Farelerde Pediatrik Beyin Sarsıntısı Modeli: Uzun Süreli Bozukluklarla Kapalı Kafa Travması (ÇOCUK)

Pediatrik sarsıntılar, fizyolojik ve psikolojik bozulmalarla birlikte uzun süreli sekellere neden olabilir. Bu pediatrik beyin sarsıntısı fare modeli, uzun süreli nöroinflamasyon, beyaz cevher değişiklikleri ve davranışsal işlev bozukluğu ile nöronal modifikasyonlar ile sonuçlanır. Model, yaşam süresi değişikliklerini değerlendirmek için diferansiyel çarpma konumlarına veya tekrarlanan sarsıntılara uyarlanabilir.

Çocukluk döneminde beyin sarsıntısı ve hafif travmatik beyin yaralanmaları (mTBI) önemli bir sağlık tehlikesini temsil eder ve birçok hasta yaşamın ilerleyen dönemlerinde zayıflatıcı fizyolojik, nörolojik ve psikososyal sonuçlar sergiler. Hücresel ve moleküler patofizyolojik mekanizmalar nispeten bilinmemektedir ve bu önemli boşluk, kronik sekelleri hafifletmek için spesifik terapötik stratejilerin araştırılmasını etkili bir şekilde engellemektedir. Tek bir hayvan sarsıntısı modeli, insan deneklerde bildirilen tüm özellikleri özetlemez ve mevcut modeller, belirli araştırma sorularını yanıtlamak için tasarlanmıştır. Uzun Süreli Bozukluk (CHILD) ile Kapalı Kafa Travması olarak adlandırılan, karşılaşılan klinik erken ve uzun vadeli semptomolojiyi özetleyen bir çocuk sarsıntısı geliştirmek için yola çıktık. Bu modelde, bir elektromanyetik çarpma tertibatı aracılığıyla bir sarsıntı kuvveti, hafif anestezi uygulanmış, dizginlenmemiş bir doğum sonrası 17. gün (P17) faresinin kafasına iletilir ve başın serbest dönmesine izin verilir. Fareler, stereotaktik bir cihaz boyunca sıkıca gerilmiş bir kalay folyo üzerine yerleştirilir ve çarpma tertibatı, hedeflenen kortikal bölge ile dikkatlice hizalanır. Elektromanyetik çarpma tertibatı, yaralanma şiddetini belirlemek için darbe derinliği, bekleme ve süre seçimini kolaylaştırır. Bu modelin güçlü yanlarından biri, önemli bir klinik özellik olan baş rotasyonuna izin vermesidir. Çarpışmadan sonra, fareler çevrelerini keşfetmek için doğru zaman ve zaman için hemen izlenir ve ardından barajlarına geri dönerler. Beyin sarsıntısının şiddetini arttırmak, farelerin bir alt kümesinde intrakraniyal kanamalara neden olur. Fareler, istenildiği gibi ömürleri boyunca davranış ve nörogörüntüleme açısından rutin olarak izlenebilir. Çeşitli yaralanma şiddetleri, juvenil sarsıntıların heterojen doğasını taklit eder. Mevcut standart CHILD modeli kafatası kırığı göstermez, gözlemlenebilir konvansiyonel nörogörüntüleme değişikliği göstermez (kliniğe benzer), ancak ilerleyici ve kalıcı nöronal ölüme, değişmiş difüzyon MRG'ye, modifiye nöronal aktiviteye ve plastisiteye, artmış gliozise ve yaşla birlikte ilerleyici davranışsal bozulmalara yol açar. Özetle, bu CHILD modeli, birçok klinik beyin sarsıntısı hastasında gözlenen erken ve uzun vadeli özellikleri taklit eder.

Pediatrik Travmatik Beyin Hasarı (TBH), pediatrik acil tıbbi bakım ziyaretlerinin önde gelen nedenini temsil ettiği ve yaşamın ilerleyen dönemlerinde zayıflatıcı sağlık sonuçları ile ilişkili olduğu için önemli bir sağlık sorunudur. Tüm TBH vakalarının %75'ini oluşturan hafif TBH (mTBI)^{bile 1}, fizyolojik, psikolojik, nörolojik ve bilişsel işlev bozuklukları dahil olmak üzere uzun vadeli anormalliklere yol açar². Pediatrik mTBH'nin yüksek oluşumuna ve bununla ilişkili önemli sağlık risklerine rağmen, kronik eksikliklerden önce gelen patolojik, hücresel ve moleküler mekanizmalar hala yeterince araştırılmamıştır. Bu bilgi eksikliği, pediatrik mTBH için etkili tedavilerin ve tanı yöntemlerinin geliştirilmesini engellemektedir.

