6-Hidroksidopamin Kaynaklı Yetişkin Zebra Balığı Bazlı Parkinson Hastalığı Modelinin Lokomotor Değerlendirmesi

Bu protokol, yetişkin zebra balıklarının ventral diensefalonda (Dn) nörotoksik 6-hidroksidopamin (6-OHDA) ile intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonunu ve bir video izleme yazılımı kullanılarak analizin eşlik ettiği açık tank testi kullanılarak yüzme davranışı postlezyonunun bozulmasının ve daha sonra iyileşmesinin değerlendirilmesini açıklamaktadır.

Parkinson hastalığında (PD) dopaminerjik nöronal kaybı geciktirmede mevcut tedavilerin sınırlamaları, bu nöronları geri yükleyebilecek alternatif tedavilere olan ihtiyacı artırmaktadır. Şu anda preklinik in vivo modeller kullanılarak nörorejenerasyonun daha iyi anlaşılması için çok çaba sarf edilmektedir. Bununla birlikte, kendi kendini onarmak için bu rejeneratif yetenek, memelilerde verimsizdir. Zebra balığı gibi memeli olmayan hayvanlar, sürekli kendini yenileme ve insanlara yakın bir beyin homolojisine sahip olma kabiliyeti nedeniyle mükemmel bir nörorejeneratif model olarak ortaya çıkmıştır. İn vivo nörorejenerasyonda yer alan hücresel olayları aydınlatma çabalarının bir parçası olarak, 6-hidroksidopamin (6-OHDA) kaynaklı yetişkin zebra balığı bazlı PD modelini kurduk. Bu, zebra balığı beyninin ventral diensefalonunda (Dn) dopaminerjik nöronları (DpN) spesifik olarak ablate etmek için 99.96 mM 6-OHDA'nın optimize edilmiş intraserebroventriküler (ICV) mikroenjeksiyonu ile elde edildi. İmmünofloresan, postlezyonun üçüncü gününde DpN ablasyonunun %85'inden fazlasını ve lezyonlu bölgede 30 günlük postlezyonda DpN'nin tam restorasyonunu gösterdi. Bu çalışma, lezyonu takiben zebra balığı yüzme davranışının bozulmasını ve ardından iyileşmesini, kat edilen mesafe (cm) ve ortalama hız (cm / s) olmak üzere iki parametrenin ölçüldüğü açık alan testi kullanılarak belirlemiştir. Hareket, video izleme yazılımı kullanılarak her grubun (n = 6) ayrı balıklarının kayıtlarını analiz ederek değerlendirildi. Bulgular, lezyonlu zebra balıklarının 3 gün postlezyonunda (p) shamile kıyasla hızlarında (cm / s) ve kat edilen mesafede (cm) anlamlı bir azalma (p < 0.0001) gösterdi. Lezyonlu zebra balığı, 30 gün sonra yüzme davranışının tamamen iyileştiğini gösterdi. Mevcut bulgular, 6-OHDA lezyonlu yetişkin zebra balığının, PD'de nörorejenerasyonun incelenmesini kolaylaştırmak için tekrarlanabilir kalitede mükemmel bir model olduğunu göstermektedir. nörorejenerasyonun altında yatan mekanizmaların yanı sıra süreci modüle eden içsel ve dışsal faktörler üzerine gelecekteki çalışmalar, PD'ye karşı yeni hücre replasman tedavi stratejileri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Parkinson hastalığı (PD), kas sertliği, istirahat titremesi ve bradikinezi ile belirgin bir şekilde karakterize bir hastalık, dünyada en hızlı büyüyen nörolojik ^{hastalıktır1,2}. Özellikle 50 yaş ve üzeri bireylerde PD riski ve prevalansı yaşla birlikte hızla ^{artmaktadır3}. PH'nin etiyolojisi ve patogenezi bugüne kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu genellikle PD'nin erken başlangıcını tanı konmamış bırakmıştır. Şu anda, PD hastalarında dopamin eksikliği ve dopaminerjik nöronların (DpN) kaybı, motor semptomların tezahürü ile güçlü bir şekilde ^{bağlantılıdır4}. Bu ilişkiden yararlanarak, doğrudan dopamin replasmanı (yani levodopa) olarak hareket etmek veya DpN kaybını (yani derin beyin stimülasyonu) telafi etmek için çeşitli tedaviler tasarlanmıştır. Bu tedaviler semptomatik faydalar sağlasa da, hastalığın kötüleşen seyrini ^{değiştirmez5}. Bu önemli zayıflık göz önüne alındığında, hücre replasman tedavisi önerilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği, greft hazırlama, hücre büyüme kontrolü ve fenotip instabilitesinin zorlukları göz önüne alındığında tutarsızdır. Etik kaygıları artıran hücre replasman tedavisi, beyin tümörlerini ve istenmeyen bağışıklık reaksiyonlarını tetikleme riskini de beraberinde ^{getirmektedir6,7}.

