Farelerde Hepatosit Nükleer Ploidi Tahmini için Yerinde Yüksek Throughput Yöntemi

Akış sitometrisi gerektirmeyen sabit/kriyokorunmuş doku örneklerinde hepatosit numarası ve nükleer ploidideki değişiklikleri ölçmek için sağlam, uygun maliyetli ve esnek bir yöntem saseril. Yaklaşımımız karaciğer hasarı ve hastalığın ilerlemesini izlemek için ideal karaciğer sitolojisi güçlü bir örnek çapında imza sağlar.

Karaciğer yaralandığında hepatosit sayıları azalır, hücre büyüklüğü ise, nükleer boyutu ve ploidi artar. Kolanjiyositler, miyofibroblastlar, atalar ve inflamatuar hücreler gibi parenkimal olmayan hücrelerin genişlemesi de kronik karaciğer hasarı, doku remodeling ve hastalığın ilerlemesini gösterir. Bu protokolde, karaciğerin hücresel bileşiminde yaralanma, kronik hastalık ve kanserle ilişkili değişiklikleri hesaplamak için basit bir yüksek iş ilişkisi yaklaşımını tanımlıyoruz. İki boyutlu (2D) doku bölümlerinden elde edilen bilgilerin, bir numune içinde hepatosit nükleer ploidiyi ölçmek ve kalibre etmek ve kullanıcının karaciğer içinde belirli ploidi alt kümeleri yerinde bulmasını sağlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Yöntemimiz sabit/dondurulmuş karaciğer materyaline, temel immünositokimya reaktiflerine ve herhangi bir standart yüksek içerikli görüntüleme platformuna erişim gerektirir. Bu taze toplanan doku bozulması, mekansal bilgi kaybı ve potansiyel disaggregasyon önyargı gerektiren standart akış sitometri teknikleri, güçlü bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Memeli karaciğerindeki hepatositler, binükleer hücreler üretmek için durmuş sitokineze ve 16N DNA içeriği içeren poliploid çekirdekleri üretmek için DNA endorepasyonuna uğrayabilirler. Doğum sonrası gelişim sırasında genel hücresel ve nükleer ploidi artışı, yaşlanma ve çeşitli hücresel streslere yanıt^{olarak 1}. Poliploidizasyon süreci dinamik ve geri dönüşümlü², kesin biyolojik işlevi belirsiz kalırken³. Artmış ploidi azaltılmış proliferatif kapasite ile ilişkilidir⁴, genetik çeşitlilik², kronik yaralanma adaptasyon⁵ ve kanserden korunma⁶. Hepatosit ploidi değişiklikler değişmiş sirkadiyen^ritimsonucu ortaya 7 , ve keserek⁸. En önemlisi, karaciğer ploidi profili yaralanma ve hastalık^tarafındandeğiştirilir 9 , ve zorlayıcı kanıtlar belirli ploidi değişiklikler, artmış ≥8N çekirdekleri veya 2N hepatosit kaybı gibi, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı izlemek için yararlı imzalar sağlamak düşündürmektedir (NAFLD)^3,10, veya viral enfeksiyonların diferansiyel etkisi¹¹.

Genel anlamda, karaciğer hasarı ve rejenerasyon artmış hepatosit hücre büyüklüğü ve nükleer alan ile ilişkilidir¹², hepatosit azaltılmış genel sayılar ile birlikte, özellikle 2N DNA içeriği¹⁰olanlar^{10 ,11}. Karaciğerde parenkimal yaralanma da sıklıkla non-parenkimal hücrelerin genişlemesi eşlik (NPCs), stromal miyofibroblastlar da dahil olmak üzere, inflamatuar hücreler ve bipotent karaciğer ata hücreleri. Parenkimal hücre numarası ve nükleer ploidin nicel sitolojik profilini sağlayan yüksek iş parçacığı yöntemleri, nfc'lerde ki değişiklikleri de hesaba katarken, bu nedenle yaralanma ve hastalık sırasında karaciğerin yanıtını takip etmek için araştırma ve klinik araçlar olarak önemli bir potansiyele sahiptir. Hepatosellüler karsinom insan örneklerinde ploidy spektrumların yerinde analizi zorlayıcı son da nükleer ploidi önemli ölçüde tümörler içinde artar ve özellikle azaltılmış farklılaşma ve TP53 kaybı ile daha agresif tümör alt tipleri amplifiye olduğunu göstermektedir¹³. Bu nedenle, nükleer ploidi kantitatif değerlendirmede metodolojik gelişmeler karaciğer kanserinin gelecekteki prognostik profilleme yardımcı olacağını güçlü bir olasılık vardır.

Bu protokolde, fare karaciğer doku kesitlerinin karşılaştırmalı analizi için esnek bir yüksek iş lenme metodolojisi tanımlanmış olup, hepatosit sayılarının ayrıntılı sitometrik profillemesi, NPC yanıtı ve nükleer ploidiyi tahmin etmek için dahili olarak kalibre edilmiş bir yöntem(Şekil 1). Hepatositler ncd'lerden hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) immünetiketleme ile nükleer boyut ve nükleer morfometri karakterizasyonundan önce ayrılırlar. "Minimal DNA içeriği" ortalama Hoechst 33342 yoğunluğu (DNA yoğunluğu için bir proxy) interpole üç boyutlu (3D) nükleer hacim ile entegre ederek tüm dairesel nükleer maskeler için tahmin edilmektedir. Hepatosit minimal DNA içeriği daha sonra nükleer ploidi profili oluşturmak için NFC'ler kullanılarak kalibre edilir.

Görüntü edinimi, nükleer segmentasyon ve görüntü analizi yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir ve on binlerce hücreiçeren iki boyutlu (2D) karaciğer bölümlerinin geniş alanlarının taranmasını sağlar. Tüm dairesel hepatosit çekirdekleri için örnek geniş ploidi profili oluşturmak için yüksek içerikli görüntü analizi verilerinin otomatik olarak işlenmesi için özel olarak yazılmış bir program sağlanmaktadır. Bu stereoolojik görüntü analizi (SIA)¹⁰,^11,,14,15dayalı nükleer ploidy hesaplamak için yazılım indirmek için ücretsiz kullanılarak gerçekleştirilir. SIA metodolojisi daha önce dairesel nükleer morfolojisi ve nükleer boyut ve DNA içeriği arasında monoton bir ilişki varsayarak, karaciğer¹⁴hepatosit nükleer ploidi tahmin etmek için doğru, zahmetli de olsa, doğru bir yöntem olarak akış sitometri tarafından doğrulanmıştır. Bu protokolde, her iki nükleer parametre de nükleer morfometri ve Hoechst 33342 etiketleme nin değerlendirilmesi ile ölçüldü. Her nükleer maske için "minimal DNA içeriğinin" hesaplanması, bilinen 2−4N DNA içeriğine sahip olan ve bu nedenle yararlı bir iç kontrol görevi gören NPT'ler kullanılarak hepatosit nükleer ploidin kalibrasyonu ile takip edilir.

Konvansiyonel akış sitometri yöntemleri ile karşılaştırıldığında¹⁶ açıklanan yaklaşım hepatosit nükleer ploidi yerinde değerlendirilmesini sağlar ve sonuçları önyargı ve standartlaştırmak zor taze doku veya disaggregasyon yöntemlerine erişim gerektirmez. Tüm SIA tabanlı yaklaşımlarda olduğu gibi, nükleer ploidi alt sınıfları >2N ekvator düzlemi dışında büyük çekirdeklerin kesiti nedeniyle 2B örnekleme ile yeterince temsil edilmiştir. Doku çapında ploidi profili de tüm dairesel hepatosit nükleer maskeler için minimum DNA içeriğini açıklar ve doğrudan mononükleer hepatositler ve aynı ploidi iki ayrık ("dokunmaz") çekirdekleri var binükleer hücreler arasında ayrım yapmaz. Ancak, bu protokolün basitliği, hücre içi ploidin daha ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlayan iki nükleer hücrelerin belirlenmesini kolaylaştıracak, nükleer aralık lar veya hücre çevre analizi gibi ek parametrelere göre uyarlanması için önemli bir kapsam sağlar.

Tüm hayvan deneyleri daha önce CIPF etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler Centro de Investigación Príncipe Felipe'de (Valencia, İspanya) patojensiz bir tesiste, deneysel bir hayvan yetiştiricisi, kullanıcı ve tedarik merkezi olarak kayıtlı (reg. no. ES 46 250 0001 002) geçerli Avrupa ve İspanyol hayvan refahı düzenlemeleri (RD 53/2013) uyarınca.

