Bu protokol kıkırdakta katyonik peptid taşıyıcıları için denge alımını, penetrasyon derinliğini ve non-denge difüzyon oranını belirler. Taşıma özelliklerinin karakterizasyonu etkili bir biyolojik yanıt sağlamak için çok önemlidir. Bu yöntemler, negatif yüklü dokuları hedeflemek için en uygun ücrete uygun bir uyuşturucu taşıyıcısı tasarlamak için uygulanabilir.

Vücuttaki kıkırdak gibi çeşitli negatif yüklü dokular, negatif yüklü aggrecans yüksek yoğunluklu nedeniyle hedeflenen ilaç teslim için bir bariyer mevcut ve bu nedenle, onların terapötik tepkiyi artırmak için geliştirilmiş hedefleme yöntemleri gerektirir. Kıkırdak yüksek negatif sabit yük yoğunluğuna sahip olduğundan, ilaçlar elektrostatik etkileşimlerden yararlanmak için pozitif yüklü ilaç taşıyıcıları ile değiştirilebilir, gelişmiş intra-kıkırdak ilaç taşıma için izin. Bu nedenle, uyuşturucu taşıyıcılarının taşınmasının incelenmesi, biyolojik bir tepkinin neden olduğu ilaçların etkinliğini tahmin etme de son derece önemlidir. Kıkırdak ekspertizlerinde katyonik peptid taşıyıcılarının denge alımını, penetrasyon derinliğini ve denge selektifüzyon hızını ölçebilen üç deney tasarımını gösteriyoruz. Denge alım deneyleri, kıkırdaktaki ilaçların terapötik konsantrasyonunu artırmada bir ilaç taşıyıcısının potansiyelini tahmin etmek için yararlı olan, çevredeki banyoya kıyasla, kıkırdak içindeki çözünür konsantrasyonunun bir ölçüsünü sağlar. Konfokal mikroskopi ile yapılan penetrasyon çalışmalarının derinliği, 1D çözünür difüzyonun yüzeyselden kıkırdağın derin bölgesine kadar görsel olarak temsil edilmesine olanak sağlar, bu da solutelerin matris ve hücresel hedef bölgelerine ulaşıp ulaşmadığını değerlendirmek için önemlidir. Özel olarak tasarlanmış bir taşıma odası kullanılarak yapılan denge dışı difüzyon oranı çalışmaları, floresan olarak etiketlenmiş solutelerin doku boyunca difüzyon oranlarını karakterize ederek doku matrisi ile bağlayıcı etkileşimlerin gücünün ölçülmesini sağlar; bu kıkırdak ile optimum bağlama gücü taşıyıcıları tasarımı için yararlıdır. Birlikte, üç taşıma deneylerinden elde edilen sonuçlar, ilaç dağıtım uygulamaları için zayıf ve geri döndürülebilir şarj etkileşimlerinden yararlanan en iyi şekilde şarj edilen uyuşturucu taşıyıcılarının tasarlanması için bir kılavuz sağlamaktadır. Bu deneysel yöntemler, uyuşturucu ve uyuşturucu taşıyıcı konjugatlarının taşınmasını değerlendirmek için de uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntemler menisküs, kornea ve vitreus mizah gibi diğer negatif yüklü dokuların hedef alınmasında kullanım için uyarlanabilir.

Vücutta negatif yüklü dokulara ilaç teslimi hücre ve matris hedef sitelere ulaşmak için doku içine nüfuz etmek için ilaçların yetersizlik nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir¹. Bu dokuların bazıları doku içinde yüksek negatif sabit yük yoğunluğu (FCD)² oluşturmak ve en^{makromoleküllerin}teslimi için bir engel olarak hareket yoğun paketlenmiş, negatif yüklü agrecans oluşur 3^,4. Ancak, pozitif yüklü ilaç taşıyıcılarının yardımıyla, bu negatif yüklü doku bariyeri aslında sürekli ilaç^{teslimi 1},^5,,6,7(Şekil 1)için elektrostatik yük etkileşimleri yoluyla bir ilaç deposuna dönüştürülebilir.

Şekil 1: CpC'lerin şarj bazlı kıkırdak içi teslimi. Diz eklemi alanına Eklem içi enjeksiyon. Pozitif yüklü TBM'ler ile negatif yüklü agrega grupları arasındaki elektrostatik etkileşimler kıkırdak yoluyla hızlı ve tam derinlikte penetrasyon sağlar. Bu rakam Vedadghavami ve ark⁴değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son zamanlarda, kısa uzunlukta katyonik peptid taşıyıcıları (CpCs) negatif yüklü kıkırdak teslim için büyük boyutlu terapötik taşıma kapasitesine sahip küçük katyonik etki alanları oluşturma amacı ile tasarlanmıştır⁴. Yaygın^8,,9 ve osteoartrit gibi dejeneratif hastalıkların tedavisi için kıkırdak etkili ilaç teslimi için (OA)¹⁰, bu ilaçların terapötik konsantrasyonları doku içinde derin nüfuz kritiktir, kıkırdak hücrelerinin çoğunluğu (konkolitler) yalan¹¹. Mevcut çeşitli potansiyel hastalık modifiye ilaçlar olmasına rağmen, bu etkili kıkırdak 12 ,^,13hedef mümkün değildir, çünkü hiçbiri FDA onayı kazanmıştır.¹² Bu nedenle, terapötik yanıt ın indüklemede ilaçların etkinliğini tahmin etmek için uyuşturucu taşıyıcılarının taşıma özelliklerinin değerlendirilmesi gereklidir. Burada, denge alımını, penetrasyon derinliğini ve CpCs^4'ündenge dışı difüzyon oranını değerlendirmek için kullanılabilen üç ayrı deney tasarladık.