Mevcut terapötik stratejilerin sınırlılıkları, PD tedavisinde potansiyel bir yaklaşım olarak DpN'nin rejenerasyonuna daha fazla vurgu yapılmasına yol açmıştır. DpN veya nörorejenerasyonun rejenerasyonu, sadece yeni bir terapötik yöntem olarak potansiyeli nedeniyle değil, aynı zamanda hastalığın mekanizmasını anlama aracı olarak da PD'nin yönetiminde umut verici atılımlardan biri olarak ortaya ^{çıkmıştır8, 9}. Bu yaklaşım, farklılaşma, migrasyon ve mevcut progenitör hücrelerin lezyonlu devreye entegrasyonu yoluyla nöronal fonksiyonun restorasyonuna ^{odaklanmaktadır10}. Nörorejenerasyonu daha fazla araştırmak için, çeşitli in vivo çalışmalar yapılmıştır. Memeliler, amfibiler ve sürüngenler gibi omurgalıların yaralanma sonrası yeni beyin hücreleri ürettikleri ^{bulunmuştur11,12}. Omurgalılar arasında, memeli hayvanlar, insanlara genetik benzerlikleri nedeniyle daha çok aranmaktadır. Bununla birlikte, memeliler, merkezi sinir sisteminde (CNS) bir beyin lezyonunu takiben yetişkinliğe kadar sürebilen sınırlı ve zayıf onarıcı kapasite ^{sergilerler13}. Genel olarak, memeliler, üretilen düşük sayıda nöronun PD'de gözlenen hasarlı sinir devrelerini restore etmek için yeterli olmayacağı göz önüne alındığında, nörorejenerasyonu anlamak için hayvan modelleri olarak uygun değildir. Bu nedenle, özellikle zebra balıklarında teleost tabanlı model, yüksek proliferatif oranı, sürekli kendini yenileme kabiliyeti ve insanlarla beyin homolojisini kapatma kabiliyeti nedeniyle büyük ölçüde tercih ^{edilmektedir14,15}.

Zebra balığı en yaygın olarak ^PD16'daki düzensiz hareketi incelemek için kullanılır. Zebra balığı bazlı PD modeli genellikle 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ve 6-hidroksidopamin (6-OHDA)¹⁷ içeren nörotoksinler tarafından indüklenir. Spesifik DpN kaybını ve dopamin seviyelerinin azalmasını indüklemede etkili olmasına rağmen, MPTP tabanlı modeller, DpN kaybı yalnızca ^CNS18 ile sınırlı olmadığından PD koşullarını yakından taklit etmez. 6-OHDA'nın kan-beyin bariyerini geçememesi, intramüsküler olarak değil, intrakraniyal olarak uygulandığında beyindeki hücresel ve fonksiyonel değişiklikler üzerindeki etkilerini ^{kısıtlamıştır19}. 6-OHDA'nın periferik uygulaması, sinir sistemi boyunca dopamin seviyelerinin küresel olarak azalmasına neden ^olmuştur20. 6-OHDA'nın beyin omurilik sıvısına uygulanması, ^CNS21 boyunca DpN'nin ablasyonuna neden olurken, PD'de görüldüğü gibi durumu taklit etmez, bu sayede DpN kaybı özellikle insan beyninin substantia nigra'sında meydana gelir. 6-OHDA'nın ICV uygulaması, aksine, zebra balığı beynindeki ventral Dn bölgesinde, substantia ^nigra22'ye çok benzeyen DpN'nin önemli ablasyonunu spesifik olarak indükledi. İlginçtir ki, DpN'nin iyileşmesi 6-OHDA kaynaklı lezyondan 30 gün sonra bildirilmiştir ve bu nöronlar yaşam boyunca hayatta ^{kalmıştır23,24}. DpN'nin fonksiyonel geri kazanımı, 6-OHDA kaynaklı yetişkin zebra balığı bazlı PD modeli ²² kullanılarak kat edilen mesafenin (cm) ve ortalama hızın (cm/s) lokomotor değerlendirmesi ile gösterilmiştir.

Bu çalışma, Hayvan Araştırma ve Etiği Komitesi (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referans No: UiTM CARE 346/2021, 7 Mayıs 2021 tarihli] tarafından onaylanmıştır.