1. Doku hasadı ve numune hazırlama

NOT: Bu protokol, önceden fiksasyon veya kriyopreservation olmadan doku dondurma nasıl açıklanır. Daha önce sabit/kriyokorunmuş örnekler için bölüm 2'ye geçin ve adım 3.1'i atlayın. Tüm analizler 12−16 haftalık yetişkin dişi C57BL/6 fareler kullanılarak yapılmıştır.

1. Fentanil/pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ve ardından servikal çıkış ile kurban hayvanlar. Fare nin ventral tarafa dönük olmasıyla karın boşluğunu açın ve cildi cımbızla tutarak ve cerrahi makas kullanarak alt karın tabanından göğüs tabanına dikey bir kesi yaparak karaciğeri ortaya çıkarın.
2. İnce cımbız kullanarak safra kesesini dikkatlice çıkarın, karaciğeri parçalayın ve seçilen karaciğer lobulesini fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 10 cm'lik Petri kabında durulayın.
   NOT: Her hayvan için aynı karaciğer lobu nun karşılaştırılması tavsiye edilir, bu durumda ortanca lob kullanılmıştır.
3. Etiketli bir kriyomold'u oda sıcaklığında (RT) optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamıyla doldurun. OCT kabarcıkları kaçının. Görünürlerse, bir iğne veya pipet ucu kullanarak kalıbın kenarına itin.
4. Dolu bir OCT kriyomold içine karaciğer lobule gömmek ve hemen hızlı donma sağlamak için kuru buz üzerine yerleştirin. Kriyomoldları -80 °C'de kriyoseksiyona kadar saklayın.

2. Kriyoding

1. Doku bozulmasını önlemek için kuru buz üzerinde cryomolds taşıma. Kriyodize den önce 20 dk için -20 °C olarak ayarlanmış kriyostat içinde denge.
2. Plastik kriyomold tabanına basınç uygulayarak numune çıkarmak. RT'deki numune diskini ısıtmak için sıvı OCT uygulayın, kriyostat'ta konumlandırın ve OCT gömülü karaciğer örneğini takın. Hafif basınç uygulayın ve numunenin diske yapışmasını sağlamak için OCT'nin donması için 3 dakika bekleyin.
   NOT: Doku bozulmasından kaçınmak için numuneyi mümkün olduğunca parmaklarla kullanmaktan kaçının.
3. Örneği kriyostat koluna kilitleyin ve yönü, numunenin kenarının kriyostat bıçakla paralel olacak şekilde ayarlayın. Doku ulaşılına kadar numuneyi kesin.
4. Numuneyi 6 μm kalınlığında kesin. Numunenin slayta yapışmasını sağlamak için numunenin üzerine 5 s'lik etiketli poliamid kaplı bir slayt yerleştirin. Slaytı 3−5 dakika boyunca RT'ye yerleştirin ve en iyi sonuçlar için doğrudan bölüm 3'e gidin.
   NOT: Birden fazla taze dondurulmuş numunenin işlenmesi için, tüm numuneler işlenene kadar slaytların kuru buz üzerinde geçici olarak bir slayt kutusunda saklanması ile tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir. Bu yaklaşımı kullanırken, bölüm 3'e geçmeden önce tüm slaytların RT'ye dengede olmasını bekleyin. Formalin sabit parafin gömülü (FFPE) örnekleri kullanılabilir, ancak arka plan otofloresansbu yöntemle artar. FFPE örneklerinden devam etmek için, 4 μm. Mount bölümünde poliamid ile işlenmiş slaytlar üzerinde 40 °C su banyosu bölümleri yakalayarak. Isı slaytlar için 1 saat 60 °C, daha sonra seri RT yıkama (5 dakika) ksilen içeren Coplin kavanoz (5 dakika), etanol 100% (x2), % 96 (x2), 70% (x1) ve dH₂O (x1) ile deparaffinize. Antijenleri ortaya çıkarmak için, RT'de PBS'deki slaytları temperlemeden önce 90 °C'de 20 dakika boyunca sitrat tamponuna slayt yerleştirin.

3. Floresan immünetiketleme

1. PBS'de 1 0 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) uygulayarak duman kaputundaki doku bölümlerini düzeltin.
   NOT: Şu andan itibaren immünboyama işleminin sonuna kadar, numunenin kurumasını önleyebilirsiniz.
2. Kuru her doku bölümü etrafında alan ve bir hidrofobik kalem kullanarak çevreleyen. Rt'de 15 dakika boyunca PBS'de %0,5 noniyonik yüzey aktif madde (yani Triton X-100) ile permeabilize olun. Sonra pbs dolu Coplin kavanozda 3 dakika nazik ajitasyon (tekrar 2x) kullanarak yıkayın.
3. %1 büyükbaş serum albumin (BSA), %5 at serumu, PBS'de %0.2 noniyonik yüzey aktif madde (RT'de en az 1 saat süreyle) filtrelenmiş bir solüsyon kullanarak bloke edin.
4. Koyu nemli boyama odasında gece boyunca tampon uzerinde niskende seyreltilmiş primer HNF4α antikorlu inkübat (antikorlar ve spesifik seyreltmeler için Malzemeler Tablosuna bakınız).
5. PBS dolu Coplin kavanozuna slaytlar yerleştirin ve nazik ajitasyon kullanarak 3 dakika yıkayın (tekrar 4x).
6. Alexa-488 konjuge sekonder antikor ve Hoechst ile süzülen seyreltilmiş 1% BSA ve 0.2% niyonik yüzeyaktif pBS için 2 saat RT koyu nemli boyama odasında (antikorlar ve spesifik seyreltmeler için Malzemeler Tablosu bakınız).
7. PBS dolu Coplin kavanozuna slaytlar yerleştirin ve nazik ajitasyon kullanarak 3 dakika yıkayın (tekrar 4x). Nazik ajitasyon kullanarak 3 dakika ddH₂O yıkayın (tekrar 2x).
8. Bir kapak üzerinde floresan montaj ortamı iki damla yerleştirerek slaytlar montaj (24 x 60 mm) ve üzerine slaytlar koyarak, hafif basınç uygulayarak kabarcıklar ortadan kaldırarak. Uzun süreli depolama için, açık oje ile kenarlarında mühür kapağı kayma ve 4 °C karanlıkta saklayın.
9. Devam etmeden önce, iyi bir fiksasyon ve immün etiketleme sağlamak için geleneksel floresan mikroskobu kullanarak slaytları kontrol edin.
   NOT: Beklenen sonuçlar için Şekil 2A,B'ye bakınız.

4. Floresan görüntü edinimi

NOT: Bu adım için, otomatik floresan görüntü edinimi destekleyen yüksek içerikli görüntüleme platformu(Malzeme Tablosu)gereklidir.

1. Görüntüleme sistemini açın ve yeni bir satın alma protokolü açın.
2. 10x hedefini seçin, görüş alanının alanını not edin (bu durumda 0,6 mm^2).
3. Uygun uyarma ve emisyon filtrelerini kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için parametreleri ayarlayın (adım 3.6'ya göre). Hoechst ve Alexa-488 için sırasıyla 390/18 ve 438/24 nm uyarma ve 432,5/48 ve 475/24 nm emisyonlu "DAPI" ve "GFP" kanallarını seçin.
4. Numuneye odaklanın ve sinyal yoğunluğunun doyup olmadığından emin olun. Görüntü yakalamanın tüm görüntüler için aynı pozlama süresiyle yapıldığından emin olun veya pozlama süresi için floresan yoğunluğunun düzeltildiği bir sistem kullanın.
5. Örnek tarayıp doku bölümünün tam kapsamını elde etmek için yeterli görüntü elde edin (örnek boyutuna bağlı olarak yaklaşık 20−50 görüş alanı).
6. Görüntü veritabanını gözden geçirin, (i) kötü odaklanmış alanları, (ii) her doku bölümünün sınırlarında bulunanları (hücre yoğunluğu hesaplamalarını önyargılı önlemek için) ve (iii) varsa doku bölümünün katlanmış/fiziksel hasarlı alanlarını içeren alanları el ile gözden geçirin.