En iyi terapötik yanıt sağlayabilir kıkırdak içinde yeterli bir ilaç konsantrasyonu olduğundan emin olmak için, uptake deneyler kıkırdak denge CPC konsantrasyonu ölçmek için tasarlanmıştır⁴. Bu tasarımda, kıkırdak ve çevresindeki banyo arasındaki dengeyi takiben, kıkırdak içindeki toplam solute miktarı (matrise bağlı veya serbest) alım oranı kullanılarak belirlenebilir. Bu oran, kıkırdak içindeki solutelerin konsantrasyonunun denge banyosuna normalleştirilmesi yle hesaplanır. Prensip olarak, kıkırdak yoluyla difüzyon şarj etkileşimleri ile desteklenmez nötr solutes, daha az bir alım oranı olurdu 1. Tersine, taşınması elektrostatik etkileşimler yoluyla geliştirilmiş katyonik solutes, 1'den büyük bir alım oranı gösterir. Ancak, TBM'lerde gösterildiği gibi, optimal pozitif yük kullanımı çok daha yüksek alım oranlarına (300'den büyük)⁴neden olabilir.

Kıkırdak içinde yüksek ilaç konsantrasyonu terapötik yarar elde etmek için önemli olmasına rağmen, aynı zamanda ilaçların kıkırdak tam kalınlığı ile yayılır önemlidir. Bu nedenle, penetrasyon derinliğini gösteren çalışmalar, ilaçların kıkırdak içinde derinlere ulaşmasını sağlamak için gerekli olup, böylece matris ve hücresel hedef bölgelere ulaşılabilmekte ve böylece daha etkili bir tedavi sağlanmaktadır. Bu deney, solutelerin kıkırdak yoluyla tek yönlü difüzyonu değerlendirmek ve in vivo intra-artiküler enjeksiyonsonrasında kıkırdak içine ilaç difüzyonu simüle etmek için tasarlanmıştır. Konfokal mikroskopi ile floresan görüntüleme kıkırdak içine penetrasyon derinliği nin değerlendirilmesi için izin verir. Net parçacık yükü, derin ilaçların matris boyunca nasıl yayılabilir moderating önemli bir rol oynar. Katyonik parçacıklar ve anyonik doku matrisi arasındaki zayıf-geri dönüşümlü bağlanma etkileşimlerine izin vermek için fcd dokusuna dayalı optimal bir net yük gereklidir. Bu, herhangi bir etkileşimin parçacıkların matristen kopabilmesi için yeterince zayıf olduğu anlamına gelir, ancak doğada geri döndürülebilir, böylece doku içinde daha derin bir matris bağlama bölgesine bağlanabilir^4. Tersine, çok güçlü matris bağlama kıkırdağın yüzeysel bölgesinde ilk bağlama sitesinden parçacıkların ayrılmasını önler gibi, bir parçacığın aşırı pozitif net yük difüzyon doğru zararlı olabilir. Bu hedef sitelerin çoğunluğu doku¹¹içinde derin yalan olarak yetersiz bir biyolojik yanıt neden olur.

Bağlayıcı etkileşimlerin gücünü daha fazla ölçmek için, kıkırdak yoluyla ilaç difüzyon oranlarının analizi avantajlıdır. Non-denge difüzyon çalışmaları farklı solutes arasında gerçek zamanlı difüzyon oranlarının karşılaştırılması için izin verir. İlaçlar kıkırdağın yüzeysel, orta ve derin bölgelerinden yayıldıkça, bağlayıcı etkileşimlerin varlığı difüzyon oranlarını büyük ölçüde değiştirebilir. İlaçlar ve kıkırdak matrisi arasında bağlayıcı etkileşimler mevcut olduğunda, etkili difüzivite (D_EFF)olarak tanımlanır. Bu durumda, tüm bağlayıcı bölgeler işgal edildikten sonra, ilaçların difüzyon oranı sabit durum difüzyonu (D_SS)tarafından yönetilir. Farklı solute D_EFF arasındaki karşılaştırma matris ile solutes göreli bağlama mukavemeti belirler. Belirli bir çözüniçin, D_EFF ve D_SS büyüklük aynı sırada ise, bu difüzyon sırasında ilaç ve matris arasında minimal bağlayıcı mevcut olduğunu ima eder. Ancak, D_EFF D_SS'denbüyükse, parçacıkların matrislere önemli ölçüde bağlanması vardır.

Tasarlanan deneyler ayrı ayrı kıkırdak yoluyla çözünür taşıma karakterizasyonu için izin, ancak, tüm sonuçları kapsayıcı bütünsel bir analiz en iyi ücret uyuşturucu taşıyıcı tasarımı için gereklidir. Şarj etkileşimlerinin zayıf ve geri dönüşümlü doğası parçacık difüzyon hızını kontrol eder ve kıkırdak yoluyla yüksek denge alımı ve hızlı tam derinlik penetrasyonu sağlar. Denge alım deneyleri ile, non-denge difüzyon hızı çalışmaları kullanılarak doğrulanabilir şarj etkileşimleri sonucunda yüksek alım gösteren taşıyıcılar aramak gerekir. Ancak, bu bağlayıcı etkileşimler kıkırdak yoluyla çözünür tam kalınlıkta penetrasyon sağlamak için doğada zayıf ve geri dönüşümlü olmalıdır. İdeal bir ilaç taşıyıcı alımı ve yüksek intra-kıkırdak ilaç konsantrasyonları için yeterince güçlü bağlayıcı sağlayan optimal bir şarj sahip olacak, ama tam kalınlıkta difüzyon engel olarak çok güçlü değil⁴. Sunulan deneyler, ilaç taşıyıcılarını hedef alan şarj tabanlı dokuların tasarım özelliklerine yardımcı olacaktır. Bu protokoller kıkırdak⁴ile TBM taşımacılığı karakterize için kullanılmıştır, Ancak, bu da kıkırdak ve diğer negatif yüklü dokular yoluyla ilaç ve ilaç taşıyıcıları çeşitli uygulanabilir.

Ölü dokularla yapılan deneylerin yapılması için üniversite onayı alındı. Büyükbaş hayvanlar ticari olarak bir mezbahadan elde edilebildi.