NOT: Standart hayvancılık ve 6-OHDA lezyonlu yetişkin zebra balığı PD modelinin bakımı için yayınlanmış ^{protokoller22,25,26} kullanılmıştır. Deneyler, standart uzunluğu 3.2-3.7 cm olan beş aylıktan daha eski yetişkin erkek zebra balığı (Danio rerio) ile yapılmıştır.

1. Zebra balığı bakımı ve ICV öncesi mikroenjeksiyon preparatları

1. Balıkları havalandırılmış bir su tankında 28 ± 1.0 ° C kontrollü bir sıcaklık altında tutun. Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakımı için, deney boyunca ticari deniz tuzu (1 g / L) ile mineralize edilmiş damıtılmış su ^kullanın27.
2. 45 L tank başına maksimum 25 balık veya 1.8 L su başına bir balık barındırın ve bunları 14 saat ışık ve 10 saat karanlık fotoperiyot programına maruz bırakın. Balıkları günde en az iki kez, dondurularak kurutulmuş solucanlarla desteklenmiş yiyecek topaklarıyla besleyin.
3. 250 mL damıtılmış suda 2.5 g MS-222 ve 5 g sodyum bikarbonatı çözerek konsantre bir trikain metansülfonat (MS-222) stok çözeltisi hazırlayın. 200 mL çalışma anestezi çözeltisi üretmek için 2 mL stok çözeltisini seyreltin.
4. İlk önce 0.2 mg askorbik asidi 1 mL% 0.9 w / v steril filtrelenmiş NaCl içinde çözerek 99.96 mM 6-OHDA hazırlayın. Çözeltiye toz halinde 25 mg 6-OHDA eklemeden önce çözeltiyi 0.2 mikron filtre ile filtreleyin. Her enjeksiyondan önce çözeltiyi taze olarak hazırlayın ve 4 ° C'de karanlıkta saklayın.
   DİKKAT: Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz maskesi) giyin ve kimyasalları kullanırken iyi laboratuvar uygulamalarını uygulayın. Kimyasalların tüm elleçlemesi bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

2. Zebra balıklarının anestezi ve ICV enjeksiyonu

1. Anestezi sırasında yetersizliği önlemek için balıkları 24 saat boyunca hızlandırın. Balığı, yaklaşık 1 dakika boyunca veya tüm görünür kas hareketleri durana kadar% 0.01 w / v MS-222 çözeltisi içeren bir kaba batırarak anestezi yapın.
2. Anestezi uygulanan balıkları, stereomikroskop altına yerleştirilmiş suya batırılmış bir sünger üzerine yerleştirin ve balıkları düzenli olarak ıslatın.
3. Zebra balığı beyninin frontal ve parietal kafatasını birbirine bağlayan metopik sütür (MS), koronal sütür (CS) ve sagital sütür (SS) arasındaki kesişime dayanarak enjeksiyon pozisyonunu tanımlayın.
4. Zebra balığı kafatası üzerindeki spesifik anatomik pozisyon tarafından yönlendirilen kafatasında keskin bir 27 G iğne kullanarak 1,0 ^mm2 alanda küçük bir delik açın (Şekil 1A,B).
5. Zebra balığı kafatasının kafatası çatısından 1.200 μm derinliğe ulaşana kadar mikrokapiler enjektörü 60° açıyla indirin (Şekil 1C). Konumu düzeltmek için Z sınırına basın.
6. İlk enjeksiyon basıncını 4000 hPa'ya ve kompanzasyon basıncını 10 hPa'ya ayarlayın. Enjeksiyon süresini 0,3 sn'ye ayarlayın. Sonraki her enjeksiyonda enjeksiyon yoğunluğunu azaltın.
7. 0.5 μL 99.96 mM nörotoksin 6-OHDA (veya sahte kontrol grubu için% 0.9 w / v salin) enjekte edin ve mikrokılcal damarın 20 s dinlenmesine izin verin. Kurumasını önlemek için enjeksiyon işlemi boyunca balıkları damıtılmış suyla ıslatmaya devam edin.
8. Mikrokılcal damarı yavaşça çıkarın ve balıkları akan damıtılmış su altında yeniden canlandırın. Balıkları izole edilmiş bir kurtarma tankına yerleştirin ve kurtarma işlemini potansiyel olarak bozabilecek dikkat dağıtıcı unsurları giderin.
9. Tıkanıklığı gidermek ve enjeksiyon yoğunluğunun istenen 0.5 μL 6-OHDA hacmini elde etmek için yeterli olduğundan emin olmak için bir sonraki enjeksiyondan önce mikrokılcal damarı yıkayın.