Yetişkin kemirgen TBI modelleri ağırlık düşüşü, kontrollü kortikal etki ve sıvı perküsyon yaralanmasını içerir ve orta ila şiddetli yaralanmaları ortaya çıkarmak için titre edilebilir (sonuç ölçümlerine bağlı olarak)^3,4. Bu yetişkin modellerin çoğu pediatrik TBI^5,6 için uyarlanmıştır. Son on yılda, mTBI modelleri, kapalı kafa travması olan kemirgenlerde ve rotasyonel modellerde^{geliştirilmiştir 7}. Bununla birlikte, bu modellerin gelişmekte olan kemirgenlerde uygulanması, erişkin TBH literatürüne kıyasla seyrektir⁸. Pediatrik klinik heterojenliği modelleyen çok çeşitli şiddetleri kapsayan klinik önemi ele almak için bu çalışma, Uzun Süreli Bozukluklu Kapalı Kafa Travması (CHILD) TBI modelini geliştirdi. CHILD, 2-3 yaşındaki çocuklarda^gözlenen miyelinleşme zirvesine karşılık gelen gelişimsel bir yaş olan P17 fareleri kullanan cerrahi olmayan, dizginlenmemiş bir beyin sarsıntısı modelidir 9. Hafif izofluran ile anestezi uygulanmış bir farenin somatosensoriyel korteksi üzerinde bir elektromanyetik çarpma kuvveti kullanılarak bir sarsıntı kuvveti uygulanır. Kontrolsüz kafayı etkilemek, birçok klinik beyin sarsıntısı raporunda bildirildiği gibi, beyin¹⁰ üzerinde dönme kuvvetlerine neden olur. Klinik mTBI ile tutarlı olarak, CHILD modeli geleneksel nörogörüntülemede kafatası kırığına veya görünür anormalliğe yol açmaz.

CHILD modelinin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, CHILD'da juvenil beyin sarsıntısı hastalarında gözlenen patolojik klinik özellikleri taklit eden hem erken hem de uzun vadeli patolojik özellikler gözlenmiştir. Geç zaman noktalarında gliozis, değişmiş difüzyon tensör MRG ve^{yaş 10,11, modifiye} nöronal aktivite ve plastisite^11,12 ile ilerleyici davranış bozuklukları gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, tek bir pediatrik yaralanmadan sonra uzun vadede kardiyak anormalliklerde de beklenmedik periferik sonuçlar bulunmuştur¹³. İkincisi, bu model tekrarlanabilir ve araştırmacılar arasında ve laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir sonuçlar gösterdi¹³. Üçüncüsü, CHILD modeli esnektir ve TBI'lerin heterojen doğasını kapsayacak şekilde genişletilebilir. Örneğin, önceki çalışmalar, farklı hızların ve çarpma derinliklerinin farklı şiddetlerle sonuçlandığını göstermiştir^10,11. Son olarak, bu modelin ek bir gücü, CHILD'ın tekrar tekrar uygulanabilmesi ve tekrarlanan yaralanmalara verilen yanıtları araştırmak ve hassas beyin bölgelerini belirlemek için farklı yerlere kolayca uygulanabilmesidir.

Genel olarak, CHILD modeli klinik pediatrik mTBI ve beyin sarsıntısını çoğaltır ve pediatrik mTBH'nin patofizyolojik özelliklerinin anlaşılmasını kolaylaştırmak için bir araştırma aracı olarak hizmet eder. Hiçbir model, gerçek hayattaki TBI vakalarında açıklanan özelliklerin her yönünü kapsamamakla birlikte, bu model cevapsız kalan olağanüstü araştırma sorularının çoğunu ele alabilir.

Deneyler, Bordeaux Üniversitesi (Fransa) ve California Riverside Üniversitesi (CA, ABD) olmak üzere 2 bölgede çoğaltıldı.

Bordeaux'da, tüm deneyler Üniversite hayvan tesisinde yetiştirilen erkek ve dişi P17 C57Bl6J fareleri üzerinde yapıldı. İlk yetiştiriciler ticari bir kaynaktan elde edildi ve 12/12 saatlik karanlık/aydınlık döngüsü, 21 °C ± 1 °C sıcaklık ve %55 ila %10 nem ± %55 ile standart koşullar altında yetiştirildi ve ad libitum yiyecek ve su sağlandı. Deneysel prosedürler, Bordeaux Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi düzenlemelerine, laboratuvar hayvanlarının kullanımını düzenleyen Fransız yasalarına (yetkilendirme #29324-2021012118549817 v3), Avrupa Konseyi direktiflerine (86/609/EEC) ve ARRIVE yönergelerine uygundur. Travmatik beyin hasarının hafif bir modeli olan bu protokol, ağrı veya sıkıntı yaratmaz. Bu nedenle, düzenli ağrı yönetimi dışında herhangi bir spesifik ağrı yönetimi gerektirmez. Yavruların sütten kesilmesi (TBI, Shams) P25'te etkili oldu.