1. Kıkırdak ekstrektifi ekstraksiyonu

1. Bir neşter kullanarak (#10 bıçak), kesme ve yağ kaldırmak, kaslar, ligamentler, tendonlar ve sığır diz eklemleri femoropatellar oluk kıkırdak ortaya çıkarmak için diğer tüm bağ dokusu.
2. 3 mm ve 6 mm dermal zımba kullanarak, silindirik fişleri ayıklamak için kıkırdak içine dik yumruklar yapmak. Fişleri hemen %1 v/v antibiyotik antimikotik ile desteklenen ve %1 v/v antibiyotik antimikotik ile desteklenen 500 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 48 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına yerleştirin.
3. Bir kıkırdak fişinin yüzeysel tarafını dilimleme armatüründe bir kuyuya doğru yerleştirin(Şekil 2). Bir jilet kullanarak, yüzeysel bölge dahil 1 mm kalınlığında kıkırdak ekstrplant elde etmek için dilimleme fikstür yüzeyi boyunca fişi dilimleyin. Her kıkırdak fişi için tekrarlayın.
4. -20 °C'de 500 μL 1x PBS içeren polipropilen tüplerde kıkırdak ekspertonları ayrı ayrı depolayın.
5. Aşağıdaki taşıma deneylerinin her birini gerçekleştirmeden önce, eksplant içeren şişeleri 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dk boyunca eritin.

Şekil 2: Özel olarak tasarlanmış dilimleme armatürü. 3 ve 6 mm çapındaki kıkırdak ekskilere dilimleme için kullanılan paslanmaz çelik dilimleme armatürlerinin tasarım parametreleri. Dilimlenmiş eksponerlerin kalınlığını ayarlamak için kuyuların içine farklı kalınlıkta plastik kesici uçlar yerleştirildi. <1 mm çapında paslanmaz çelik silindirik pim, eksplantın fikstürden dışarı itilen kısmı için kullanılmıştır. Tüm sayısal değerler mm. bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Kıkırdakta KTK'ların denge alımı

1. Xırtıcı eksplantı (3 mm dia. X 1 mm kalınlığında.) ilave yüzeyinden fazla 1x PBS'yi çıkarmak için hassas bir görev silme ile yavaşça dab kıkırdak eksplantları (3 mm dia. X 1 mm kalınlığında.) Bir denge kullanarak, hızlı bir şekilde her explant ıslak ağırlığı kaydetmek ve sonra hemen dehidratasyon önlemek için 1x PBS banyo yerleştirin.
2. 1x PBS-PI'de floresan etiketli CPC'lerden 30 μM 'lik (ekstrper başına 300 μL) çözüm hazırlayın. Yeniden yapılanma için RNase içermeyen polipropilen tüplerkullanın.
3. 96 kuyulu bir plakada, her 30 μM TBM çözeltisinin 300 μL'si ayrı kuyulara dönüştürülür. Buharlaşmayı önlemek için plakanın kenarına yakın kuyular kullanmaktan kaçının. Bir spatula kullanarak, kuyuiçeren çözelti için her explant aktarın.
4. Çevredeki kuyuları 300 μL 1x PBS ile doldurun ve kuyu plakasını kapakla kapatın. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarını esnek bir filmle kapatın.
5. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinin içine, parçacık sedimantasyonunu sınırlamak için plakayı bir plaka çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Kıkırdakta CpC'lerin denge alımına izin vermek için hafif rotasyon (15 mm yörüngeile 50 rpm) altında 24 saat kuluçka(Şekil 3).
6. Floresan ile TBM konsantrasyonu arasındaki korelasyon için standart bir eğri oluşturma
   1. Polipropilen tüplerde 1x PBS-PI'de 30 μM – 0 μM (10 2 kat seyreltme) cpc çözeltilerinin seri seyreltmelerini hazırlayın. Her seyreltmenin en az 500 μL'si mevcut olduğundan emin olun.
   2. Siyah 96 kuyuluktaki ardışık kuyulara her seyreltmenin 200 μL'sini ekleyin. Örnek boyutunu artırmak için başka bir satırda çoğaltın.
   3. Floresan etiketin uyarma ve emisyon dalga boylarında bir plaka okuyucusu kullanarak her numunenin floresan okumalarını elde edin.
   4. Çizim floresan okuma vs CPC konsantrasyonu ve eğrinin doğrusal kısmı için bir denklem türetmek.
      NOT: Floresan okumalarında değişkenliği sınırlamak için, Standart eğrinin üretilmeden önce TBM stok çözeltisini numune plakası ile aynı koşullar altında kuluçkaya yatırın.
7. Kuluçka 24 saat sonra, ayrı polipropilen tüpler her kuyudan denge banyosu toplamak.
8. Her çözeltinin 200 μL'sini siyah 96 kuyunun ayrı kuyularına aktarın. Standart eğri yle aynı floresan ayarları altında her numunenin floresan okumalarını alın. Gerekirse, okumaların standart eğrinin doğrusal kısmına düşmesini sağlamak için numuneyi 1x PBS-PI olarak seyreltin.

Şekil 3: Denge alım deneylerinin şeması. Kıkırdak ekspları (3 mm dia. x 1 mm kalınlığında) floresan etiketli TBM çözeltisi içeren 96 kuyulu bir plakaya yerleştirildi. 24 saat Sonra CpCs kıkırdak tarafından, böylece çevredeki banyo floresan azaltarak yükseltildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Kıkırdak tabir derinliği