Şekil 1: Nörotoksin enjeksiyon bölgesi, 6-OHDA. (A) Mikrokapiller giriş noktası, zebra balığı beyninin frontal ve parietal kafatasını birbirine bağlayan metopik sütür (MS), koronal sütür (CS) ve sagital sütür (SS) arasındaki kesişme ile yönlendirilir (plan görünümü). (B) Zebra balığı kafatasının ve beyninin şematik bir çizimi (plan görünümü), doğrudan habenula'nın (Hab) üzerine indirilen mikrokılcal damarı ve yarımküreler arasındaki kesişme noktasındaki giriş noktasını gösterir. (C) Zebra balığı beyninin şematik bir çizimi (sagital bölüm), enjeksiyon açısını ve penetrasyon derinliğini gösterir. Siyah nokta, hedeflenen bölgenin, ventral diensefalonun üzerinde yer alan lezyonlu bölgeyi temsil eder. Kısaltmalar: 6-OHDA: 6-hidroksidopamin, CS: koronal sütür, Dn: diensefalon, Hab: habenula, Hyp: hipotalamus, MS: metopik sütür, OB: koku alma ampulü, POA: preoptik alan, PT: posterior tüberkül, SS: sagital sütür, Tec: tektum ve Tel: telensefalon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Lokomotor değerlendirmesi

NOT: Zebra balıklarının lokomotor değerlendirmesi (n = altı / grup; sahte vs lezyonlu), 6-OHDA lezyonu sonrası üçüncü günde ve 30. günde yerleşik ^{protokoller28,29} kullanılarak açık tank testi ile bireysel olarak değerlendirildi.

1. Video kaydı
   1. Deney tankını (uzunluk 20 cm, genişlik 11,5 cm, yüksekliği 13 cm) duvarları beyaz kağıtla kaplı olarak yükseltilmiş bir platform üzerine yerleştirin (Şekil 2A).
   2. Bir ışık kaynağı kullanarak tankı alttan aydınlatın. Depoyu damıtılmış suyla doldurun (% 80 -% 90 dolu) ve sıcaklığı 28 ± 1.0 ° C'de tutun. Bir termometre kullanarak sıcaklığı ölçün ve ticari bir akvaryum ısıtıcısı kullanarak düzenleyin.
   3. En az 2 dakikalık iklimlendirmeden sonra, 5 dakika boyunca bir video kamera kullanarak balık yüzme davranışını deney arenasının 2 boyutlu (2D) düzleminde bir plan görünümünden kaydedin (Şekil 2B). Önceki ve son kayıt grubunun yüzme davranışında tutarsızlık olmasını önlemek için, iklimlendirmeyi 10 dakika ³⁰ aşmayın.
   4. Her konunun kat edilen mesafesini (cm) ve ortalama hızını (cm / s) elde etmek için açık tank protokolü ile video izleme yazılımı kullanarak videoları analiz edin.

Şekil 2: Zebra balığı lokomotor davranışının değerlendirilmesi için açık tank testinin deneysel kurulumu . (A) Deney tankı (önden görünüm), aşağıdan aydınlatılan yükseltilmiş bir platforma yerleştirilir. Tankın dört duvarı beyaz kağıtla kaplanmış ve kayıtlar eksenel olarak yakalanmıştır. Sıcaklık bir termometre kullanılarak ölçülür ve ticari bir akvaryum ısıtıcısı kullanılarak 28 ± 1.0 ° C'de düzenlenir. (B) Kurulum kullanılarak yakalanan video kaydının ekran görüntüsü (plan görünümü). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Veri analizi
   1. Video izleme yazılımını açmak için simgeye çift tıklayın. Dosya sekmesine tıklayın ve Yeni Boş Deneme Oluştur'u seçin. Bu, kullanıcının deneme parametrelerini araştırmanın amaçlarına göre özelleştirmesine olanak tanır.
   2. Protokol sekmesine tıklayın, Video Kaynakları'nı seçin ve Yeni Video Kaynağı Ekle'ye tıklayın. Mevcut açılır listeye tıklayın ve Video Dosyası seçeneği. Bu, ilgilenilen video kayıtlarının seçilebileceği dosyaya göz atma açılır penceresini ister.
   3. Aparat alt sekmesine tıklayın ve aparatı ayarlamak için Dikdörtgen simgesini seçin. Tüm deneysel arenayı kaplamak için dikdörtgen simgeyi sürükleyin. Ölçek çubuğunu buna göre ayarlayın ve cetvel bölümünün uzunluğunda kullanılan ölçek ölçümünün sayısal değerini girin. Bu deney, açık tank testi için 10 mm'lik bir ölçek kullandı.
   4. Hayvanlar Cihaz Arka Planından Daha Koyu'nu seçerek hayvan rengini ayarlayın. İzleme'deki diğer kullanılabilir seçenekleri önceden ayarlanmış varsayılan ayarlara bırakın.
   5. Bölgeler alt sekmesinde, önceden çizilmiş aygıta tıklayın. Bu bölge, tüm testler için pozisyonunun aynı olduğu standart bölge olarak ayarlanır.
   6. Test zamanlama ve test verileri raporu altında aşağıdaki seçenekleri belirleyin: Test Süresi, Kat Edilen Toplam Mesafe ve Ortalama Hız. Listedeki diğer mevcut testler isteğe bağlıdır ve araştırmacının araştırmacı ilgisine bağlıdır.
   7. Deney sekmesinde, Ad bölümünün altındaki grup adını ve Hayvan Sayısı bölümüne grup başına düşen hayvan sayısını yazarak hayvanları test gruplarına göre atayın.
   8. Denemeyi çalıştırmak için Testler sekmesine geçin. Testi Başlat simgesine tıklayın ve tüm videolar analiz edilene kadar bekleyin.
   9. Lokomotor verilerini metin rapor formunda görüntülemek için Sonuçlar sekmesinde Raporu Görüntüle simgesine tıklayın.