Riverside'da, E13 hamile C57Bl6J dişi fareler ticari olarak elde edildi ve tüm deneyler, P17 yaşındaki hem erkek hem de dişi yavrularda elde edilen yavrular üzerinde gerçekleştirildi. Hayvanlar, otomatik 12/12 saatlik karanlık/aydınlık döngüsü ve 21 °C sıcaklıkta yetiştirildi. Barajlar ve yavruların yiyecek ve suya ad libitum erişimi vardı. Tüm deneysel prosedürler Kaliforniya Üniversitesi, Riverside Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Hayvan Refahı Yasası ve Halk Sağlığı Hizmeti politikasına uygun hale getirildi. Bu tesisteki tüm yavrular (TBI, Sham) P21'de sütten kesildi.

Bu çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ön adımlar

1. Hipotermiyi önlemek için, anestezi indüksiyonu için odayı ve kurtarma kafeslerini ısıtma pedleri ile önceden ısıtın.
2. Stereotaksik cihazı, çarpma tertibatı 90° açıyla monte edilmiş olarak ayarlayın.
3. Tüm parçaların uygun şekilde sıkıldığını ve sabitlendiğini ve pistonun çarpma tertibatına sıkıca vidalandığını doğrulayın.
4. Stereotaksik aparata uyacak bir alüminyum levha kesin (bu durumda, 18 cm x 30 cm). Burada kullanılan alüminyum standart alüminyum kalitesindedir. Hayvanın üzerine yatırılacağı bir ped oluşturmak için stereotaksik çerçeveyi folyo ile sarın. Hayvanın ağırlığını korumak için folyonun konumunu ve gerginliğini normal laboratuvar bandı ile sabitleyin.
5. Çarpma tertibatı kontrol cihazını açın ve yaralanmanın ciddiyetine bağlı olarak, çarpma hızını daha şiddetli bir darbe için derece 2 (G1) için 2 ^m.s-1 veya derece 3 (G1) için 2 m.s-2 olarak ayarlayın (bu parametrenin değiştirilmesi sarsıntının şiddetini etkileyecektir).
6. Hayvanları tartın. P17'de, C57Bl6 fareleri için hayvanların ağırlığı 5,9 g'ın üzerinde olmalıdır. Bu ağırlığın altına düşen hayvanlar hariç tutulur.
   NOT: Bazı çalışmalar için CD1 fareleri kullanılmış ve P17 için eşik 6.5 g'ın üzerinde olacak şekilde sabitlenmiştir (kişisel veriler).

2. Juvenil hafif travmatik beyin hasarı prosedürü

1. İzoflurana 5 dakika maruz bırakarak fareyi uyuşturun. Gaz bileşimini 1,5 L/dk akış hızına sahip %2,5'lik bir karışıma ayarlayın (bu durumda taşıyıcı, %21 oksijen içeren sentetik bir hava karışımıdır).
   NOT: Bu adımdan itibaren, etkilenmemiş hayvanlar 5 dakika içinde uyanacağından, tüm eylemler hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
2. Fare kafasını çarpma tertibatının altına yerleştirin. Yavru tüm uzunluklara yayılmalıdır. Uç 3 mm çapındadır ve metalin kafatası üzerindeki etkisini en aza indirmek için kauçukla kaplanmıştır.
3. Düğmeyi Uzatma konumuna getirerek çarpma tertibatını indirin.
4. Çarpma tertibatını kabaca indirin ve fareyi, çarpma tertibatı tam kulakların arasında olacak şekilde konumlandırın. Ardından, fareyi, piston ucu bir piston ucuna eşdeğer olacak şekilde ileri ve bir piston ucu hayvanın soluna gelecek şekilde kaydırın (bkz. Şekil 1).
   NOT: Sahte hayvanlar pistondan biraz uzağa yerleştirilmiştir (hayvanın hiçbir kısmı etkilenmemelidir).
5. Çarpma tertibatını hayvanın kafasına temas edecek şekilde indirin (Şekil 1, E2).
6. Çarpma tertibatını Geri Çekilecek şekilde ayarlayın (Şekil 1, E3).
7. Yaralanmanın ciddiyetini belirlemek için, 1. derece (G1) için pistonu 1 mm aşağı hareket ettirin. Daha şiddetli darbe derecesi 2 (G2) için pistonu 3 mm aşağı hareket ettirin (Şekil 1E4).
8. Ciddiyetinden bağımsız olarak bekleme süresini 0,1 saniyeye ayarlayın (bu parametrenin değiştirilmesi sarsıntının şiddetini etkilemeyecektir).
9. Sağ düğmedeki Impact'e basın (Şekil 1E5).
10. Sistemin aşırı ısınmaması için sol düğmeyi hızlı bir şekilde kapalı konuma getirin. Daha fazla bilgi için akış şemasına bakın (Şekil 2).