5. Otomatik floresan görüntü analizi

NOT: Bu adım uygun görüntü analiz yazılımı(Tablo Malzemeler)yeteneğine sahiptir: (1) otomatik olarak 405 nm (nükleer segmentasyon) görüntüleri içinde Hoechst etiketli çekirdekleri tanımlayan, (2) ortalama Hoechst nükleer yoğunluk ve morfometri değerlendirme, ve (3) eşik analizi 488 nm (HNF4α) nükleer floresan +/- durumunu belirlemek için. Bazı temel operatör eğitimi/uzmanlığı, çekirdeklerin ve HNF4α+/- durumunun en iyi şekilde geçitli olmasını sağlamak için program daki segmentasyon ve eşik parametrelerini görsel olarak değerlendirmek ve ayarlamak için gereklidir(Şekil 2).

1. Görüntü analizi yazılımında, Adım 4.5'ten Hoechst (405 nm) ve HNF4α (488 nm) görüntüleri içeren satın alma dosyasını açın ve yeni bir analiz protokolü oluşturun.
2. Nükleer segmentasyon (Hoechst, 405 nm) ve hepatosit/NPC eşik analizi (HNF4α, 488 nm) için kullanılacak dalga boylarını tanımlayın.
3. Çekirdeğin en iyi şekilde ayrılmasını sağlamak için yazılımın nükleer segmentasyon parametrelerini ("minimum nükleer alan" ve nükleer algılama "hassasiyeti" gibi) ayarlayın.
   NOT: Hepatositlerin iyi segmentasyonu NPT'lere göre önceliklendirilmelidir.² Sinüzoidal endotel çekirdekleri gibi NPC çekirdekleri düzleştirilmiş/eliptik veya düzensiz şeklindedir ve genellikle hepatositlerinkinden daha küçük ve daha yakın paketlenmiştir (interquartile boyut aralığı: 30−43 μm^2). Fare karaciğeri için minimal nükleer alan ≥23 μm² ve %65'lik bir "duyarlılık" saptandı (beklenen sonuçlar için Şekil 2C,D'ye bakınız). Duyarlılık, piksel kümelerinin yoğunluklarına göre nasıl ayrı çekirdekler olarak tanındığını belirler ve otomatik görüntü analizine geçmeden önce kullanıcı tarafından ayarlanan her örnek için ampirik olarak test edilmelidir.
4. Hepatositlerin (HNF4α+) ve parenkimal olmayan hücrelerin (HNF4α-) en iyi şekilde gating edilmesini sağlamak için eşik yoğunluğunu 488 nm olarak değiştirin.
   NOT: Beklenen sonuçlar için Şekil 2C,D'ye bakınız. Eşik yoğunluğunun değeri görecelidir ve lazer yoğunluğu gibi boyama verimliliği ve edinme ayarlarına bağlıdır. Bu nedenle kullanıcı tarafından standartlaştırılmalıdır. Endotel hücreleri ve periportal NPC'ler gibi bilinen HNF4α hücreleri iç negatif kontrol ve binükleer hepatosit çekirdekleri boyama için olumlu bir referans olarak kullanın. Analiz parametrelerini tüm veri kümesine uygulamadan önce iyi bir nükleer segmentasyon ve yoğunluk eşiği ayrımı sağlamak için az sayıda görüntü kullanarak analiz parametrelerini test edin.
5. Ölçülmek için aşağıdaki nükleer parametreleri seçin: (1) Hoechst boyama (μm^2),(2) ortalama nükleer Hoechst yoğunluğu (RU), (3) nükleer uzama faktörüne (çekirdeğin kısa ekseninin çekirdeğin uzun eksenine ortalama oranı) dayalı nükleer alan, bir merkez-simetrik [uzamış olmayan] nesnenin değeri 1, (4) Nuc 1/(form faktörü), çevre 2/(4π x alanı) tarafından hesaplanan ortalama nükleer "yuvarlaklık" indeksi. Değerler 1'in mükemmel bir daire olduğu 1'den sonsuza kadar değişir, (5) HNF4α durumu (pozitif-1 veya negatif-0) ve (6) nükleer x/y koordinatları "ağırlık merkezi" (cg) temel alınarak, nesnenin merkezini alt piksel hassasiyetiyle gri tonlu görüntülerden bulma yöntemidir.
6. Tüm örnek veri kümeleri için çözümleme çalışması ve 5.5 adımından elektronik tablo yazılımına sayısal verileri dışa aktarın.

6. Veri analizi

NOT: Veri analizi adımı herhangi bir standart elektronik tablo yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir.

1. Hepatosit ve hepatosit olmayan hücre numaralarını hesaplayın.
   1. Her örnek için analiz edilen karaciğer bölümünün toplam alanını, görüş alanının alanıyla çarparak hesaplayın (adım 4.2).
      
   2. Her karaciğer bölümü için oluşturulan elektronik tablo dosyalarıyla çalışarak, yalnızca HNF4α+ çekirdeklerini seçerek verileri filtreleyin. Analiz edilen toplam HNF4α+ çekirdeği sayısını hesaplayın ve bunu analiz edilen toplam alana bölerek her bir örnek için ortalama hepatosit yoğunluğu elde edin (Şekil 2F).
      