Bu deney, 6-OHDA ile ICV mikroenjeksiyonunu takiben yetişkin zebra balığı yüzme davranışındaki değişiklikleri değerlendirdi. 6-OHDA'nın tercih edilen nörotoksin olarak kullanılmasının nedeni, ilgilenilen ventral diensefalon (Dn) ¹⁶ alanında DpN'nin spesifik ve hedefli ablasyonunu üreten kan-beyin bariyerini geçememesinden kaynaklanıyordu. Buradaki DpN alt popülasyonu, insanın substantia nigra pars ^{compacta31'indeki} DpN alt popülasyonuna anatomik benzerlik göstermektedir.

Önceki ^{çalışmamıza22} göre, 6-OHDA ICV mikroenjeksiyonunun yetişkin zebra balıklarının DpN'sine karşı hücresel etkisi, DpN marker-tirozin hidroksilaz (TH) immünohistoboyaması ile doğrulanmıştır. İlgilenilen ana beyin bölgesi, preoptik alan (POA), posterior tüberkülum (PT) ve hipotalamustan (Hyp) oluşan Dn idi. 99.96 mM 6-OHDA'nın, Dn'de en düşük TH-immünoreaktif (TH-ir) sayısına sahip yetişkin zebra balıklarının %100 sağkalım oranı ile sonuçlandığı bulunmuştur. Ayrıca Dn'deki TH-ir DpN'nin %85'inden fazlasının (p < 0.01) üçüncü gün postlezyonunda ablatif olduğu bulundu. TH-ir DpN sayısı daha sonra 30 günlük postlezyonda tam rejenerasyona ulaşmadan önce 14. gün postlezyonunda% 50'den fazla artmıştır (Şekil 3). Bu veriler, ablasyon sonrası yetişkin zebra balıklarının Dn'sindeki DpN alt popülasyonunun rejeneratif yeteneklerini ^{desteklemektedir32}.

Şekil 3: 99.96 mM 6-OHDA ile lezyona uğrayan zebra balıklarının Dn bölgesinde DpN'nin rejenerasyonu. (A) Dn bölgesinin üç ana bölgesinde, POA, PT ve Hyp'ta TH-ir DpN sayısı, dört veri noktası üzerinden: 99.96 mM 6-OHDA nörotoksini ile lezyondan sonraki sahte, 3, 14 ve 30 gün. Her çubuk, n = 6 bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini temsil eder; *p 0,05 <. (B) Sahte (I, I' ve I''), lezyonlamadan 3 gün sonra (II, II' ve II''), lezyonlamadan 14 gün sonra (III, III' ve III'') ve lezyonlamadan 30 gün sonra (IV, IV' ve IV'') TH (DpN; yeşil) ve DAPI (çekirdekler; mavi) ile boyanmış sagittal kesitli zebra balığı beyninin temsili konfokal mikroskop görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-fenilindol, 6-OHDA: 6-hidroksidopamin, Dn: diensefalon, DpN: dopaminerjik nöronlar, Hyp: hipotalamus, POA: preoptik alan, PT: posterior tüberkülum, SD: standart sapma ve TH-ir: tirozin hidroksilaz immünoreaktif. Vijayanathan et ^al.22'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Daha sonra, 6-OHDA ve sahte ICV mikroenjeksiyonunu takiben yetişkin zebra balıklarının kat edilen mesafedeki (cm) ve ortalama hızındaki (cm / s) değişiklikleri araştırmak için açık tank testini kullanarak lokomotor değerlendirmesi yaptık. Deneysel balıklar daha sonra üçüncü gün postlezyonunda (en az TH-ir DpN gözlenen sayı) ve 30. gün postlezyonunda (lezyon bölgesinde bildirilen tamamen restore edilmiş DpN) değerlendirildi. Zebra balıklarının yüzme davranışlarının bir video izleme yazılımı kullanılarak analizi, lezyonlu grubun üçüncü gün postlezyonunda ortalama hızının (cm / s) ve kat edilen mesafenin (cm) sahte ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede azaldığını (p < 0.001) % <45'e düştüğünü göstermiştir (Şekil 4). Lezyonlu grup, 30 günlük postlezyondan sonra motor fonksiyonun iyileşmesini sergiledi ve shamle karşılaştırıldığında hem ortalama hız (cm / s) hem de kat edilen mesafe (cm) arasında anlamlı bir fark yoktu.