Şekil 1: Çarpma tertibatı ucunun konumlandırılması. (A) Çarpma tertibatı ucu ilk olarak kulaklar arasındaki orta hatta yerleştirilir. (B) Uç daha sonra 3 mm ileri hareket ettirilir (bir uç çapına eşdeğer). (C) Son olarak, piston ucu farenin sol tarafında 3 mm hareket ettirilir. (D,E) Çarpma tertibatı ucunun manyetik namluya göre olası konumları. (D) Çarpma tertibatı, piston gövdesine göre (nötr, geri çekilmiş veya uzatılmış/darbe) aralarında 5 mm mesafe olacak şekilde 3 konuma sahiptir. (E) Prosedürün farklı aşamalarında çarpma tertibatı ucunun kafatası yüzeyine göre pozisyonları. (1) Çarpma tertibatının nötr konumdaki konumu; (2) piston, hayvanın kafatasına hafifçe dokunacak şekilde hareket ettirilir (adım 2.5); (3) çarpma tertibatı daha sonra geri çekilecek şekilde ayarlanır (adım 3.6); (4) Çarpma tertibatının tüm gövdesi X mm aşağı hareket ettirilir (adım 2.7). G1 kalitesi için, G1 için 1 mm derinlik (x) ile 2 ^m.s-1 çarpma hızı (y) veya G2 için 3 mm (x) derinlik ile 3 m.s-1 çarpma hızı (y). (5) Kol darbesine basıldığında, çarpma tertibatı ucu, nötr konuma geri döndükten sonra bekleme süresi boyunca kafatası yüzeyinin x mm altına y hızında hareket eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CHILD akış şeması. Beyin sarsıntısı indüksiyonunun farklı aşamalarını belirtmek için renk kodlu PND17 farelerinde CHILD'ı indükleme adımlarını detaylandıran akış şeması. Kurulumun fotoğrafları şunları içerir: (A) Darbe kontrolörü, çarpma tertibatı ve ucu gergin kalay folyonun üzerine yerleştirilmiş stereotaktik cihaz ve bir ısıtma yastığının üstünde bulunan kurtarma kutusu dahil olmak üzere tüm CHILD indüksiyon kurulumu (anestezi cihazı görünmez). (B) Ölçekli kauçuk darbe ucu (3 mm). (C) Stereotaktik çerçeve boyunca gerilmiş kalay folyolu stereotaktik cihaz ve darbe ucu folyonun üzerine yerleştirilmiş çarpma tertibatı solenoidi. (D) Isı yastığı üzerinde oturan geri kazanım odası. (E) Akış şemasında olduğu gibi vurgulanan iki kontrol anahtarına sahip darbe kontrolörü (kırmızı kutu = uzat/geri çek/kapat; mor kutu = darbe geçişi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Travma sonrası takip

NOT: Aşağıdaki adımlar, çevrimdışı analiz için videoya kaydedilebilir ve deneycinin arka arkaya birden fazla hayvan üzerinde CHILD gerçekleştirmesine olanak tanır. Bununla birlikte, hayvan refahının düzenli ve tekrarlanan değerlendirmeleri yapılmalıdır.

1. Apnenin süresine, varsa (darbeden hemen sonra) ve çarpma sırasında bir kafa dönüşü olup olmadığına dikkat edin.
2. Fareyi sağ yan tarafında, bir kurtarma kafesine yerleştirin.
3. Farenin doğrultma zamanını (4 ayak üzerinde şahlanma) ve keşif davranışını sürdürme zamanını not edin. Tipik olarak, sahte fareler 3-4 dakika içinde uyanır ve 3-4 dakika sonra keşif davranışına devam eder (Şekil 3). ÇOCUK fareler, cinsiyete ve etki şiddetine bağlı olarak, çarpmadan 7-12 dakika sonra uyanır (Şekil 3A) ve çarpmadan 12-18 dakika sonra keşfe devam eder (Şekil 3B).
   NOT: Etkilenen hayvan 30 dakika içinde keşif davranışına devam etmezse, hayvan dışlanır.
4. Tamamen iyileştikten sonra hayvanları ev kafeslerine geri koyun. Bu noktada, sahte ve ÇOCUK farelerin davranışları (G1 veya G2 şiddeti) tamamen benzer olmalı ve hayvan grupları çöp içinde ayırt edilemez olmalıdır.
   NOT: Hayvanlar, yöntemlerin başında belirtilen koşullarda yaralanmadan 18 ay sonrasına kadar¹⁴ tutulabilir. Davranışsal sonuç değerlendirmeleri, MRI ölçümleri, miniskop görüntüleme, histoloji ve immünohistokimya ile ilişkili bir dizi test kullanılarak gerçekleştirilebilir¹². GFAP ve NeuN için immünohistokimya, modeli ve doku değişikliklerinin varlığını doğrulamak için erken zaman noktalarında kullanılabilir.