1. 1x PBS-PI'de floresan etiketli CPC'lerden 30 μM 'lik (ekstrper başına 300 μL) çözüm hazırlayın. Yeniden yapılanma için RNase içermeyen polipropilen tüplerkullanın.
2. Yarım diskler yapmak için bir neşter kullanarak, yarı yarıya kıkırdak eksplants (6 mm çapında x 1 mm kalınlığında) kesme. Kesme sırasında eksplant1x PBS-PI tabakası ile sulu tutun.
3. Bir epoksi kullanarak özel olarak tasarlanmış 1 boyutlu taşıma odasının bir kuyunun ortasına yarım disk eksplant yapıştırın (Şekil 4, Şekil 5). Epoksi ekstrandancın çevresel (kavisli) tarafına uygulandığından emin olun. Kıkırdak difüzyon yüzey alanı ile temas önlemek için kuyudan fazla tutkal çıkarın ve ekstrenin yüzeysel tarafında bir not yapmak.
4. Ekstryenin her iki tarafına 80 μL 1x PBS-PI ekleyin. Pipette the liquid up and down from one side of the explant to check for leakage to the other side. Sızıntı oluşursa, yeniden ekstrekti ve gerektiği gibi epoksi uygulayın.
5. 1x PBS-PI'yi kıkırdağın yüzeysel yüzeyine bakan taraftan (yukarı akım) 80 μL 30 μM CPC çözeltisi ile değiştirin. Kıkırdağın (aşağı) derin bölgesine bakan tarafta 80 μL 1x PBS-PI koruyun.
6. Taşıma odasını dikkatlice kapatılabilir bir konteynerin içinde yerleştirin. Çözeltilerin buharlaşmasını önlemek için kabın tabanını bir katman 1x PBS ile kapatın. Yukarı ve aşağı odalarından gelen çözümler arasında doğrudan temas olmadığından emin olun.
7. Partikül sedimantasyonunu sınırlamak için kapalı kabı bir tabak çalkalayıcıüzerine yerleştirin. Hafif rotasyon (15 mm yörünge ile 50 rpm) altında oda sıcaklığında 4 veya 24 saat için kuluçka.
8. Kuluçkadan sonra eksplantı hazneden çıkarın ve eksplantın merkezinden ~100 μm dilim kesti.
   NOT: Bu kesit kıkırdağın yüzeysel, orta ve derin bölgelerini kapsatır.
9. Dilimi cam bir kaydırak ile kapak kayması arasına yerleştirin. Dilimi 1x PBS-PI tabakası ile nemlendirin.
10. 10x büyütme, bir konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntüleri z-yığın elde etmek için dilimin tam kalınlığı ile görüntü.
11. ImageJ kullanarak kıkırdak CpCs penetrasyon derinliğini belirlemek için z-yığını içinde görüntülerin ortalama yoğunluğunu yansıtın.
    1. Dosya'ya tıklayarak resim yığınını açın | Aç.
    2. Görev çubuğundaki 'Resim''e tıklayın ve Resim'e tıklayın | Yığınlar | Açılır menüden Z Projesi.
    3. Dilim numaralarını 1'den son dilime giriş leyin. Projeksiyon Türü altında 'Ortalama Yoğunluk' seçin. 'Tamam'ıtıklatın .'

Şekil 4: Özel olarak tasarlanmış 1-B taşıma odası. 6 ayrı kuyulu PMMA 1D taşıma odasının tasarım parametreleri. Tüm sayısal değerler mm. bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Penetrasyon derinliği çalışmalarışeması. Kıkırdak eksültörleri (6 mm çapında x 1 mm kalınlık) ikiye bölündü ve 1-D difüzif taşıma kuyularının ortasına sabitlendi. Floresan etiketli TBM çözeltisi kıkırdağın yüzeysel bölgesi (SZ) ile temas halinde kuyunun yan tarafına eklendi. 1x PBS-PI kıkırdağın derin zonu (DZ) ile temas kuyunun yan eklendi. Difüzyondan sonra, kıkırdak kesiti (3 mm x 1 mm) konfokal mikroskopi ile görüntülendi. Bu rakam Vedadghavami ve ark.⁴ ve Bajpayee ve ark.³bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınızdeğiştirilmiştir.

4. Kıkırdaktaki KBM'lerin denge dışı difüzyon hızı

1. Özel olarak tasarlanmış taşıma odasının iki yarısı(Şekil 6)bir araya getirin ve odayı kapatın. Bir anahtar ile hazneyi sıkıca kapatmak için yıkama, somun ve cıvata kullanın.
   NOT: Taşıma odası floresan okumalara müdahale etmeyecek şekilde yarı saydam olmalıdır. Bu protokolde kullanılan taşıma odaları polimetilmetakrilat (PMMA) yapılır.
2. 1x PBS 'de (her oda için 2 mL) 15 dk boyunca %0,5 w/v yağsız büyükbaş süt çözeltisi ile odanın iç alanını 15 dk boyunca katlayın ve CpC'lerin oda duvarlarına spesifik olmayan bağlanmasını önleyin. Daha sonra 1x PBS (her oda için 2 mL) ile odayı durulayın.
3. Özel olarak tasarlanmış dilimleme armatürü(Şekil 2)ve jilet kullanarak, yüzeysel bölge dahil 500-800 μm kalınlığında 6 mm çapında kıkırdak ekstrplant (enine düzlem) dilim. Explant 1x PBS ile sulu tutun.
4. Çekiç tahrikli ve dermal zımbakullanarak, Şekil 7'degösterildiği gibi kauçuk levhalardan contalar oluşturun.
5. Her yarım taşıma odasını 1 büyük kauçuk conta, 1 PMMA kesici uç ve her biri 1 küçük kauçuk conta içerecek şekilde monte edin. Yüzeysel bölge yukarı oda bakan plastik eklemek kuyularında ekstrüzyon. Sandviç birlikte montaj tamamlamak ve sıkıca bir anahtar kullanarak vida iki yarısı(Şekil 7).
6. Yukarı daki hazneyi 2 mL 1x PBS-PI ile doldurun ve yukarı akış odasından sıvı sızıntısı için aşağı akış odasını gözlemleyin. Sızıntı varsa, conta konumunu ve vidaların sıkılığını ayarlayarak hazneyi yeniden monte edin. Sızıntı yoksa, aşağı daki hazneyi 2 mL 1x PBS-PI ile doldurun.
7. Yukarı ve aşağı odaları hem de bir mini karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakası üzerinde oda yerleştirin. Spektrofotometreden gelen lazerin aşağı odanın merkezine doğru odaklandığı odayı hizalayın. Spektrofotometrenin sinyal alıcısı kısmını aşağı akış odasının arkasına yerleştirin (Şekil 8).
   NOT: Spektrofotometrenin lazeri ve alıcısı floresan etiketli proteinden gelen sinyalleri heyecanlandırmak, yaslamak ve iletmek için uygun filtrelerle donatılmalıdır. Floresan sinyaline müdahaleden kaçınmak için deneme sırasında kara kutu kullanarak taşıma odasını ışıktan koruyun. Buharlaşmayı önlemek için odanın üzerine açıklıkları esnek filmle kapatmak en iyi uygulamadır.
8. Gerçek zamanlı akış aşağı floresan emisyon okumaları toplamak ve en az 5 dakika için istikrarlı bir sinyal sağlamak.
   NOT: Alt bölmeden aliquots elde edilebilir ve bir plaka okuyucu kullanılarak floresan için değerlendirilebilir özel olarak tasarlanmış spektrofotometre veya yarı saydam taşıma odası mevcut değilse.
9. Pipet, floresan etiketlenmiş CpC'lerin önceden hesaplanmış bir stok çözeltisi hacmi, yukarı akış odası içinde 3 μM'lik son konsantrasyonu sağlamak için yukarı doğru odaya aktarır. Aşağı floresan sinyalini gözlemleyin ve solute transport'un eğimde sabit bir artışa ulaşmasını bekleyin.
   NOT: Daha kalın bir kıkırdak ekstrektinde sabit duruma ulaşmak için daha uzun zaman gerekir.
10. Sabit duruma ulaşıldıktan sonra, yukarı akış odasından 20°L alın ve akış odasına ("başak testi") ekleyin.
    NOT: Akıntının aşağısında bir artış gözlenecektir. Bu floresan okumaları ve TBM konsantrasyonu arasında korelasyon sağlayacaktır.
11. Gerçek zamanlı aşağı floresan okumaları toplayın.