Şekil 4: 6-OHDA ile intraserebroventriküler enjeksiyonu takiben yüzme davranışındaki değişiklikler. Yetişkin zebra balıklarının yüzme davranışı lezyondan önce, üçüncü gün ve 30. gün postlezyonunda 99.96 mM 6-OHDA ile değerlendirildi. Değerlendirilen parametreler şunları içeriyordu: (A) ortalama hız (cm / s) ve (B) kat edilen mesafe (cm). Her çubuk, altı balığın ortalama ± SD'sini temsil eder; p < 0.0001 (Öğrenci t-testi). Kısaltmalar: 6-OHDA: 6-hidroksidopamin, SD: standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, kurulan 6-OHDA kaynaklı, yetişkin zebra balığı bazlı PD modelinin lokomotor değerlendirmesini başarıyla göstermiştir. Tüm deney üç ana adımdan oluşuyordu: ICV öncesi mikroenjeksiyon preparatları, zebra balıklarının ICV mikroenjeksiyonu ve lokomotor değerlendirme. ICV mikroenjeksiyon prosedürünü takiben yetişkin zebra balıklarının sağlıklı bir şekilde iyileşmesini ve iyi deneysel sonuçları sağlamak için, bu çalışmada her adım için bazı iyi uygulamalar önerilmiştir.

ICV öncesi mikroenjeksiyon hazırlığı: Hayvan seçimi en iyi deneyden bir gün önce yapıldı. Cinsiyet belirlendi ve balığın uzunluğu ölçüldü. Standart uzunluğu 3.2-3.7 cm olan erkek yetişkin zebra balığı ayrı bir deney tankına yerleştirildi. Ek olarak, balıklar anestezi sırasında yetersizlikten kaçınmak için 24 saat açlık ^{süresinden geçmelidir33}. Dış stresi azaltmak ve zebra balıklarının iyileşme sürecine yardımcı olmak için deneyden önce ayakta duran bir su deposu kurulmuş bir balık tankı (dört duvarı beyaz kağıtla kaplı) hazırlanmalıdır. Tüm kimyasallar, zamanla hızla bozulabildikleri ve oda sıcaklığında kararsız hale gelebildikleri için her deneyin başlamasından önce taze olarak ^{hazırlanmıştır34,35}.

6-OHDA'nın mikroenjeksiyonu: Balıklara gereksiz yaralanma ve enfeksiyon bulaşmasını önlemek için zebra balıklarının temiz ve nazik bir şekilde kullanılması işlem boyunca yapılmalıdır. Balıklar ıslak bir süngerin üzerine yerleştirilmeli ve kurumasını önlemek için nemli bir durumda ^{tutulmalıdır36}. Zebra balığı kafatasını çatlatabilecek ekstra basınçtan kaçınmak için sert ve uygun kuvvete sahip steril bir iğne kullanılarak küçük bir kesi yapıldı. Bu kesi, mikrokılcal damarın beyin boşluğuna girmesine izin vermelidir. Mikrokapiller daha sonra iki yarımküre (telensefalon ve tektum) arasındaki giriş noktasından 1.200 μm derinliğe kadar indirildi (Şekil 1B, C). Giriş noktası, nöronların herhangi bir ek yırtılmasını önlemek için bu yarımküreler arasında ^seçildi37. Bu teknik bir mikroenjektörün kullanımını içeriyordu, 0.5 μL nörotoksin verilmesini sağlamak için teslimatın basıncı ve zamanlaması kalibre edilmelidir. Bu kalibrasyon, filtre kağıdı üzerinde oluşan damlacığın boyutu ölçülerek ^{gerçekleştirilebilir38}. Uygulamamız genellikle, sonraki her enjeksiyonda enjeksiyon yoğunluğunun düşürüldüğü aşağıdaki programlanabilir parametrelerin kurulumunu içeriyordu (enjeksiyon basıncı: 4000 hPa, enjeksiyon süresi: 0.3 s ve kompanzasyon basıncı: 10 hPa). Nörotoksinin beyin boşluğundan sızmasını önlemek için, mikrokılcal damarın enjeksiyonu ve geri çekilmesi arasında 20 s'lik bir aralık ^uygulandı35. Kılcal damarın küçük boyutu nedeniyle, mikrokılcal damar her enjeksiyondan sonra bloke edilebilir. Bu nedenle, tıkanıklığı gidermek ve enjeksiyon yoğunluğunun istenen 0.5 μL 6-OHDA hacmini elde etmek için yeterli olmasını sağlamak için mikrokapiler bir sonraki enjeksiyondan önce esasen yıkanmalıdır. Balıklar daha sonra 28 ± 1.0 ° C'de tutulan bir kurtarma tankına aktarılacaktı. Balık 30 saniye içinde iyileşemezse, kas hareketlerinin tamamen iyileşmesi gerçekleşene kadar solungaçlarını ve ağzını damıtılmış suyla yıkayın.