4. İmmünohistokimya

NOT: Yaralanmadan bir gün sonra, G2 ve sham gruplarından hayvanlar (G2 için n = 4 fare ve Sham için n = 4) anestezi altına alındı ve fosfat tamponlu salin (PBS) 0.1 M, pH 7.4 4 ° C'de hazırlanan% 4 paraformaldehit (PFA) ile transkardiyal olarak perfüze edildi. Beyinler kafatasından¹⁰ çıkarıldı ve gece boyunca aynı PFA çözeltisine daldırıldı ve daha sonra kesilmeden önce sodyum azid (% 0.1) ile PBS'ye aktarıldı. Koronal kesitler daha sonra vibratom kullanılarak 50 μm kalınlığında hazırlandı. Uzun süreli depolama için, bölümler kullanıma kadar -20 ° C'de kriyoprotektif ortama (PBS'de %30 etilen glikol ve %20 gliserol) yerleştirildi. Beyin sarsıntısının beyin gliozu ve nöronal kayıp üzerindeki etkisini karakterize etmek için, GFAP ve NeuN'yi hedefleyen immünohistokimya aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirildi.

1. PBS'de beyin bölümlerini 10 dakika boyunca 4 kez yıkayın.
2. Bölümleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca bloke etme solüsyonunda (% 1 BSA,% 0,3 Triton X-100) aktarın.
3. Bölümleri gece boyunca 4 ° C'de, aşağıdaki birincil antikorlar bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş olarak inkübe edin: tavuk anti-GFAP (1:3000) ve tavşan anti-NeuN (1:500).
4. Dilimleri çalkalama altında PBS'de 10 dakika boyunca 4 kez yıkayın.
5. Daha sonra, RT, Alexa-Fluor-488-nm keçi tavşan önleyici ve Alexa-Fluor-568-nm keçi tavuğu anti-tavukta 1:1000 oranında seyreltilmiş ikincil floresan antikorları içeren bloke edici çözelti içindeki bölümleri aktarın.
6. Daha sonra bölümleri çalkalama altında PBS'de 10 dakika boyunca 4 kez yıkayın.
7. Bölümleri bir montaj ortamı kullanarak kızaklara monte edin ve bir kapak fişi ekleyin. Görüntü elde edilene kadar slaytları 4 °C'de tutun.
8. Bir epifloresan mikroskobu ve micromanager yazılımı kullanarak immünofloresan elde edin. İpsilateral ve kontralateral hemisferlerin döşenmiş görüntülerini elde etmek için 10x lensli bir dikiş eklentisi kullanın.
   NOT: Primer antikorun veya sekonder antikorun atlandığı negatif kontrol boyama, saptanabilir bir etiketleme göstermedi. Daha ayrıntılı görüntü analizi için, Fiji yazılımı¹⁵ , çeşitli ilgi alanlarındaki¹⁶ immün boyama parametrelerini ölçmek için kullanılabilir.

CHILD modeli, pediatrik farelerde nispeten hızlı ve tekrarlanabilir bir mTBI modelidir ve ayrıca şiddet ve konumdaki değişikliklere izin verir. ÇOCUK fareler, beklendiği gibi, kapalı kafa travmasından önemli ölçüde daha uzun iyileşme süreleri sergiledi (Şekil 3). Kohortlar (n = 36 dişi sahte, n = 140 erkek sahte, n = 30 kadın G1, n = 55 erkek G1, n = 32 kadın G2, n = 141 erkek G2) toplandığında, düzeltme süresinde (Şekil 3A, 3 yönlü ANOVA p < 0.001) ve keşif davranışlarına devam etme süresinde (Şekil 3B, 3 yönlü ANOVA p < 0.001) bir gecikme gözlenmiştir. İyileşme periyodu aynı zamanda etki şiddetine de bağlıydı (Şekil 3, G1'e karşı G2; 3 ANOVA, p < her iki parametre için 0.001). Cinsiyet etkileri, hem düzeltme süresinde (3 yönlü ANOVA, p < 0.01) hem de keşif süresinde (Şekil 3, 3 yönlü ANOVA, p < 0.001) erkeklere kıyasla daha uzun bir iyileşme süresi sergileyen yaş uyumlu kadınlarda açıkça gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, yaralanma şiddetleri arasında cinsiyet içi fark yoktu (G1 ve G2).

