepki gösteriyor. </li><li> Veri Labview yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, bir dijital video işlemci (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri) ile hafif uyaranlara kontrol eder. Uyaranlar, bir fiber optik boru veya video gösterimi ile kazığa hücrelerine teslim edilir. Voltaj yanıtları osiloskop gözlenen ve bilgisayar programı tarafından sayısallaştırılmış. </li></ol> Bölüm 6: Temsilci Sonuçlar Bir temsilci ERG Şekil 2A gösterilecek. Dalga özetlenebilir elektrik temsil ederöncelikle photoreceptive retinular hücrelerin ışığa tepki, büyük ölçüde eksantrik hücreleri sayıca daha fazla ve elektrikle akuple. Memeli ERG gibi farklı retinal hücre tipleri birden fazla dalga şekli bileşenleri yoktur. Limulus beyinde bir saat Sirkadiyen geribildirim, günlük bazda retina hücrelerinin zaman içinde değişebilir (1) ERG genlik ve zaman içerisinde neden fizyolojik özellikleri modüle eder. Şekil 2B gösterildiği gibi, ERG genlik öznel gün boyunca hayvan öznel gece ve en düşük sırasında en yüksek olduğu. , Işık tek bir optik sinir lifi yanıtı bir temsilcisi iz Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Eksantrik hücreleri sürekli bir seviyeye bir çürüme tarafından takip başak deşarj oranı geçici bir artış göstererek, kabaca aynı şekilde davranır. Oranı çürüme, ışık uyum ve başak bağımlı self-inhibisyon eksantrik hücreleri (2) birleşik eylem yansıtır. Işık bağımlı oranı azalır gibi diğer başak desen, Limulus beyin görülen ama göz değil (3). Pigment hücresi, retinular hücre ve eksantrik bir hücrenin ışığa gerilim yanıt Temsilcisi izleri Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Sadece son iki retinal hücre tipleri görsel. Tepki genlik ve zaman ders kayıt kalitesi ve elektrot hücre içindeki yerini bağlıdır. Genellikle, elektrot, büyüklüğü ve sayısı nedeniyle pigment hücreleri veya retinular hücreleri nüfuz eder. Ikincisi, sürdürülebilir bir seviyeye çürükleri geçici bir depolarizasyon kaydedilir. Çürüme retinular hücreleri tarafından hafif adaptasyon (2) kaynaklanmaktadır. Elektrot eksantrik hücre girerse, büyük aksiyon potansiyelleri, akson (40-70mV) ve soma (&lt;25mV) yakın bir depolarizan dalga şekli sürme küçük aksiyon potansiyelleri kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 elektroretinogram kayıt (A) ve optik sinir kayıt (B) için kullanılan odaların şematik diyagramları. Bar 7mm eşittir B. A ve 5mm <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Örnek bir 100ms tarafından uyarılmış bir Limulus ERG izleme karanlıkta 5V nabız (A) ve sürekli karanlıkta zamanla ERG genlik tepe tepe dalgalanması (B) LED. Karanlık beyaz üçgen tarafından belirtilen süre başlandı. ERG genlik siyah üçgen tarafından belirtilen zaman içinde büyüme ışık adaptasyon, karanlıkta göz hassasiyetini artırır. ERG genlik siklik değişkenlik bundan sonra hayvanın iç sirkadiyen saat nedeniyle. B Zaman her 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Örnek bir optik sinir lifi yanıt iz, tek bir ommatidial reseptör parladı ışık . Iz üzerinde Waveform uyaran zamanlama gösterir. Aksonlar sinir lifleri doğuran Eksantrik hücreler, tüm aydınlatma koşulları altında deney (toplam karanlıkta 5sn flaş) bu kadar ateş benzer bir model göstermektedir. Retina kodlama ile ani bir özellik Limulus diğer omurgasızlar aksine, memeliler ile ortak. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 gerilim yanıt Örnek izleri Limulus lateral göz bulunan üç hücre tiplerinin ışık: pigment hücresi (A), retinular hücre (B) ve eksantrik hücre (C) . Ilk hücre görsel olmayan. Son iki ışık yanıp üzerine depolarize. Işık transduce ve eksantrik bir hücreye gap junction ile sinyal göndermek için depolarizasyon yol boyunca bazı kaybı, retinular hücreler için büyük. Eksantrik hücre, akson tarafından ateş aksiyon potansiyelleri soma içine başak geri yayılım nedeniyle depolarizasyon sürme görülür. Aksiyon potansiyellerinin genlik depolarizan potansiyeli daha iyi görüntüleme için bu rakam zayıflatılmış olmuştur. Hücrelerin dinlenme potansiyeli-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Biz, ERG kayıtları, optik sinir kayıtları ve in vivo olarak at nalı yengeçleri intraretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterdi var. Kayıt teknikleri her nöral temeline