Şekil 6: Özel olarak tasarlanmış non-denge difüzyon taşıma odası. PMMA non-denge difüzyon taşıma odasının tasarım parametreleri. Oda floresan okumaları müdahale etmeyecek şekilde yarı saydam olmalıdır. Tam taşıma odası, gösterilen fikstürün iki özdeş yarısından oluşuyordu. Haznenin yarısının hizalanmasını ve tamamen kapanmasını sağlamak için iki silindirik paslanmaz çelik pim (~2,94 mm çapında, ~18 mm uzunluğunda) gerekiyordu. 6-32 iplik vidaları için dört özdeş yuva vida sıkı montaj için haznenin her köşesinde yapılmıştır. Tüm sayısal değerler milimetre cinsinden sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Denge olmayan difüzyon taşıma odasının montajı. Tasarım parametreleri (A) siyah PMMA kesici uçlar ve (B) büyük ve küçük kauçuk contalar. Kauçuk contaların kalınlığı, haznenin sıkı kapanmasını sağlayacak şekilde ayarlandı. Tüm sayısal değerler mm. (C) Şematik olarak, merkeze yerleştirilen kıkırdak ekstrandası ile taşıma odasının iki yarısı için montaj sırasını gösteren şematik olarak sunulur. SZ yukarı oda bakan kıkırdak yüzeysel bölge gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Denge selfüzyon deneyleri şeması. Kıkırdak eksültöyörleri (6 mm çapında x 1 mm kalınlık) yukarı akım haznesine bakan yüzeysel yüzeyi ile taşıma odasının ortasına yerleştirildi. Odanın yukarı ve aşağı tarafları 1x PBS-PI ile dolduruldu ve mini bir karıştırma çubuğu kullanılarak karıştırıldı. Floresan okumaları toplamak için aşağı bölmeye doğru işaret edilen bir lazer ile floresan etiketli TBM çözeltisi yukarı bölmeye eklenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kıkırdak tarafından CpCs denge emilimi sonrasında, solute doku tarafından yukarı alındığında banyo floresan azalır. Ancak, son banyonun floresan değeri baş harfine benzer kalırsa, bu, en az çözünür alım Olmadığını gösterir. Solute alımıbaşka bir onay doku gözle görülür floresan boya rengi renk değiştirmiş olmasıdır. Kıkırdaktaki solutelerin kantitatif alımı floresan değerleri standart eğri kullanılarak konsantrasyona dönüştürüldükten sonra alım oranı (R_U)kullanılarak belirlendi. İlk banyo konsantrasyonu (C_Bath,i)ve denge banyo konsantrasyonu (C_Banyosu)kullanılarak kıkırdak içindeki solute konsantrasyonu (C_{Kıkırdağı)}V_Bath=300 μL'de aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır:

C_Kıkırdak ve C_Banyosukullanılarak, alım oranı aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenmiştir.

Değerler >>1, şarj etkileşimleri nedeniyle artan alımı gösterirken, değerler <1 düşük alım olduğunu gösterir. Örneğin, Neutravidin (60 kDa, pI 7) gibi daha büyük, nötr solutes kıkırdak matris¹ile steric engel nedeniyle R_U<1 göstermiştir, daha küçük, nötr solutes R_U~ 1 göstermek için bekleniyor, onlar kıkırdak içine yayılabilir gibi, denge ulaşan. Buna karşılık, Avidin (pI 10.5), Nötrravidin olumlu yüklü meslektaşı, kıkırdak¹bir R_U~ ~ 180 göstermiştir. Ayrıca, küçük boyutlu TBM'ler (~2,5-4 kDa) 400^4'ekadar bir R_U gösterir. Şekil 9'dagösterildiği gibi, alım oranları ücrete bağlı bir yanıt^{gösterdi 4}.

Şekil 9: Kıkırdakta KTK'ların denge alımının temsili sonuçları. Değişen net yük (+8, +14 ve +20) ve kıkırdaktaki ilgili alım oranları, artan şarjla monoton olarak artış göstermediğini ortaya koymuştur. Bu rakam Vedadghavami ve ark.⁴bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın değiştirilmiştir.

Banyonun floresandengesi dengeye ulaştıktan sonra artmış olması durumunda, bu floresan etiketli solute ilk banyo konsantrasyonu çok yüksek olduğunu gösterir. Bu, plaka okuyucu aracılığıyla uyarma sonrasında emisyonun çözelti içinde sıkışıp kalmasına neden olur. Bu sorunu çözmek için, ilk banyo konsantrasyonu düşürün.