   3. HNF4α- hücreleri için elektronik tabloyu filtreleyerek parenkimal olmayan hücreler için aynı hesaplamayı yapın (Şekil 2E).
2. Hepatosit nükleer boyut dağılımını hesaplayın.
   1. Elektronik tablo yazılımLarını kullanarak, yalnızca HNF4α+ çekirdeklerini seçmek için verileri filtreleyin.
   2. Bir histogramdaki nükleer alanın çizim değerleri (Şekil 2G). Depo alanı genişliğini 5 μm²olarak ayarlayın.
      NOT: Frekans değerleri 6.1.1 adıma göre alan (çekirdek/mm²⁾için düzeltilebilir.
3. Hepatosit nükleer ploidi analizini yapın.
   NOT: Adım 5.6'daki elektronik tablo verileri her örnek için nükleer ploidi profili oluşturmak için kullanılır. Bu işlem otomatikleştirilmiştir ve destekleyici bilgiler ve tanıtım veri kümeleri ile ücretsiz olarak indirilebilen özel bir yazılı yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilirhttps://github.com/lukeynoon(bkz.Ek Dosyalar). Kaynak kodu, metodolojiyi uyarlamak isteyen kullanıcılar için sağlanır. Algoritmanın tanımı, kurulum ve kullanım talimatlarıyla birlikte aşağıda özetlenmiştir. Program, hepatosit çekirdeklerini otomatik olarak iki gruba ayırmak için elektronik tablo verilerini kullanır; (1) "basit" dairesel çekirdekleri ve (2) "karmaşık" dairesel olmayan çekirdekleri <2c ploidy ile binükleer hücrelerin temsilcisi olanlar. En az nükleer DNA içeriği (nükleer alan ve DNA yoğunluğu bir fonksiyonu) sonraki tüm "basit" çekirdekleri için hesaplanır. Daha sonraki bir adım, HNF4α- çekirdeklerini kullanarak HNF4α+ hepatosit nükleer ploidiyi otomatik olarak kalibre eder.
   1. Yazılımı indirin ve yükleyin.
      1. Paket uygulamayı aşağıdaki: https://github.com/lukeynoon
      2. MATLAB'ı başlatın. Toolstrip'in APP sekmesine gidin, Uygulamayı Yükle'yi tıklatın ve indirilen"Ploidy_Application.mlappinstall" adlı uygulamayı açın. Başarılı yüklemeyi onaylamak için bir ileti görüntülenir.
         NOT: Uygulama kullanıma hazırdır ve araçlar gezisinin APP sekmesinde kalır.
   2. Giriş verilerini biçimlendirin.
      NOT: Otomatik nükleer ploidi analizinden önce, yüksek içerikli görüntüleme verileri (adım 5.6) içeren tüm elektronik tablo dosyaları aşağıdaki talimatlara göre depolanmalı ve biçimlendirilmelidir.
      1. Dışa aktarılan her veri dosyasında (. XLS 97-2004 çalışma kitabı) adım 5.6, sütunlarda belirlenen ploidy analizi için gerekli tüm verileri içeren "Hücre ölçüleri" olarak adlandırdığı bir sayfa içerir(Şekil 3A). Çözümleme yöntemi bu adları arayarak doğru sütun verilerini bulduğundan, sütun üstbilgi adlarını içeren elektronik tablo düzeninin Şekil 3A'dakindendeğişmediğinden emin olun (bkz. başvuru için Ek Dosyalar'daki gösterim veri kümeleri). Örneğin, yüksek içerikli görüntü analizi yazılımı bir "Işık akısı" sütunu(Şekil 3A)oluşturmuyorsa, aynı konuma, yani K sütununa el ile bir "Işık akısı" sütunu ekleyin ve sıfırlarla doldurun.
      2. Her deneysel durum için (örneğin, "Yaralı-d14"), 2−4N nükleer ploidy kalibrasyonu (adım 6.3.4.3) için iç kontrolü hesaplamak için kullanılacak bir kontrol veri seti sağlar. Burada, tedavi edilmeyen yetişkin çöp arkadaşlarından ("Control-d0"; Şekil 3B−D).
      3. Biyolojik çoğaltmalar için (koşul başına), her elektronik tabloyu kendi klasöründe saklayın (Şekil 3B'dekigibi). Klasör önekleri artımlı olarak adlandırın, örneğin, "Örnek1, Örnek2, Örnek3... SampleN", içinde yer alan dosya adlarını göre. Bu nedenle, her veri kümesi klasörü (örneğin, "Control-d0") her biri aynı adı taşıyan bir elektronik tablo dosyası içeren bir dizi alt klasör ("Örnek1", "Örnek2", vb.) içermelidir.
   3. Uygulamayı çalıştırın.
      1. MATLAB içinde, araçlar gezisinin MY APPS sekmesindeki simgeye tıklayarak "Ploidy_Application" başlatın (Şekil 3C). Ploidy_Application grafik kullanıcı arabirimi (GUI) görünür (Şekil 3C).
      2. Denetim verilerinin çoğaltıldığı klasöre gitmek için veri düğmesini denetlemek için Yolu tıklatın (örn. "Control-d0"). Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür (örn. /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Ardından, "klasör öneki" türünde çıktı dosyalarına verilecek ad (örneğin, "Örnek").
         NOT: Bu önek, klasörlerin ve dosya adlarının artımlı olarak kalması koşuluyla herhangi bir metinle değiştirilebilir.
      4. Diğer veri yolu düğmesini tıklatın ve karşılaştırmalı verilerin çoğaltıldığı klasöre gidin (örn. "Yaralı-d14"). Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür (örn. /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Çalıştır'ı tıklatın! Çözümleme tamamlandığında durum çubuğunda "Çözümleme Tamamlandı!.." okunur.
         NOT: Uygulama, her örnek için ≤2n, 2n−4n, 4n−8n ve 8n+ içine "basit" çekirdeklerin tabakalaşmasını mutlak sayımlar açısından ve toplamın yüzdesi olarak rapor edecektir (Şekil 3D). Bu dosyalar her örnek klasöre otomatik olarak kaydedilir: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Ploidy_Application otomatik olarak her örnek için bir liste kaydedecektir, "basit" hepatosit ve non-hepatosit çekirdekleri için tüm bireysel ploidy tahminleri "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" ve "Ploidy_NonHepatocytes.txt". Kontrol veri kümesi için yöntem, "Normalised_Thresholds_Control"adlı bir dosyada ploidy tabakalaşması için hesaplanan en az DNA içerik eşiklerini de kaydeder (bkz. adım 6.3.4.3.7). Son olarak, uygulama hem denetim hem de "Özet" olarak adlandırılır seçili karşılaştırmalı durum verileri için bir klasör üretecektir. Bu klasör, sağlanan tüm örneklerin ortalamalarını içeren "Ploidy" ve "Tabakalaşma" olmak üzere iki alt klasör içerir(Şekil 3D).
   4. Metodolojinin tanımı.
      NOT: Aşağıdaki bölümde Nükleer Ploidy Analizi yazılımı tarafından kullanılan metodoloji ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Kullanıcı uygulamayı kullanmamayı seçerse, nükleer ploidy profilini el ile hesaplamak için elektronik tablo yazılımı kullanılarak bu adımlar izlenebilir.
      1. Çekirdekleri nükleer morfometriye göre "basit" veya "karmaşık" olarak ayırın.
         1. 1,0 değerinin mükemmel bir daireyi gösterdiği "Nuc 1/(form faktörü)" ile bölünen nükleer "uzama faktörü" olarak tanımlanan tüm çekirdekler için bir "dairesellik indeksi" hesaplayın.
            NOT: "Nükleer uzama" ve "Nuc 1/(form faktörü)" bir nesnenin tamamlayıcı, örtüşen morfometrik kriterleri değerlendiren "daireselliği"nin iki ayrı ölçüsüdür. Eski, bir nesnenin uzun ve kısa eksenlerini ölçerken, ikincisi bir nesnenin çevresinin uzunluğunu kendi alanının ki ile karşılaştırır. Bu protokolde kullanılan nükleer dairesellik tanımını güçlendirmek için bu iki ölçüm tek bir "dairesellik indeksi" olarak birleştirilmiştir. Açıklanan metodoloji kullanarak nükleer ploidi tahmin etmek için bir önceki yaklaşım sadece nükleer uzama¹⁷kullanılır. Bu yaklaşım kullanılarak kabul edilebilir sonuçlar elde edilirken, yazarlar kompozit bir "dairesellik indeksi"nin mononükleer ve binükleer hepatositlerden elle seçilmiş çekirdeklerin ayrımcılığını artırdığını gözlemlemiştir (veriler gösterilmemiştir).
         2. Çekirdekleri dairesellik indeksi ≤ 0,8 ile "karmaşık" ve bu > 0,8'i "basit" olarak sınıflandırın.
      2. Tüm "basit" çekirdekler için "minimal" DNA içeriğini (m) tahmin edin.
         1. Formülü kullanarak nükleer yarıçapı (r) hesaplayın:
            
         2. Bir küre formülünün hacmini kullanarak nükleer hacmi (v) hesaplayın:
            
         3. Formülü kullanarak en az DNA içeriği (m) için göreli bir değer oluşturun:
            
      3. NPC (HNF4α-) çekirdeklerini kullanarak veri kümesini dahili 2−4N kontrol olarak kalibre edin.
         NOT: NDC hücre döngüsü durumuna bağlı olarak 2−4N DNA içeriğine sahiptir. Bu nedenle, NPC ortalama değeri "minimal" DNA içeriği (NPC_m)yaralanma ile artar (Şekil 4A). Kalibrasyon hatası, 4c eşiğini temsil eden NPC_m üst sınırı oluşturularak en aza indirilir (Şekil 4B).
         1. Elektronik tabloda, modun 1 standart sapması (SD) içinde yer alan "m" değerlerine sahip yalnızca NPC çekirdeklerini seçin (bu durum olası segmentasyon hatasından gelen gürültüyü filtreler).
         2. Bu filtreli aralık içinde, nükleer alanları ve buna karşılık gelen ortalama Hoechst yoğunluklarını inceleyin(Şekil 4C).
         3. Bu filtrelenmiş aralıktaki en küçük nükleer alanı maksimal nükleer Hoechst yoğunluğuyla tahmin edin (yani, eğri çizgisinin Şekil 4C'dekikırmızı dairede gösterildiği gibi filtrelenmiş veri kümesinde yön değiştirdiği nokta). Bu değer, 4c çekirdeklerinin örneklemesinin 2c çekirdeklerin üzerinde baskın olduğu 2N−4N geçiş durumunu (t) temsil eder ve ortalama Hoechst yoğunluğunun bir maksimaile sonuçlanır.
            NOT: Bu değer yazılım tarafından otomatik olarak belirlenir; ancak, elektronik tablo kullanıcıları bu noktayı geçiş boyutu olarak el ile seçebilir.
         4. 6.3.4.2 adımını izleyerek bu geçiş boyutu (t_m)ile temsil edilen minimum DNA içeriğini hesaplayın.
         5. NPC_m veri kümesinin 4N omzunu tahmin etmek için t_mdeğerine 1 SD ekleyin. Ortaya çıkan sayı(Şekil 4B),nükleer ploidi tabakalaşma için kullanılacak NPC minimal DNA içeriğinin üst sınırını açıklar (S_4c).
         6. Tüm "kontrol" örnekleri için 6.3.4.3.1−6.3.4.3.5 adımlarını tekrarlayın.
            NOT: Örneğin, Şekil3'te, yaralanmamış kontrol karaciğerleri ("Control-d0") kontrol koşulu olarak kullanılır.
         7. "Kontrol" örnekleri için ortalama 4c tabakalaşma eşiğini (S_4c)hesaplayın ve bunu en az DNA içeriği (m) için 2c (S_2c)ve 8c (S_8c)sınırlarını tahmin etmek için kullanın. Tabakalaşma eşikleri otomatik olarak oluşturulur ve yazılım tarafından depolanır (adım 6.3.3.3).
            NOT: Çalışma tasarımına bağlı olarak, her durum için veya belirli koşullar için (örn. sağlıklı kontrol karaciğeri) ortalama tabakalaşma eşik değerleri hesaplanabilir. Ancak, Nükleer Ploidy Analizi yazılımı bir 2 dosya kümesinden biri göreli ploidy değerleri hesaplamak amacıyla "kontrol" olarak belirlenmiş gerektirir.
         8. 6.3.4.3.7 adımında oluşturulan S_2c değerini kullanarak tüm çekirdekler için ploidi değerini hesaplayın:
            
         9. "Basit" hepatosit (HNF4α+) çekirdeklerini 2c/4c/8c/>8c paranteziçine aşağıdaki kriterlere göre teslif edin: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p.
         10. Ploidi alt grupların mekansal desenlerini yeniden oluşturmak için, her bir örnek tablosundaki nükleer verileri, satın alındıkları ilgili alanlara göre ayırın. Daha sonra 2B ploidy alt grupları çizmek için ilişkili nükleer x/ y koordinatları (adım 5.5) kullanın (Şekil 5C).