ilişkin vizyon, farklı bakış açıları sağlamak ve hepsi yengeç büyük gözleri ve sert karapaksla canlı hayvanlar sayesinde retina fonksiyonunu incelemek için kullanılabilir. Optik sinir aktivitesi elektrot uygun inşaat (4) ile özgürce okyanus hayvanları davranmaya bile kaydedilebilir. Bu teknikler, aynı zamanda kurulum küçük değişiklik ile eksize gözleri yapılabilir. Ilgisi doğal durum bu tür deneyler yengeç en göz değişiklik fizyolojik özellikleri hayvan (5) kaldırıldı zaman olarak sınırlı olacak, ama öğretim değeri bu yöntemlerin yaygın kullanımı olarak verilen bir eğitim laboratuvarı için büyük olurdu nörobilim. ERG kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt netlik iyiliği için burada ayrıca sunuldu. Uygulamada, birden fazla kayıt yöntemleri genellikle sinirsel aktivite değişiklikleri ve bir veya her iki yan gözleri görsel hassasiyet aynı anda izlemek için tek bir deney içinde birleştirilir. ERG kayıt için kullandığımız küçük bir odasının diğer tasarımları üzerinde bu konuda (1, 6) özellikle avantajlıdır. Ayrıca, zaman içinde kurumasına geleneksel fitil elektrotları ile ilişkili istikrar sorunların giderilmesi, hava sızdırmaz tuzlu bir rezervuar tutar. Limulus mümkün görüş deneyler takımı sinir kayıt için açıklanan aynı prosedürleri yerine sinyal kuvvetlendirici bir elektrik stimülatörü yol açar elektrot bağlayarak sinir stimülasyonu için kullanılabilir, çünkü bu daha da büyüktür.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus&#39;un, dünyanın en eski canlıların biridir ve hayvan biyomedikal araştırma vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedir . Onların kan değil, sadece bilim adamları ilaçların bacteriotoxins algılamak için kullandığı özel hücreler içeren, ama onların gözleri de ışık adaptasyon ve yanal inhibisyonu gibi fizyolojik süreçleri, görsel sistem faaliyet hakkında daha fazla fikir sağlanan bir sinir ağı yapar. At nalı yengeci, hayvan, büyük ve cesur bir omurgasız olduğundan, retinal nöronların büyük ve kolayca erişilebilir görme araştırma için çekici bir model olmaya devam ediyor, görme sistemi, kompakt ve yoğun çalışılan ve görsel davranış iyi tanımlanmıştır. Ayrıca, gözlerin yapısı ve fonksiyonu, hayvanın beyninde bir sirkadiyen saat bir günlük bazda modüle. Kısacası, at nalı yengeçleri görme sistemi yeterince basit ama ilginç olacak kadar karmaşık anlaşılmalıdır. Bu video Limulus in vivo olarak yapılabilir görme nöral temelini araştırmak için üç elektrofizyolojik paradigmalar sunuyoruz. Onlar elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt. Bir yüzeye sahip elektroretinografi (ERG) kayıtları tedbir, tüm hücreleri bir ışık yanıp sönmeye göz özetlenebilir elektriksel tepki elektrodudur. Onlar zaman uzatmak süreler için göz genel duyarlılığı izlemek için kullanılabilir. Optik sinir kayıtları ekstraselüler microsuction elektrot ile tek sinir liflerinin spike aktivitesini ölçmek. Göz, beyin gibi beyin göz geri beslenen sirkadiyen saat mesajları iletilir görsel mesajları okumak için kullanılabilir. Intrasellüler mikroelektrot İntraretinal kayıtları önlem voltaj dalgalanmaları göz bireysel hücrelerin ışık ile indüklenen. Onlar retina işleme hücresel mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research at JoVE.com

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Bu videoda, Amerikalı at nalı yengeci elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt gerçekleştirmek<em&gt; Limulus Polyphemus&#39;un</em&gt;. Bu elektrofizyolojik paradigmalar, bir araştırma veya öğretim laboratuvar görme nöral temeli soruşturma için kullanılabilir.

Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemus&#39;un Vizyon Araştırma

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K Görüntüleme.  Boston University. Bu videoda, Amerikalı at nalı yengeci elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt gerçekleştirmek Limulus Polyphemus'un. Bu elektrofizyolojik paradigmalar, bir araştırma veya öğretim laboratuvar görme nöral temeli soruşturma için kullanılabilir.

Video: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Amerikan Horseshoe Yengeç, Limulus Polyphemus&#39;un Kan Toplama

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Biyoloji

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...