Konfokal görüntülemenin ardından, her görüntüde, farklı kıkırdak katmanlarında floresan etiketli KBM'lerin nüfuz derinliğini gösteren bir görüntü yığını üretildi. Kıkırdak ekstrünün merkezinden elde edilen görüntü, ekstrenin kalınlığı boyunca diğer görüntülere göre en uzak penetrasyon derinliğini göstermiştir. ImageJ gibi bir yazılım kullanarak, görüntü yığını TBM penetrasyon ortalama yoğunluğunu gösteren bir görüntü üretmek için overlaid oldu. Bu overlaid görüntüler çeşitli şarj uyuşturucu taşıyıcıları arasında penetrasyon genel derinliği en iyi karşılaştırma sağladı. Doku içindeki KBM'ler için yüke bağlı bir yanıt gözlenmiştir(Şekil 10). Büyük nötr yüklü taşıyıcılar (örneğin, Nötrravidin) matris¹ile bağlama yı ğüstlemek için yük etkileşimlerini kullanma yeteneğinden yoksun oldukları için yüzeysel bölgeden çok daha uzağa nüfuz etmeyecektir. Benzer şekilde, çok yüksek bir pozitif yük yüzeysel bölge ile sınırlı olacaktır (CPC +20 tarafından gösterildiği gibi 24 saat sonra bile)⁴, ancak, bu taşıyıcı matris çok güçlü bağlı olmanın bir sonucudur; ilk hedeflerinden çıkaramazlar. Bir optimal ücret uyuşturucu taşıyıcı, ancak, elektrostatik etkileşimlerin zayıf ve geri dönüşümlü doğası yararlanabilir gibi kıkırdağın derin bölgelerine nüfuz etmek mümkün olacaktır (CPC +14 gösterildiği gibi)⁴. Bu taşıyıcı ilk hedefine bağlamak için izin verir, matris boyunca daha derin hareket etmek için unbind, ve daha sonra doku içinde daha fazla hedeflere tekrar bağlamak. Örneğin, Avidin (~7 nm çapı, 66 kDa, pI 10.5) negatif yüklü matris glikozaminoglikanlar (GAGs) ile bağlayıcı bir ayrışma sabiti (K_D) 150 μM, tam kalınlık penetrasyonu için gerekli geri dönüşümlü bağlama sağlamak için yeterince zayıf olduğu kabul edildi¹. Zayıf bağlayıcılığa rağmen, Avidin negatif yüklü GAGs yüksek yoğunluklu varlığı nedeniyle kıkırdak yüksek tutma ve alım gösterdi (Bağlayıcı yoğunluğu N_T = 2900 μM)¹. Ayrıca, CPC+8'in gösterdiği gibi, tam kalınlıkta penetrasyon 4 saat içinde görünürken, CPC+14'ün tam^derinliğeulaşması için 24 saat gerekir. Bu nedenle, birden fazla zaman noktaları etkili penetran doku kalınlığında farklı solutes oranını karşılaştırmak için seçilmelidir. Penetrasyon derinliğinin daha niceliksel anlaşılması için, doku kalınlığı boyunca çözünürlerin göreceli yoğunlukları ImageJ kullanılarak elde edilebilir.

Şekil 10: Kıkırdakta penetrasyon derinliği çalışmalarından elde edilen temsili sonuçlar. Değişen net yük (+8, +14 ve +20) ve kıkırdak yoluyla ilgili penetrasyon derinliği, CPC+8 ve CPC+14 tarafından görüldüğü gibi zayıf-geri dönüşümlü bağlanmayı ortaya koymuştur. Ancak, CPC+20 için görüldüğü gibi çok güçlü bağlama tam kalınlıkta penetrasyonu engelledi. Bu rakam Vedadghavami ve ark.⁴bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın değiştirilmiştir.

Görüntüleme sırasında kıkırdak içinde floresan sinyal gözlenmemişse, iki sorun olabilir; ya difüzyon için yüzey alanı epoksi tarafından bloke edildi, ya da ilk banyo konsantrasyonu bir floresan sinyal üretmek için çok düşüktü. Bu sorunları gidermek için, kıkırdak yüzeylerinden aşırı epoksi kaldırmak ve çözünür konsantrasyonu artırmak.

Denge dışı difüzyon taşıma deneyleri Şekil 11'degösterildiği gibi bir eğri ile sonuçlandı. Eğrinin ilk bölümü, solute-matris bağlama etkileşimleri gerçekleşirken kıkırdak yoluyla çözünür difüzyonu temsil eder. Taşıyıcının artan şarjı ile, daha güçlü matris bağlama sıyrıkların aşağı bölmeye ulaşması için daha uzun bir süre ile sonuçlanır oluştu. Çözünürler kıkırdağın derinliğine nüfuz edip aşağı bölmeye ulaştıktan sonra floresan okumazamanla arttıkça eğrinin eğiminde bir artış gözlendi. Eğrinin bu ikinci bölümü sabit hal difüzyonu temsil eden sabit bir eğime ulaştı. Sabit durum eğiminde, x-intercept ile işaretlenmiş sabit durum difüzyonuna (τ_Lag)ulaşmasüresini belirlemek için bir teğet çizgi çizildi. Kıkırdakta bağlayıcı etkileşimler varken KBM'lerin difüzyon hızı olan etkin difüzivite (D_EFF),τ_Lag ve ekstrüzyon kalınlığı (L) kullanılarak aşağıdaki gibi hesaplanmıştır:

Çözeltinin 20 μL'lik çözeltinin akıntının yukarı odasına aktarılmasından sonra floresan da bir artış gözlendi; konsantrasyonile korelasyon için ortaya çıkan stabilize floresan yoğunluğu kullanılmıştır. Akış aşağısındaki (C_D)KBM konsantrasyonu, akış yukarı konsantrasyonuna (C_U)normalleştirildi ve zamana göre çizildi. Bu eğrinin eğimi, aşağıda gösterildiği gibi kıkırdaktaki tüm bağlama alanları (D_SS)işgal edildiğinde sabit durumdifüzyon hızını tahmin etmek için kullanılmıştır. Bu değer bölümleme katsayısını kapsıyordu. Burada φ, V_D ve A kıkırdak gözenekliliğini (~0,8), aşağı akım odası hacmini (2 mL) ve kıkırdağın kesit alanını (0,1257 cm²⁾temsil eder. TBM'ler için denge olmayan taşıma deneylerinden hesaplanan Temsili D_EFF ve D_SS değerleri Tablo 1'debulunabilir.