Klinik öncesi model geliştirme, araştırma grupları arasında daha geniş bir yayılıma izin vermek için tekrarlanabilirlik gerektirir. İki laboratuvar (Badaut, Fransa; Obenaus, ABD) tekrarlanabilirlik için karşılaştırmalar yaptı. Karşılaştırmalar için doğru zamanları ve zaman keşif davranışını sürdürürken, G2 CHILD'ın iki farklı bölge arasında tekrarlanabilirliğini düşündüren anlamlı bir fark bulunmadı (bakınız Tablo 1).

Şekil 3: G1 ve G2 önem dereceleri için CHILD modelinde kurtarma süreleri. Kullanılan parametreler, 0.1 s'lik bir bekleme süresi ve G1 için 1 mm derinlik ile 2 ^m.s-1 çarpma hızı veya G2 için 3 mm derinlik ile 3 m.s-1 çarpma hızı idi. (A) Çarpmadan sonra 4 pençe üzerinde durma süresi olarak ölçülen doğrultma süresi. (B) Çarpmadan keşif davranışına devam etme zamanı. Veriler ortalama ± SD'dir, grup başına düşen hayvan sayısı (A) ile belirtilmiştir. §§§, sahte muadillerine kıyasla anlamlı bir fark olduğunu gösterir (p < 0.001), * ve *** her şiddet düzeyi için erkekler ve kadınlar arasında anlamlı bir fark olduğunu gösterir (sırasıyla p < 0.05 ve p < 0.001), #, ###, ### şiddet ve cinsiyet arasındaki önemli etkileri ve etkileşimi gösterir (p < sırasıyla 0.05, p < 0.01 ve p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hafif travmatik beyin yaralanmalarının klinik öncesi modellerinde ayırt edici bir özellik, ilk yaralanmadan ^16,17 çok sonra kalan^{astrogliozis 18} gelişimidir. Ek olarak, çocuklarda ve yetişkinlerde yapılan çalışmalar, serum^19,20,21'den glial fibriler astrositik proteinin (GFAP) akut (günlük) biyobelirteç değerlendirmelerinde hafif ila şiddetli TBH'den sonra önemli artışlar bildirmiştir. Daha önce bildirildiği gibi¹⁰, CHILD indüksiyonundan sonra, ipsilateral somatosensoriyel kortekste yaralanmadan 1 gün sonra astrogliozis belirgindi. 1 günlük zaman noktasında önemli bir nöron kaybı olmadı (NeuN immünohistokimyası). Analitik ayrıntılar için lütfen Clément et ^al.16'ya bakın.

Şekil 4: CHILD modelinde çarpmadan 1 gün sonra astrogliozis GFAP immünokinetiketleme paterni değişikliklerinin indüksiyonu. (A) GFAP pozitif astrositlerdeki değişiklikleri değerlendirmek için GFAP immünoetiketlemesi yapıldı. Üst kısım, alt sıranın yakınlaştırma resimlerine karşılık gelen dikdörtgen çerçevelere sahip düşük büyütmeli bir resimdir. Sahte grupta (solda), glia limitans, korpus kallozum ve stratum radiatum'da GFAP immünoetiketlemesi mevcuttu. CHILD grubunda (sağda), beyin sarsıntısı, yüzeysel kortikal tabakalarda (noktalı çizgi ile sınırlandırılmış) ve hipokampal stratum radyumda sahte gruba kıyasla GFAP pozitif astrositlerin sayısında bir artışa neden oldu. (B) CHILD modelinin nöronlar üzerindeki sonuçlarını değerlendirmek için, farklı kortikal katmanlardaki ve hipokampustaki çekirdekleri göstermek için NeuN immün boyama yapıldı. Nöronal belirteç ekspresyonu açısından sham (solda) ve CHILD (sağda) grupları arasında anlamlı fark yoktu. Ölçek çubukları: 1 mm, büyütülmüş: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Parametreleri keşfetmek için zaman ve zamanı düzeltmek için siteler arasında karşılaştırmalar.

Protokoldeki kritik adımlar
Burada açıklanan CHILD protokolü, (1) darbe parametrelerini (hız, derinlik, süre) standartlaştıran, (2) laboratuvarlar içinde ve laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği sağlayan ve (3) ticari olarak kolayca temin edilebilen bir elektromanyetik çarpma tertibatının (Şekil 2A) kullanılmasını gerektirir. Diğer bir kritik bileşen, kemirgenin kafasına çarpan çarpma tertibatı ucudur. Silikondan metal uçlara kadar çeşitli olasılıklar kullanılabilir, ancak bu protokol 2 mL'lik bir şırınganın pistonundan elde edilen bir kauçuk uç kullanır (Şekil 2B). Kauçuk ucun mantığı, darbenin kuvvetini ve dönüşünü kafatasına iletmek, ancak kafatası kırıklarına yol açmamaktır. G2 farelerinde, küçük bir alt küme, ilişkili subdural kanama olsun ya da olmasın kafatası kırıkları sergiledi. Elektromanyetik bir çarpma tertibatı kullanmak, G1 ve G2 tanımlarında yapıldığı gibi, şiddeti modüle etmek için çarpmanın derinliği ile birlikte hızı/süreyi manipüle etme fırsatı da sağlar. Kafa üzerindeki çarpma pozisyonu, tekrarlanabilirlik için dikkatli bir şekilde hizalanmalıdır, ancak kafa rotasyonu patofizyolojik sürece önemli ölçüde katkıda bulunduğundan, küçük konum farklılıklarının yaralanma sonuçları üzerinde önemli bir etkisi yoktur.