Bu yöntem, 0.1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihidrocollidine (DDC)¹⁷içeren bir hepatotoksik diyet ile 0−21 gün boyunca hayvanları besleyerek yetişkin fare karaciğeri üzerinde kolestatik yaralanma etkisini ölçmek için kullanılmıştır. Kronik DDC besleme sonuçları hepatosellüler yaralanma artmış ploidi ve NPCs periportal genişleme. Kullanıcı, fare zorlanması ve yaşa bağlı farklılıkların nükleer ploidide mevcut olabileceğini ve tüm analizlerin 12−16 haftalık yetişkin dişi C57BL/6 fareler kullanılarak yapıldığını bilmelidir.

HNF4α immünetiketlemeden (protokol bölüm 3) sonra, kaliteli fiksasyon ve boyama sağlamak için geleneksel floresan mikroskobu kullanarak tüm slaytları kontrol etmek önemlidir(Şekil 2A). Hoechst'in bulaşması veya bulanıklaşması fiksasyondan önce yetersiz fiksasyon veya örnek bozulmasını gösterebilir(Şekil 2B), bu durumda protokol bölümü2'ye geri döner ve kesit ile fiksasyon arasındaki süreyi kısaltır (adım 3.1). HNF4α antikorile başarılı immünetiketleme, tipik olarak NPC'lere göre daha büyük ve yuvarlak olan pozitif olarak etiketlenmiş hepatosit çekirdeklerinin açık bir şekilde ayrımcılığı ile bu aşamada kolayca değerlendirilebilir (Şekil 2A). Parankim içindeki düzleştirilmiş/eliptik endotel çekirdekleri veya DDC yaralanmasını takiben periportal alanlarda genişleyen hücrelerin yoğun yamaları, immünboyamanın başarısını/başarısızlığını değerlendirirken HNF4α- NPC'leri tanımlamak için yararlı bir görsel referans görevi görebilir.

Nükleer segregasyon ve HNF4α eşik parametreleri (adım 5.2−5.4) otomatik görüntü analizinden önce (adım 5.6) protokol kesiti sonunda konvansiyonel floresan mikroskobu ile gözlenen immünboyama görsel deseni geniş yansıtacak şekilde dikkatle optimize edilmelidir(Şekil 2C). Optimal vs suboptimal nükleer segmentasyon ve HNF4α eşik protokolleri örnekleri Şekil 2D'deözetlenmiştir. Görüntü analizini takiben (adım 6.1.3), veriler DDC hasarı olan karaciğerdeki NP'lerin artan sayısını yansıtmalıdır(Şekil 2E),kontrol karaciğerindeki çekirdeklerin %52 ± %2,0'inden 21 günlük DDC tedavisinden sonra %72,8 ± %1,4'e kadar. Hepatositler kontrol karaciğerlerinde toplam çekirdeğin %48.0 ± 2.0'ını temsil eder, karaciğer histolojisinin önceki analizleri hepatositlerin doku hacminin %70−85'ini kapladığını gösterir, ancak toplam karaciğer hücrelerinin sadece %45−50'sini^{oluşturur18,19}. DDC beslemenin ilk 14 gününde HNF4α+ çekirdeklerinin sayısında küçük ama önemli bir azalma gözlenmektedir (Şekil 2F). Hepatosit nükleer alanın frekans dağılım çizimi (adım 6.2) 40−50 μm² boyut aralığında kontrol karaciğerlerinde tepe HNF4α+ nükleer alanı ve DDC yaralanması ndan sonra nükleer boyutta net bir sağ kayma gösterir(Şekil 2G); artmış ploidi ve hepatosellüler hipertrofi ile tutarlı¹².

Sağlıklı (gün 0) kontrol karaciğerlerinde HNF4α+ çekirdeklerinin %63.4 ± 1.7'sinde "basit" dairesel morfometri vardır(Şekil 5A). Bu rakam 21 günlük DDC yaralanmasından sonra %46.8 ± ± %5.7'ye (P = 0.042) düşer, muhtemelen poliploidizasyon sırasında ploididurumları arasında kaymaile ilişkili nükleer morfometrideki karmaşıklığı yansıtır (aşağıdaki "Nükleer morfometrinin yorumlanması"na bakınız). Bu yöntemle karaciğer kesitlerinde elde edilen nükleer ploidi dağılımlarının temsili örnekleri Şekil 5A'dagösterilmiştir, dna içeriğinin enterpolasyonunun tek bir örneklemiçinde tek tek hücrelerin tabakalaşmasına nasıl izin verdiğini açıklar. "Karmaşık" ve "basit" HNF4α+ hücrelerinin alt kümeleri için ortalama değerler de gösterilir (Şekil 5A). Veriler, erişkin murin hepatositlerinin %80−90'ında poliploidin önceki tahminleri ile tutarlıdır^2. Karmaşık çekirdeklerin sıklığı (%36.6 ± %1.7) kontrol karaciğerleri de binükleer hücrelerin yaklaşık (%35)²⁰, veri kesinlikle hücresel ploidi yerine nükleer bir ölçü olarak kabul edilmelidir rağmen (aşağıdaki "nükleer morfometri yorumu" bakınız). Kontrol (gün 0) ve DDC tedavi grupları arasında göreceli ploidin karşılaştırılması 2c ve 4c hepatosit çekirdeklerinin önemli kaybını yansıtmalı ve yaralanma ile birlikte artan sayıda >8c hücre(Şekil 5B). Her ploidi alt grup için göreli konumsal bilgiler, veri kümesi içindeki her çekirdekle ilişkili x-y koordinatlarının dağılım çizimi veya yüksek içerikli görüntü analiz yazılımı içinde belirli hepatosit alt kümelerinin 2B konumunu alarak sorgulanabilir (Şekil 5C).

Kalibrasyon
Kullanılan NPC kalibrasyon yönteminin geçerliliğini değerlendirmek için hnf4α ve proliferatif marker Ki-67 antikorlar kullanılarak karaciğer kesitlerinin çift immünetiketlemesi yapıldı (Şekil 6A,B). Bu veriler, hücre döngüsünün tüm aktif evrelerinde hücreleri etiketler ki-67 için zenginleştirme gösterdi, NPC minimal DNA dağıtım eğrisisağ tarafında (S_2c ve S_4carasında) - Nerede NPC DNA çoğaltma olması bekleniyor ve bu nedenle var >2c ploidy (Şekil 6A). Tüm kontrol ve yaralı karaciğer örneklerinin iç kalibrasyonu incelendikten sonra, Ki-67, %2c ploidy (%17.5 ± 6.6 SD, n = 12) ile karşılaştırıldığında %2c ploidy (17.5 % 6.6 SD, n = 12)(Şekil 6B), ploid kalibrasyon başarılı gösteren tahmini ploidiile "basit" NPC çekirdeklerinde (P < 0.0001) önemli ölçüde zenginleştirilmiştir. Bu veriler kullanılan yöntemin geçerliliğini destekler. Ayrıca, Ki67 doğru eşik varsayarak, onlar yüksek ploidi grupları "kontamine" gruplarının ne ölçüde subekvatoral nükleer maskeler aşağıda bazı nicel anlayış sağlar.