Şekil 11: Kıkırdak yoluyla denge dışı difüzyon çalışmalarından elde edilen temsili sonuçlar. TBM+8 difüzyon eğrisi, akış aşağı konsantrasyonu olarak çizilen (C_D)upstream konsantrasyonu normalleştirilmiş (C_U),zamana karşı. Sabit hal eğiminde (mavi) çizilen bir teğet çizgi, D_EFF'ihesaplamak için kullanılan τ_Lag'dex eksenini geçer. Teğetin eğimi D_SS'ihesaplamak için kullanıldı. Başak testi (gri), 20 μL TBM çözeltisinin akış yukarıdan aşağı akıma aktarılmasından sonra, aşağı akım konsantrasyonunun normalleştirilmesi için kullanılan aşağı akış odasındaki stabilize konsantrasyonu temsil eder. Bu rakam Vedadghavami ve ark.⁴bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın değiştirilmiştir.

Akıntıya karşı floresan floresan, floresan etiketli peptidin yukarı haznesine eklenmesinden önce stabilize edilemezse, bir önceki deneyden duvarlara solute kalıntısı saplanmış olabilir. Bu durumda, oda sökmek ve sabun ve sonicate ile yıkayın. Floresan etiketli peptidin yukarı haznesine eklenmesinden hemen sonra akıntının aşağısındaki floresanda bir artış varsa, bu sızıntının mevcut olduğunu gösterebilir. Bunun için taşıma odasının yeniden montajı ve sızıntılar için yeniden test edilmesi gerekiyor. Eğer akıntıya karşı floresan sinyali sabit bir artışa karşılık bir platoya ulaşırsa, bu, büyük olasılıkla odanın duvarlarına yapışan solutes'in neden olduğu yukarı akım odasında ki olası bir konsantrasyon kaybına işaret eder. Yukarı hazneye %0.005 w/v büyükbaş serum albumini (BSA) eklenmesi yapışmayı önlemeye yardımcı olabilir.

Tablo 1: Kıkırdak yoluyla TBM taşınması için Temsili D_EFF ve D_SS değerleri. Bu tablo Vedadghavami ve ark.^4'ten değiştirilmiştir.

Burada açıklanan yöntem ve protokoller, negatif yüklü dokulara hedeflenen ilaç teslimatı alanında önemli. Bu dokularda bulunan negatif yüklü aggrecanların yoğunluğunun yüksek olması nedeniyle, bir bariyer oluşturularak ilaçların matrisin derinliklerinde bulunan hücresel hedef bölgelerine ulaşmasını engeller. Bu olağanüstü sorunu gidermek için, ilaçlar taşıma oranını artırabilir pozitif yüklü ilaç taşıyıcıları dahil etmek için değiştirilebilir, alım ve doku içinde ilaçların bağlanması^{1,3,4,14,15,16,17,18,19}. Burada geliştirilen yöntemlerle gösterildiği gibi, pozitif yüklü uyuşturucu taşıyıcılarının taşınması denge alımını, penetrasyon derinliğini ve denge olmayan disfüzyon oranını belirlemek için karakterize edilebilir. Kıkırdak ekspertiz yoluyla taşımanın değerlendirilmesi için kullanılabilen üç ayrı deneysel kurulumları başarıyla tasarladık.

Aktarımın başarılı karakterizasyonu için, yordamdaki kritik adımların izlenmesi gerekir. Tüm çözeltilerde proteaz inhibitörlerinin (PIs) kullanımı, dokudaki proteinlerin enzimatik sindirimini önlemek için işlev verdikleri için KBM'lerin kıkırdak içi taşınmasını doğru bir şekilde karakterize etmek için önemlidir²⁰. Bu nedenle, kullanılmadığı takdirde, aggrecans ve kollajen gibi kıkırdak matris bileşenleri bozulmaya başlayabilir ve deneme sırasında çevreleyen banyo içine salgılayabilir. Bu büyük ölçüde kıkırdak FCD düşürebilir, kıkırdak matris şarj tabanlı bağlama sitelerinin sayısını azaltarak. Ortaya çıkan doku artık sağlıklı kıkırdağın temsilcisi olacaktır. Buna karşılık, sunulan deneyler de agrega içeriği OA²⁰görüldüğü gibi çok daha düşük olduğu artritik kıkırdak yoluyla CpCs taşınması değerlendirmek için kullanılabilir. Kıkırdak ekskbitkileri sindirmek için tripsin veya Chondroitinaz ABC kullanarak, aggrecan yoğunluğu kontrol edilebilir, böylece hastalıklı bir durumda taşıma ve ilaç dağıtımının değerlendirilmesi için izin. Bu durumda, yük tabanlı bağlama tehlikeye olabilir, hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler gibi etkileşimlerin diğer türleri sinerjik intra-kıkırdak bağlama ve tutma geliştirmek⁴.

Kıkırdak ekstrektinin hidrasyonunu korumak, numune hazırlama ve deney sırasında anahtardır. 6 dakikadan fazla havaya maruz kalma yoluyla dehidratasyon eklem kıkırdağı²¹geri dönüşümsüz hasara neden olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, TBM'lerin taşınmasında beklenmeyen değişiklikler oluşabilir. Benzer şekilde, TBM banyolarının buharlaşması eksplant dehidratasyona neden olabilir; esnek bir film ile sızdırmazlık ile önlenebilir. Ancak, banyo buharlaşma sadece eksplant dehidratasyon neden olamaz, ama aynı zamanda TBM banyo konsantrasyonunda bir değişiklik neden olabilir, yanlış floresan okumalar ile sonuçlanan. Ayrıca penetrasyon çalışmalarının derinliğinin görüntülenilmesi için ince kesitler (~100 μM) kıkırdak gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Bu, tekdüze kalınlıkta dilimler elde edilebilmek için pratik gerektiren bir tekniktir. Ayrıca, özel olarak tasarlanmış spektrofotometre ile gerçek zamanlı floresan ölçümleri elde edilebilmek için taşıma odasının yarı saydam olması, denge dışı difüzyon deneyleri için de önemlidir. Ancak, alternatif olarak, aşağı odasından aliquots elde edilebilir ve floresan için bir plaka okuyucu veya diğer spektrofotometrik okuyucu kullanılarak değerlendirilir.