Diğer bir kritik bileşen, kafa darbesi sırasında farenin yerleştirildiği ortamdır. Köpükten kağıda kadar farklı malzemeler kullanan çeşitli raporlar var ama burada alüminyum folyo kullanılıyor. Alüminyum folyo kullanmanın mantığı, darbe teslimatı sırasında kırılmamasıdır. Alüminyum folyonun kalınlığı, darbeye karşı bir miktar direnç sağlamak için önemlidir, ancak aynı zamanda yeterli kafa hareketine ve dönüşüne izin verir. Baş hareketini ve dönüşünü daha önce ilk yayın^10'da belgelemiştik.

Travmadan 1 gün sonra kafatası kılıfından beyin çıkarıldığında G1 şiddet düzeyinde gözle görülür bir kanama veya kafatası kırığı gözlenmemelidir. Yukarıda belirtildiği ve yayınlandığı^{gibi 10}, bir G2 etkisi, neokorteks ve korpus kallozum arasında bulunan bazı farelerde mikro kanamaya neden olabilir. G1 veya G2 darbelerinin benzer düzeltme sürelerine neden olduğunu unutmayın (bkz. Şekil 3A). Klinik literatür, nörogörüntülemenin anatomik MRG taramalarında gözlemlenebilir bir değişiklik göstermemesi gerektiği sonucuna varmıştır; daha önce yayınlanan çalışmalarda G1^10'da nörogörüntüleme değişiklikleri gözlenmemiştir. CHILD modelinin bir özelliği, gerekirse daha şiddetli/orta dereceli kapalı kafa travması (CHI) elde edilebilmesidir. Daha şiddetli CHI kullanılırsa, ekstravasküler kanın varlığı, 1. günde potansiyel bir nöron kaybı ile beyin dokusu üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olacak ve buna artmış GFAP boyaması eşlik edecektir. G2 protokolünden sonraki 1. günde görünür kanama veya brüt morfolojik değişikliklerin yokluğunda, sahte farelere kıyasla kortekste GFAP boyaması artmıştır (Şekil 4A). GFAP değişiklikleri, yaralanmadan 1 gün sonra^10,16 CHILD modelinde kritik bir dönüm noktasıdır ve yaralanmadan 30 gün,¹⁶ ve 12 ay sonra¹⁸ zaman içinde devam eder.

Değişiklikler ve sorun giderme
Belirtildiği gibi, kafatası kırığı ve görünür intrakraniyal kanamanın olmaması, beyin sarsıntısı modeli olarak atama için kritik dönüm noktalarıdır. Her ikisi de tespit edilirse, çarpma derinliği de dahil olmak üzere çarpma tertibatının parametreleri değiştirilmelidir. (1) çarpma tertibatının hızını değiştirmek (kafatası kırığı riskini sınırlamak için azaltmak), (2) kafatası kırılmasını en aza indirmek için uçtaki kauçuğu daha yumuşak ve daha sönümleyici hale getirmek için değiştirmek ve (3) kafanın yer değiştirmesini ve dönüşünü azaltmak için azaltılabilecek darbenin derinliğini değerlendirmek. Darbe derinliğindeki değişimin sonucu, kafa içi kanama riskinin azalması olacaktır. Yukarıda açıklanan deney koşulları, benzer sonuçlarla yaşlı hayvanlarda kolayca değiştirilebilir. Yukarıdaki sonuçlarda gösterildiği gibi, protokol, yaralanma iyileşmesinde cinsiyet farkı ile her iki cinsiyette de iyi çalışır.