NPC kalibrasyon yönteminin geçerliliğini daha fazla test etmek için, fare 2N hepatositin (155,8 μm³)¹⁴⁾daha önce bildirilen nükleer hacmine dayalı harici bir kalibratör tanıtıldı. Bu rakam HNF4a-çekirdekleri için Hoechst yoğunluğunun ortalama değeri ile birlikte kullanıldığında kontrol karaciğerlerinde ortalama hepatosit ploidi için ortaya çıkan tahmin internal (S_2c)kalibratörden ayırt edilemezdi(Şekil 6C). Ayrıca, karşılaştırılabilir yaş C57BL/6 fare suş farelerde ortalama hepatosit ploidy tahminleri de benzer, 2N hepatosit nükleer boyutu önceki ampirik bilgi gerekli olmadığını teyit, nükleer ploidy tamamen özerk tahmin etmek için bu dahili kontrollü metodoloji yapma.

Nükleer morfometrinin yorumlanması
Açıklanan yöntem "basit" dairesel morfometri ile hepatosit çekirdekleri için ploidi bir okuma sağlar. "Karmaşık" çekirdeklerin dışlanması, üst üste binen/dokunan nükleer maskelerle binükleer hepatositlerin bir oranını temsil ettikleri hipotezine dayanır ve bu alt küme için doğru ploidi tayini daha zorlu hale getirir(Şekil 7A). Daha da önemlisi, çekirdeklerin daireselliğe göre ayrılması, kullanıcının mononükleer hepatositlerin çekirdekleri ile benzer ploidin iki çekirdeğinin hücre içinde açıkça ayrıldığı binükleer hücrelerin çekirdekleri arasında ayrım yapmalarını sağlamaz. Bu, görüntü veri setlerinden binükleer ve mononükleer hücreleri el ile seçerek ve algoritma ya göre ayrıştırmalarını değerlendirerek ampirik olarak test edilmiştir(Şekil 7B). Fiziksel olarak yakın olan(Şekil 7C)ama "dokunmayan" binükleer hepatositlerin çekirdekleri algoritma tarafından "basit" olarak sınıflandırılırken, "dokunaklı" olanlar açıkça "karmaşık" olarak ayrımcılığa uğruyor. Bu nedenle, bu titreyen karaciğerhücresel ploidi bir okuma sağlamaz, binükleer hücrelerin çekirdekleri "basit" ve "karmaşık" alt sınıflar arasında bölünmüş olduğu göz önüne alındığında (Tartışma bakınız). Ancak, hücresel ve nükleer ploidi durumları arasında geçiş içine bazı anlayış sadece nükleer morfometri ve nükleer boyutu histogramları çizerek ve nasıl "karmaşık" ve "basit" durumların poliploidizasyon sırasında geçiş bir model uygulayarak bu verilerden elde edilebilir(Şekil 7D). Kontrol karaciğerlerinde nükleer morfometrinin üç evresi (I−III) açıkça görülmektedir (Şekil 7E). Sırasıyla dairesel 2N (I), 4N (II) ve 8N (III) nükleer maskelerin kümelemesini temsil ederler (Şekil 7D'degösterildiği gibi). Mononükleer 16N hepatositler yetişkin fare karaciğerlerinde son derece nadirdir^16,18,21, dolayısıyla 16N hücresel ploidi grubu neredeyse tamamen 8N çekirdekleri ile binükleer hücrelerden oluşur, içinde bulunan, ve sağda, faz III(Şekil 7E),faz III dairesellik düşüş açıklayan III. İlginçtir ki, yaralanma üzerine (DDC gün 14), artan karmaşıklık doğru nicel bir kayma ("binükleerite") evreleri I başlar (2n için 2x2n yansıtan) ve evreler III (8n için 2x8n yansıtan), sonunda üç aşamada konsolide önce (−III). Yazarlar artan karmaşıklık doğru bu kayma durmuş sitokinez kaynaklanan artan bir hücresel ploidi nedeniyle olduğunu spekülasyon, faz III sağ ters eğilim gözlenir ise, endoreplication nedeniyle yaralı karaciğer dairesel 16N mononükleer hücrelerin artan gösterimi nedeniyle. Bu gözlemler tabii ki düzgün hücresel ploidy için hesap yöntemi uyarlayarak test edilmesi gerekir (Tartışma bakınız).