Burada sunulan yöntemler, in vivo ilaç tutma ve uzun süreli biyolojik etkinliği daha iyi tahmin etmek için kıkırdak yoluyla ilaç taşıyıcı taşımacılığı karakterize etmek için bir tezgah ölçekli yöntem sağlamak gibi büyük önem esahiptir. Son zamanlarda, gözenekli ortam²²ile çözünür taşıma ölçmek için hesaplamalı akışkanlar dinamiği için sonlu elemanlar çerçevesi uygulanmıştır. Arbabi ve ark. negatif yüklü kontrast madde difüzyon oranlarını ölçmek için mikro-CT görüntüleme elde edilen deneysel veriler ile birlikte sonlu elemananalizi kullanmış, kıkırdak ioksalate^23,24. Ayrıca, çok bölgeli, çok aşamalı bir model kullanılarak, kıkırdağın farklı bölgelerinde ki ioksalate difüzyon katsayıları her bölgenin FCD'si ile birlikte ölçüldü. Mikro-CT görüntüleme sadece kontrast ajanlarla kullanılabilirken, deneysel kurulumumuz floresan olarak etiketlenebilen tüm ilaç ve ilaç taşıyıcılarının taşınmasının karakterizasyonuna olanak sağlar. Ancak, Arbabi ve ark. tarafından kullanılan gelişmiş hesaplama modelleme solute taşıma davranışı daha kapsamlı bir analiz sağlar ve deneysel yöntemlere uygulanabilir^13,24.

Sunulan yöntemin bir sınırlaması, her solute taşıma deneyi için deneysel kurulumun in vivo ortamı tam olarak kapsamamasıdır. Doğal eklem içinde oluşan biyolojik tepkiler ve mekanik ve dinamik kuvvetler burada simüle edilmez. Bu kuvvetleri birleştirmek için, taşıma odası yürüme ve koşma gibi faaliyetler sırasında meydana gelen konvektif akış desenleri simüle etmek için bir piston ile değiştirilebilir. Ancak konvektif akış alımını 2 kat artırabilirken, elektrostatik etkileşimlere bağlı alım 100-400x artabilir. Böylece, burada sunulan deneysel kurulumlar şarj tabanlı taşıma ve alım²⁵için iyi bir tahmin sağlar. Ayrıca, diz eklemi doğal olarak sinovyal sıvı içerdiğinden, 1x PBS-PI yerine taşıma deneyleri için banyo çözeltilerinde kullanılabilir. Kıkırdaktaki katyonik taşıyıcıların alımının sinovyal sıvıda negatif yüklü karboksil grupları ile hialuronan zincirlerinin varlığı nedeniyle 1x PBS'ye göre sinovyal sıvıda azalacağı tahmin edilmektedir. Katyonik taşıyıcıların kıkırdak GAG'larına ek olarak sinovyal sıvının hyaluronan zincirleriile de rekabetçi bir şekilde bağlanması mümkündür. Ancak, negatif yüklü grupların yoğunluğu sinovyal sıvı ile karşılaştırıldığında kıkırdak önemli ölçüde daha yüksektir, kıkırdak hem negatif yüklü karboksiyal hyaluronan zincirleri ve kıkırdak¹⁵sülfatlı GAGs varlığı nedeniyle . Böylece, sinovyal sıvı varlığında kıkırdak alımı 1x PBS daha düşük olmasına rağmen, hala yüksek intra-kıkırdak alımını korumak için bekleniyor. In vivo, Avidin sinovyal sıvı varlığında hem sıçan hem de tavşan kıkırdak yüksek intra-kıkırdak alımı göstermiştir^16,26. Ayrıca, Avidin bir tavşan ön çapraz bağ trajitmodelinde intra-artiküler enjeksiyon utaki 2 haftaya kadar kıkırdakta yüksek alım ve retansiyon göstermiştir²⁷.

Bu sistemde büyükbaş kıkırdak kullanımı kalınlığı açısından insan kıkırdağına benzerlikleri nedeniyle kıkırdak yoluyla ilaç penetrasyonu daha doğru bir temsil sağlar (~ 1.5-2 mm)^28,29. Çözünürlerin kıkırdak yoluyla taşınması kalınlığı ile değişebilir; ilaç taşıyıcıları tamamen çok daha ince fareler veya sıçan kıkırdak yoluyla nüfuz etmek için daha az bağlayıcı etkileşimleri gerektirebilir, ancak önemli ölçüde kalın insan kıkırdağı daha derin nüfuz engellenebilir¹. Ayrıca, bu deneyler kıkırdak içinde çözünür taşıma karakterize etmek için tasarlanmış olmasına rağmen, bu yöntemler değiştirilebilir ve menisküs gibi diğer negatif yüklü dokulara uygulanabilir, kornea ve gözün vitreus mizah, ve intervertebral disklerin çekirdek pulpososus. Burada tasarlanan deneylerin metodolojileri, demirbaşların ve taşıma odalarının boyutları doku büyüklüğüne ve türlerine göre uyarlanabildiği için avantajlıdır. Bu yöntemlerin etkisi yaygınolup, sadece uyuşturucu taşıyıcıları ile sınırlı olmakla sınırlı olmakla birlikte, aynı zamanda uyuşturucu ve uyuşturucu taşıyıcılarının taşınmasının değerlendirilmesi için de geçerlidir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma, W81XWH-17-1-0085 sözleşmesi kapsamında Kongre Tarafından Yönlendirilmiş Tıbbi Araştırma Programları (CDMRP) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü R03 EB025903-1 aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir. AV, Northeastern Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Dekan Bursu tarafından finanse edilmiştir.