Lokomotor Değerlendirme: 6-OHDA kaynaklı yetişkin zebra balığı üzerinde iyi bir lokomotor değerlendirme sağlamak için, davranışsal çalışma her zaman noktası için aynı zaman dilimi içinde yapılmalıdır. Her davranışsal çalışma en az 2 dakikalık iklimlendirme süresine izin vermeli ve 4 saat ³⁹ içinde yapılmalıdır. Bu deney, zebra balığı bu dönemde daha aktif olduğu için sabahın erken saatlerinde sabah 8 ile akşam 12 arasında ^{gerçekleştirildi40}. Zebra balığı açık stres ve endişe belirtileri (donma ve düzensiz davranış) ile herhangi bir anormal davranış gösteriyorsa daha uzun bir iklimlendirme süresi ^gereklidir41. Bununla birlikte, önceki ve son kayıt grubunun yüzme davranışında tutarsızlık olmasını önlemek için, iklimlendirme 10 ^dakika30'u geçmemelidir. Açık alan testi için, en az 5 ila 30 dakika ^arasında değişen kayıtlar için herhangi bir boyut, renk, şekil ve dokuda bir deney tankı kullanılabilir42,43. Zebra balığı davranışı, çevresinin sıcaklığından büyük ölçüde etkilenir. 4 °C'den daha küçük dalgalanmalar yüzme hızını büyük ölçüde ^{etkileyebilir44}. Bu nedenle, deney tankındaki suyun sıcaklığı, ticari bir ısıtıcı kullanılarak 28 ± 1.0 ° C kontrollü bir sıcaklık altında kesinlikle muhafaza edilmelidir ve su seviyesi deney boyunca yaklaşık 12 cm derinlikte tutulmuştur. Tankın duvarları, test konusu ile deney alanı arasında kontrast oluşturmak ve test deneklerinden istenmeyen bir reaksiyona neden olabilecek dış uyaranları azaltmak için beyaz kağıtla ^{kaplanmıştır45}. Her gruptan balıklar, zebra balığı nörodavranışsal araştırmaları için mevcut standart uygulamaya uygun olarak ayrı ayrı test ^{edilmiştir23,37,46}. Zebra balıklarının sosyal etkileşimlere olan eğilimi göz önüne alındığında, test döneminde izolasyonun davranışlarını etkileyebileceğine dair endişeler ^vardır47. Bununla birlikte, mevcut deney düzeneği deneme başına maksimum 10 dakika ile sınırlandırılmıştır ve bu kısa izolasyon süresinin yetişkin zebra balıklarının lokomotor aktivitesi üzerinde herhangi bir etkisi olmadığı ^{bulunmuştur48}. Davranışsal çalışma için doğru veri toplamayı sağlamak amacıyla, değerlendirme, açık tank testi sırasında zebra balıklarının farklı deney gruplarından rastgele seçilmesiyle (yani, sahte ve 6-OHDA lezyonlu gruptan n = 6'ya kadar iki zebra balığı dönüşümlü olarak) ^{gerçekleştirilmiştir49}. Kaydedilen videolar, kemirgenlerin davranışsal takibi için yaygın olarak kullanılan bir video izleme sistemi kullanılarak analiz edildi. Zebra balığı gelişmekte olan bir hayvan modeli olduğundan, zebra balığı kullanılarak yapılan davranışsal testler genellikle kemirgenler hakkındaki yerleşik bilimsel literatürden ^{uyarlanmıştır50}. Burada, video izleme yazılımının zebra balıklarını deneysel arenada otomatik olarak izleme ve istenen parametreleri etkili bir şekilde hesaplama yeteneğini gösterdik. Video izleme yazılımı, yazılım tarafından desteklenen video dosyalarının çeşitliliği, düzenli güncelleme paketi sürümleri ve farklı işletim sistemleri için sağlanan destek nedeniyle mevcut diğer yazılımlardan ^{ayrılıyordu51}.