Şekil 1: İş akışının özeti. Karaciğer dokusu hasat edilir (1), kriyosectioned (2), sabit ve immünolabelled bir HNF4α antikor ile parenkimal ve non-parakimal hücrelerin (NPCs) ayırt edici olmasını sağlar (3). Örnekler işlendikten sonra, otomatik görüntü yakalama (4) ve analiz(5)kullanılarak yüksek içerikli görüntüleme platformu kullanılarak sayısallaştırılır. Hücreler Hoechst nükleer floresan ve HNF4α immünükop eşiği ile segmente edilir. Daha sonra, Hoechst nükleer alan ("A") ve dairesellik ("C") hesaplanır. Son olarak, veriler analiz edilir (6); HNF4α- NP'ler sayısallaştırılmıştır (i) ve HNF4α+ hepatosit çekirdekleri nükleer daireselliğe (ii) göre iki alt kümeye ("basit" ve "karmaşık") ayrılır. Hepatosit nükleer ploidi Interpolasyonu sonra nükleer yarıçapı (r) ve ortalama Hoechst floresan yoğunluğu (nükleer DNA yoğunluğu için bir proxy olarak) (iii) bir fonksiyonu olarak tüm "basit" çekirdekleri için gerçekleştirilir. Veriler daha sonra örnek bir özet (v) derlemeden önce npt'ler dahili 2N kalibratör (iv) olarak tabakalanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kronik DDC besleme sırasında fare karaciğerinin yüksek içerikli görüntü analizi ve sitometrik profillemesi. (A) Yetişkin fare karaciğerinin HNF4α/Hoechst immünoffloresan boyantisi için 21 günlük beslenmeden sonra %0.1 DDC içeren bir diyetle temsili konfokal görüntüsü; görüntü, portal damarı ("PV") çevreleyen alanlarda hnf4α- NPT'lerin genişletilmesi ("H") ve hnf4α- NP'lerin genişlemesi ni yuvarlak HNF4α+ hepatosit çekirdeklerini gösterir. (B) Optimal ("doğru") ve suboptimal ("yanlış") nükleer Hoechst boyama kötü fiksasyon gösteren örnekler. (C) Nükleer Hoechst boyama ve HNF4α immünetiketlemegöre hepatosit ve NPC'leri ayırmak için yüksek iş letimasyonlu görüntü analiz platformunun kullanılması. Yazılım maskeleri (kırmızı/yeşil çizgiler) çekirdeklerin Hoechst floresangöre nasıl doğru bir şekilde bölünür ve HNF4α durumuna göre hepatosit (+) veya NPC'ler (-) olarak sıralanır. (D) Segmentasyon/eşik çözümlemesi için kurulumu optimize etme kılavuzu. Yazılım tarafından tanınan üst üste bindirilmiş nükleer maskeler, nükleer segmentasyon için yeşil/mavi çizgilerle ve eşik analizi için yeşil/mavi (HNF4α+) veya kırmızı/mavi (HNF4α-) ile gösterilir (H = hepatosit). Sorun giderme: Nükleer algılama hassasiyeti çok düşük (i) veya çok yüksek (ii) ayarlanır. HNF4α için eşik çok düşük (iii) veya çok yüksek (iv) olarak ayarlanır. (E,F) DDC besleme sırasında NPC ve hepatosit çekirdeklerinin kantitatif analizi: (E) HNF4α- ve (F) HNF4α+ nükleer yoğunluklar DDC tedavi süresine (gün) karşılaştırılabilir. Zaman başına 4−6 hayvandan toplam 5.7 x 10⁵ hücre analiz edildi. Veriler ortalama + SEM. **P < 0,01 ve ***P < 0,001 olarak sunulur. Tek yönlü ANOVA anlamına gelir karşılaştırmak için kullanılmıştır. Anlamlılık P değerleri Fisher'ın en az anlamlı fark (LSD) testi kullanılarak hesaplandı. (G) DDC tedavisi sırasında HNF4α+ nükleer alanın frekans dağılımı. Veriler, hücresel hipertrofi ve poliploidizasyon ile uyumlu yaralanma sırasında hepatosit nükleer alanda sağ kayma göstermektedir. Zaman puanı başına 4−6 hayvandan toplam^2,5x 10 5 HNF4α+ çekirdek analiz edildi. Bu rakam Manzano-Núñez ve ark.¹⁷değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Özel yazılı yazılım kullanılarak hepatosit nükleer ploidin in otomatik analizi. (A) Nükleer ploidy analiz yazılımına giriş için elektronik tablo verilerinin doğru biçimlendirmesini gösteren ekran görüntüsü. Temel verileri içeren sütunlar (protokolün adım 5.5' i) sarı olarak vurgulanır. Tüm sütun başlıkları belirtilenlerle tam olarak eşleşmelidir. (B) Biyolojik çoğaltmalardan ("Örnek1", "Örnek2", vb.) verileri içeren tek tek elektronik tablo dosyalarının her durum için alt klasörlerde nasıl adlandırılması ve düzenlenmesi gerektiğini gösteren ekran görüntüsü (bu örnekte "Control-d0" ve "Injured-d14" başlıklı). (C) Ploidi uygulaması (kırmızı daire) başarılı kurulumdan sonra ekran görüntüsü. Uygulama başlatıldığında (araçlar gezisinin MY APPS sekmesinde "Ploidy_Appl.."' düğmesine tıklayarak "Ploidy_GUI" görünür (alt panel). Deneme adı ("Örnek") ve denetime giden yollar (örneğin, "Control-d0") ve test (örneğin, "Yaralı-d14") veri kümeleri Çalıştır'ıtıklatmadan önce girilir. Yazılım daha sonra, en az DNA içeriği için eşikler oluşturmak için "Control-d0" veri kümesini kullanarak tüm numuneler için nükleer ploidi hesaplar, kalibre eder ve stratejibelirler. (D) Ploidy_Application gelen veri çıktısı, her bir ploidi grubundaki "basit" çekirdeklerin mutlak ve yüzde sayılarını içeren her örnek klasöre (i) otomatik olarak kaydedilen tek tek veri dosyalarını gösterir. Her durum için (bu durumda hem "Control-d0" hem de "Injured-d14"), tüm "basit" hepatosit ve hepatosit dışı çekirdekler (ii) için ortalama nükleer ploidy tahminleri içeren bir özet klasörü otomatik olarak oluşturulur ve her örnek için nükleer ploidin nasıl tabakalaştırılı olduğunu (iii). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: NCD'lerin dahili ploidy kalibratörü olarak kullanılması. (A) DDC hasarının hepatosit (HNF4α+) ve NPC (HNF4α-) çekirdeklerinin ortalama minimal DNA içeriği (m) üzerindeki etkisini gösteren grafik. Tüm veriler gün 0 NP'lere (zaman başına n = 4 hayvan) normalleştirilmiştir. (B) NPC_m değerlerinin tek bir temsili karaciğer örneğinde dağılımını açıklayan histogram (gün 0, toplam 7.180 çekirdek). Şema (üstte) dairesel NPC maskelerinin 2−4c DNA içeriğine sahip hücrelerden nasıl elde edilebildiğini gösterir. Kalibrasyon yönteminin amacı, NPC_m dağılımının (noktalı çizgi) üst sınırında 4c 'yi (S_4c)temsil eden tabakalaşma eşiğini tanımlarken, dağıtım eğrisinin uç uçlarında segmentasyon hatalarından kaynaklanan gürültüyü en aza indirmektir. (C) NPC (HNF4α-) çekirdekleri için ortalama Hoechst yoğunluğu ve nükleer alan değişiklikleri çizilir. Segmentasyon hatasını önlemek için yalnızca npc_m modunun 1 SD'sinde karşılık gelen NPC_m değerine sahip çekirdekler incelenir (sarı kutu). Bu aralıkta 2c−4c geçiş boyutu (t) hesaplanır ve S_4c'yitahmin etmek için veriler içinde bir bağlantı noktası olarak kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kronik DDC besleme sırasında fare karaciğerinde nükleer ploidin yerinde analizinde yüksek iş bilgililik. (A) Açıklanan metodoloji kullanılarak kontrol yetişkin karaciğer analizi. 2D karaciğer kesitlerinden hnf4α+ hepatosit çekirdekleri Hoechst nükleer daireselliğine göre iki gruba ayrılır: "basit" ve "kompleks". (Üst) Bu iki gruba ait hücrelerin temsili floresan Hoechst görüntüleri gösterilmiştir. (Sol) Bir örnekten basit HNF4α+ çekirdeklerinin tabakalaşmasını gösteren scatterplot (gün 0) enterpolasyonlu ploidi değerine, nükleer alana ve ortalama nükleer Hoechst yoğunluğuna göre. (Sağ) Kontrol karaciğerinde HNF4α+ hücrelerinin tipik dökümünü ayrıntılı olarak açıklayan pasta grafiği (gün 0) her nükleer ploidi alt sınıfın oranlarını gösterir. 4 hayvandan toplam 6.7 x 10⁴ HNF4α+ çekirdek analiz edildi. (B) DDC karaciğer hasarının hepatosit nükleer ploidi üzerine etkisi yerinde yüksek iş itimi ile. Grafikler, DDC beslemenin ilk 14 günü içinde 2c ve 4c hepatosit çekirdeklerinin oranında göreceli azalma gösterirken, >8c poliploid çekirdeklerin sayısı önemli ölçüde artacaktır. Toplam 1.5 x 10⁵ HNF4α+ çekirdek analiz edildi (n = 4 zaman noktası). Veriler ortalama + SEM. **P < 0,01 ve ***P < 0,001 olarak sunulur. Tek yönlü ANOVA anlamına gelir karşılaştırmak için kullanılmıştır. Önem P değerleri Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak hesaplandı. (C) Ploidy tabakalaşması için kullanılan aynı nicel kriterlere sahip yüksek içerikli görüntüleme verilerini sorgulayarak (dairesellik, nükleer boyut ve ortalama Hoechst yoğunluğu) bu yöntemle, nükleer ploidi alt sınıfların parenkim içinde nasıl parenkim içinde mekansal olarak izlenebildiğini gösteren örnek. Hoechst floresan görüntüleri, kronik DDC besleme s› s›ras›nda (14 ve 21. gün) iki zaman noktada karaciğerdeki 2c çekirdekleri sürücleyen yazılı maskelerle (kırmızı noktalar) gÜ PORTAL ven (mavi noktalı çizgi) ve NPC'lerin genişlediği periportal alanları (sarı çizgi) belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: NPC kalibrasyon yönteminin eleştirel değerlendirmesi. (A,B) Çoğalan NDC'ler başarıyla >2c ploidy skoru ile kategorize edilir. (A) Kontrol karaciğerlerinden NPC minimal DNA içeriğinin histogramı, antikorlarla birlikte HNF4α ve proliferatif marker Ki-67'ye (n = 4, veriler ortalama + SEM olarak sunulur). 2c (S_2c)ve 4c (S_4c)için tabakalaşma eşikleri belirtilir. (B) Açıklanan metodolojiye göre NCD'lerin tabakalaşması, çekirdeklerde Ki-67 immünetiketlemenin önemli ölçüde zenginleşmesiile sonuçlanır ve bir >2c ploidi skoru (n = 12). Veriler ortalama + SEM olarak sunulur. *P < 0.0001 araçlarını karşılaştırmak için eşleşmemiş t testi kullanılmıştır. (C) NPC kalibrasyon yönteminin dış geçerliliği. Dahili NPC kalibratör yöntemi kullanılarak elde edilen ortalama hepatosit nükleer ploidi tahminleri, 2N hepatosit^{ler için}bilinen bir nükleer hacmi ile aynı numunelerin kalibrasyonu (Control C57BL/6 fare karaciğeri 3−4 ay, n = 4) ile elde edilenlerle karşılaştırıldı. Veriler ayrıca 21^21,22 yaş 2−6 ay (noktalı çizginin sağında gösterilmiştir) aynı türdeki farelerden hepatosit nükleer ploidi tanımlayan iki bağımsız analizden sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Hepatosit nükleer morfometrihücresel ploidi ile "karmaşık" bir ilişki vardır. (A) Hepatosit hücresel ploidin (2N, 4N, 8N ve 16N) nükleer morfometrinin 2D analizi ile kısmen nasıl ayrıştırık olduğunun özeti. Binükleer hücreler (kırmızı), çekirdeklerin dokunaklı görünüp görünmediğine bağlı olarak "basit" ("S") ve "karmaşık" ("C") morfomemetreler arasında ikiye ayrılır. (B,C) Bireysel hepatositler nükleer morfometri ve nükleer aralıklar için el ile seçilmiş ve analiz edilmiştir. (B) "dokunma" çekirdekli binükleer hepatositler "karmaşık" (%100 ≤0.8), dokunmayan nükleer maskeli mononükleer hücreler (siyah) ve binükleer hepatositler "basit" idi (%94 >0.8). (C) binükleer hepatositlerin "Basit" çekirdekleri, nükleer aralıkların önemli ölçüde azalması nedeniyle mononükleer hücrelerin çekirdeklerinden ayırt edilebilir (n = 3, toplam 94 nükleus analiz edilir). (D) A panelinden hücresel ploidi hallerinin 2D nükleer morfometri ve nükleer alan açısından nasıl dağıtılabileceğine ve basit dairesel formların dört evreye bölünmesine (I−IV) neden olan model. (E) Kontrol karaciğerlerinde (gün 0) ve 14 gün (solda) ve 21 gün (sağda) DDC yaralanmasından sonra HNF4α+ nükleer morfometri/boyut çizimlerinin karşılaştırılması. Morfometri evreleri yukarıda (I−V) belirtilmiştir. Oklar, 2c ("a"), 4c ("b") ve 8c ("c") çekirdeklerinin iki nükleerizasyonu ile tutarlı yaralanmalardan kaynaklanan nükleer morfometrideki kaymaları ve 16N hücresel ploidi sınıfının (d) artan mononükleerizasyonunu gösterir. Toplam 29−30 x 10³ çekirdek her koşul da analiz edilir (n = 2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosyalar: Veri kümelerini gösterme. Bu dosyaları görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Minür karaciğerde doku remodeling ve hepatosit nükleer ploidi tahmini analizi için yüksek içerikli, yüksek iş çıkışlı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bir kez prosedür aşina, bir kullanıcı işleyebilir, görüntü ve 3−5 günlük bir süre içinde birden fazla örnek analiz, karaciğer sağlığı ayrıntılı bir imza sağlayan büyük test edilebilir veri kümeleri üreten. Örnek hazırlama yönteminin basitliği göz önüne alındığında, analiz edilen çok sayıda hücre ve doku alanı (ortalama 14 mm²/örnek) ile birlikte sonuçlar sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Görüntü yakalama ve analiz otomasyonu da bu önemli adımlardan kullanıcı hatalarını ve olası önyargıyı kaldırır. Önemli bir yenilik, ndc'lerin numuneler içinde ve arasında hepatosit nükleer DNA içeriğinin göreceli olarak değerlendirilmesini sağlayan dahili ploidy kalibratörü olarak kullanılmasıdır. Bir HNF4α etiketleme adımı nın dahil edilmesi bu nedenle daha önce yayınlanan 2D^{yöntemler3,12,22}ile karşılaştırıldığında benzersiz bir teknik avantaj ile bu protokolü sağlamak için anahtardır. Buna karşılık, 3D yeniden yapılanma iş akışları¹⁸ ile karşılaştırıldığında metodolojinin göreceli basitlik teknik olarak daha az zahmetli ve potansiyel olarak daha esnek hale getirir.