Sınırlama
Bu CHILD protokolü, bregma yer işaretlerini görselleştirmek için anestezi maruziyetini ve ameliyatsız invazivliği en aza indirmek için geliştirilmiştir. CHI'nin azalmış invazivliği ve darbeden sonra çok kısa iyileşme süreleri (Şekil 3) bir güç olsa da, bir sınırlama, bregma yer işaretlerinin yokluğunda çarpma tertibatı ucunun konumlandırılmasının potansiyel değişkenliğidir. Bu modelin avantajı, ameliyat ve hızlı bir prosedür olmadan, daha invaziv prosedürlere kıyasla daha fazla sayıda hayvanda prosedürün tekrarlanmasına izin vermesi ve dolayısıyla CHILD modelinin olası değişkenliğini hesaba katmasıdır. Mevcut CHILD modeli, belirli bir kafatası kalınlığına sahip genç bir fare kullanılarak yapılan bir dizi çalışmada test edilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma, ağırlığı <5.9 g olan farelerin önemli ölçüde daha uzun iyileşme süresi (<30 dakika) sergilediğini ve ayrıca daha şiddetli bir fenotip sergilediğini gözlemledi (kişisel gözlemler). Bu nedenle, CHILD modelinin tutarlılığı ve kafatası kırığının^{sınırlandırılması için} sadece yavru farelerin >6.0 g dahil edilmesi önerilmektedir 10. CHILD modelini sıçanlara uyarlamanın, benzer bir sarsıntı modeli elde etmek için yeni bir dizi geçici parametre gerektireceği unutulmamalıdır.

Yöntemin mevcut/alternatif yöntemlere göre önemi
Kapalı kafa yaklaşımı kullanarak mTBI'yi indüklemek için çeşitli yöntemler vardır. mTBI modellerinin çoğunun yetişkin kemirgenlerde geliştirildiğini ve kullanıldığını vurgulamak önemlidir⁸. Genç kemirgenlerde ve çoğunlukla sıçanlarda çok az CHI modeli geliştirilmiştir (P20 yaşlı sıçanlar, Tasarlanmış Dönme İvmesinin Kapalı Kafa Yaralanması Modeli (CHIMERA) model²²). Burada, P17 ile 18 arasındaki genç fareler için çok uygun, P20'de kolayca genişletilebilen ve uzun vadeli değişiklikleri ortaya çıkaran basit bir model önerilmiştir¹⁸. Nöronal hiperaktivite¹², iltihaplanma ve vasküler ve serebrovasküler değişiklikler 10,11,12,13,14,16,18 dahil olmak üzere doku özelliklerindeki değişiklikler dahil olmak üzere iki şiddetin hayvanların sonuçları üzerinde uzun vadeli sonuçları olduğu gösterilmiştir. CHILD modeli, uygulama kolaylığı ve cerrahi becerilere ihtiyaç duyulmaması nedeniyle benzersiz bir konuma sahiptir. Bordeaux ve UC nehir kenarındaki laboratuvarlara ek olarak, CHILD modelinin diğer laboratuvarlarda da tekrarlanabilirliği rapor edilmiştir (yani, Montpellier¹³).

Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
Burada, baş rotasyonu ve majör nöronal hücre ölümünün olmaması dahil olmak üzere klinik pediatrik özellikleri taklit etmek için genç farede yeni bir beyin sarsıntısı modeli önerilmiştir (Şekil 4B); MRG¹⁰ ile kanama değerlendirilmedi. Mevcut model, tekrarlanan zaman noktalarında tekrarlanabilir (tekrarlanan mTBI için) ve etki konumu, araştırmacıların ilgi alanına göre değişebilir. Gösterildiği gibi, ölçülen sonuçlara dayanarak her ikisi de mTBI veya beyin sarsıntısı fenotipleri sergileyen Derece 1 (G1) ve Derece 2 (G2) olmak üzere çeşitli şiddetler geliştirdik. Mortalitenin¹⁰ olmaması ve fareleri yaralanma sonrası uzun bir süre boyunca, elimizde en az 18 aya kadar izleme olasılığı artı^14'tür.

Klinik öncesi çalışma tekrarlanabilirliği bağlamında, çok laboratuvarlı çalışmaların, tek laboratuvar çalışmasına göre daha yüksek kaliteye, daha az yanlılığa ve çalışma tasarımında daha fazla titizliğe sahip olduğu tespit edilmiştir²³. Konsorsiyumumuzda (NINDS Grant No. 1R01NS119605 (Obenaus, Badaut) ve 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo) tarafından finanse edilen), CHILD modelinin, kurtarma parametrelerinde fark olmadan sahalar arasında tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir. Bu veriler, CHILD modelinin çeşitli araştırma gruplarında ve daha büyük çoklu laboratuvar çalışmalarında yaygın olarak kullanılabileceğini kuvvetle göstermektedir. CHILD modeli, ilaç geliştirme için çok gruplu çalışmalar için olduğu kadar oyundaki patofizyolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması için de yararlı bir modeldir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu yöntem makalesi Eranet Neuron Neuvasc (Badaut), Agence Nationale de la Recherche Nanospace (Badaut), CNRS IRP IINOVAtion (Badaut) ve NIH NINDS Grant No. 1R01NS119605 (Obenaus, Badaut) ve 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.