Mevcut hayvan bazlı PD modellerinin sınırlamalarından biri, insan beyninin substantia nigra pars compacta'sında dopaminerjik nöronal kayıptan sonra gözlenen motor bozukluğu taklit eden mekanik benzerliklerin ^{olmamasıdır52}. Bununla birlikte, yetişkin zebra balığı bazlı PD modelinin ortaya çıkması, bu özel sınırlamayı ele alabilir. Bu çalışmada gözlemlendiği gibi, azalan yüzme hızı, önceki hücresel bulgularımıza karşılık geldi ve 6-OHDA kaynaklı yetişkin zebra balığı modelinin ventral diensefalonunda% 85'ten fazla dopaminerjik nöronal kayıp, üç günlük ^postlezyon22. Bu ilgi alanındaki dopaminerjik nöronların spesifik ablasyonunun, beyinden gelen inen motor sinyalini bozmak ve harekette yavaşlığa neden olmak için gerekli olduğu ^{görülmektedir53}. Örneğin, optik tektumda (giriş noktası) 6-OHDA'nın ICV enjeksiyonunu gerçekleştiren L. J. Caldwell ve ^ark.23, zebra balığı sürüsü ve çiftleşme davranışında sadece değişiklikler gözlemlemiştir. Ventral Dn'de DpN'nin ablasyonu çok önemlidir, çünkü yetişkin zebra balıklarının Dn'sindeki DpN popülasyonu, zebra balığı motor nöronları için tek dopamin kaynağı olarak işlev görür. Bu, insan substantia ^nigra54'e benzer. Bu çalışma ayrıca, lezyonlu zebra balığı tarafından daha sonraki postlezyon zaman noktalarında daha hızlı yüzme hızı ve daha uzun mesafe kat edildiğini gözlemleyerek, zebra balığı yüzme davranışını yöneten dopamin sinyalinin devam ettiğini ve nihayetinde tam restorasyonunu göstermiştir. Bu bulgular böylece, yeni yenilenen dopaminerjik nöronların lezyonlu yetişkin zebra balıklarında fonksiyonel aktivitelerini yeniden kazanma yeteneklerini doğruladı.

6-OHDA'nın mevcut uygulama yolu, mikrokapilerin beynin derinliklerine, ventral Dn'nin lezyon alanına doğru yerleştirilmesini gerektiren hafif invaziv bir enjeksiyon paradigmasını içeriyordu. Bu yöntem, periferik enjeksiyona kıyasla biraz zahmetlidir ve enjeksiyon sonrası ölüm riskini azaltmak için balık başına 3 dakika içinde yapılması gerekir. Bu nedenle, yöntemin hedeflenen bölgede (Dn) kritik süre içinde gerçekleştirilebilmesini sağlamak için önceden ICV enjeksiyonu uygulaması gereklidir. Yetişkin zebra balıklarının geçerli bir lokomotor değerlendirmesini elde etmek için, açık tank testi günde sadece 4 saatlik değerlendirme süresi ile sınırlıdır. Bu nedenle, kurulumun her kayıt için minimum gereksinimleri (örneğin, sıcaklık ve su derinliği) karşıladığından emin olmak için ekstra zaman ayrılması gereken çok sayıda hayvanı içeren deneysel bir çerçevede önceden planlama yapılması gerekmektedir. Bu planlama, mevcut çalışmanınki gibi zamana dayalı deneylerde özellikle çok önemlidir, çünkü her kaydın amaçlanan zaman noktasında yapılması gerekir. Mevcut deney düzeneği, zebra balığı motor fonksiyonunu özel olarak değerlendiren iki yüzme parametresinin incelenmesiyle sınırlıydı. Bununla birlikte, sürüleşme ve anksiyete benzeri davranış gibi diğer davranışsal parametreler, diğer deney düzeneklerini ve farklı analitik yöntemleri gerektirmiştir. Özetle, bu, PD'ye karşı hücre replasman tedavi stratejileri hakkında önemli bilgiler verebilecek 6-OHDA kaynaklı yetişkin zebra balıklarında DpN nörorejenerasyon sürecini incelemek için tekrarlanabilir ve yararlı bir yöntemdir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, Malezya Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından Temel Araştırma Hibe Programı [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)] kapsamında desteklenmiştir.