2D doku kesitlerinden nükleer DNA içeriğinin ekstrapolasyonunda önemli bir uyarı olan akış sitometrisinin hassas yöntemiile karşılaştırıldığında, ploidi durumu açısından tek tek çekirdeklerin kategorize edilmesine atfedilebilir sınırlı bir güvendir. Buna ek olarak, subequatorial örnekleme nedeniyle daha küçük ploidi alt grupları aşırı temsil etmek için SIA tabanlı yaklaşımlar içinde doğal önyargı olduğunu. Ancak, verileri bir iç standartta normalleştirerek ve büyük bir nüfus tabanlı yaklaşım alarak, bu etkilerden kaynaklanan hata azaltılır ve örnekler arasında karşılaştırılabilir. Hepatositler son derece yuvarlak nükleer morfoloji ile karakterizedir, örneğin NPT'ler ile karşılaştırıldığında, onlar özellikle tek başına nükleer kesit alanı¹⁰dayalı DNA içeriğinin doğru tahmin için münasip anlamına gelir 10^,11,14^,1515,23. Sia tabanlı yaklaşım, morfometri ve ortalama Hoechst floresan şiddeti ölçütlerini entegre ederek hem nükleer dairesellik hem de DNA yoğunluğunu hesaba katmak için bu protokolde geliştirildi ve bu da tek tek çekirdekler için tahmini "minimal DNA içeriği" tanımlayıcısı ile sonuçlandı. Daha da önemlisi, NPT'lerin 2−4N ploidi kontrolü olarak kullanılması, hnf4α (veya benzeri hepatosit nükleer marker) için uygun bir antikor temin edilebildiği göz önüne alındığında, tanımlanan metodolojinin herhangi bir tür veya biçimnumunesine uygulanabilir hale getirilmesiyle, objektif kalibrasyon ve minimal nükleer DNA içeriğinin tabakalaşması için önemli bir iç standart sağlar.

Nükleer ploidi değerlendirilmesi karaciğer hastalığı ilerlemesi için yararlı imzalar sağlamak için gösterilmiştir rağmen^10,13, karaciğer içinde ploidi değişikliklerin çeşitliliğini tam olarak tespit etmek için hem arzu ve hepatosellüler çevre ve böylece hücresel ploidi hesaba tanımlanan metodoloji adapte etmek gerekli olacaktır. Hücresel ploidi haritalama daha önce beta catenin¹⁰,^13,,24, actin^12,22 ve sitokeratin^10,,11 insan ve fare karaciğer örneklerinde gibi belirteçler kullanılarak hepatosit çevre etiketleme elde edilmiştir. Ancak, Bu DDC yaralanması sonra test edildiğinde, dramatik epitel remodeling phalloidin hem de hepatosellüler çevrenin güvenilir değerlendirilmesi engel (veri gösterilmez) veya beta catenin antikorlar¹⁷. Bu nedenle, bu yaklaşım uygulanabilir iken, tüm yaralanma modelleri için geçerli olmayabilir, ama elde edilirse hücresel ploidi haritalama ilerlemek yanı sıra hepatosit boyutu ve sayısı tahminleri daha doğru hale. Ayrıca, nükleer aralıklar(Şekil 7C),mononükleer hücreler gibi ek nükleer parametrelerin muhasebeleştirilerek "basit" binükleer hepatositlerden ayırt edilebildiği ve "karmaşık" binükleer hücrelerin 2B maskelerinin içerdiği çekirdeklerin radyal ölçümleri ile daha fazla ayrıştırılmasının sağlanabileceği de akla yatkındır.

FFPE doku²⁵ için doğrulanmış insan HNF4α antikorlarının mevcut olduğu ve iç kalibrasyonun türe özgü sınırlamaların bu metodolojisini serbest kattığı göz önüne alındığında, protokol insan örnekleri için hemen geçerlidir. Böylece, insan hastalığında hepatosit nükleer ploidi ve karaciğer hasarının yüksek iş bölümü analizi için bir kriter sağlamak için önemli bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, diğer antikorlar ile multiplexing tarafından, Bu yöntem belirli hepatosit alt kümeleri ve karaciğer hasarı ve hastalığa yanıt için yeni roller ortaya çıkarabilir. Bu amaçla, metodolojiyi proliferatif nükleer marker Ki-67(Şekil 6)için immünboyama ile başarıyla birleştirdik ve bu da yararlı bilgilerin toplanmasını sağlar - ploidy'in geliştirilmiş iç kalibrasyonu için çoğalmayan 2N npt popülasyonlarının tanımlanması da dahil olmak üzere (Noon, yayınlanmamış veriler 2019). Bu nedenle, yöntemin sağladığı konumsal ve nicel verilerle esneklik sağlayarak, gelecekteki uygulamalarının karaciğerde poliploidin rolünün anlaşılmasını iyileştireceğini öneriyoruz.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma İspanyol MINECO Hükümeti tarafından finanse edilmiştir BFU2014-58686-P (LAN) ve SAF-2017-84708-R (DJB). LAN ulusal MINECO Ramón y Cajal Bursu RYC-2012-11700 ve Plan GenT ödülü (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) ve FMN tarafından Valencian Generalitat ACIF/2016/020 bölgesel ValI +D öğrenciliği tarafından desteklendi. RP, Prof. Ewa K. Paluch'a fon için teşekkür etmek istiyorum. Biz IN Hücre Analizörü platformu ile yardım için Dr Alicia Martínez-Romero (CIPF Sitometri hizmeti) teşekkür ederiz.