Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

İki-foton mikroskobu Nörobilim için temel bir araçtır gibi uzamsal ölçeklerde canlı hayvanların beyin soruşturmasına izin verir olarak alt hücresel ağ seviyeleri ve zamansal ölçekler milisaniyelere kadar hafta. Buna ek olarak, iki foton görüntüleme beyin fonksiyonu ve davranış arasındaki nedensel ilişkileri keşfetmek için davranış görevleri çeşitli kombine edilebilir. Ancak, memelilerde, sınırlı penetrasyon ve ışık saçılma çoğunlukla yüzeysel beyin bölgelerine iki foton intravital görüntüleme sınırlı, böylece Hippocampus gibi derin beyin alanlarının uzunlamasına soruşturma önleyen. Hipokampus mekansal navigasyon ve epizodik bellek içinde yer almaktadır ve uzun süren bir model öğrenme ve hatırlama, hem sağlık ve hastalık için önemli hücresel yanı sıra bilişsel süreçler okumak için kullanılır. Burada, canlı farelerde dorsal hipokampus kronik optik erişim sağlayan bir hazırlık ayrıntılıdır. Bu hazırlık, birkaç hafta içinde baş sabit, anestezize canlı fareler içinde hücresel ve hücre içi çözünürlükte iki foton optik görüntüleme ile kombine edilebilir. Bu teknikler, dorsal hipokampal CA1 'de yüzlerce nöron için onlarca nöronal yapı veya aktivite-uyarılmış plastisite tekrarlanan görüntüleme sağlar. Ayrıca, bu kronik preparat, mikro-Endoskopi, baş monte geniş alan mikroskobu veya üç foton mikroskobu gibi diğer tekniklerle kombinasyon halinde kullanılabilir, böylece cep telefonu ve ağ süreçlerini çalışmak için araç kutusunu büyük ölçüde genişletmektedir öğrenme ve hafızada.

Memelilerde Hippocampus, epizodik hafızaların yanı sıra uzamsal navigasyon^1,2,3,4için kodlama ve geri çağırma için anahtar bir beyin bölgedir. Bu nedenle, Hippocampus olmuştur-ve hala-çok önemli bir model beyin kodlamak ve anıları hatırlamak izin temel mekanizmaları incelemek için^5,6,7 veya bir ortamda gezinmek için^{8 ,9} ödüller toplama ve tehlikeleri kaçınarak. Buna ek olarak, hipokampal oluşumu, yeni nöronların kemirgenler^10,11 ve muhtemelen insanlar^12,13yaşam boyunca oluşturulan beyin bölgelerinden biridir. Son olarak, hipokampal oluşumunun dejenerasyonu veya bozukluğu, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar ile ilişkilidir¹⁴.

Farelerde, hipokampus beyin yüzeyinin yaklaşık 1 mm altında bulunur¹⁵. Konumu, sağlam beyninde optik erişim engelledi ve dolayısıyla, hipokampal dinamiklerin boyuna çalışmalar çoğunlukla manyetik rezonans (MR) görüntüleme, Elektrofizyoloji ve ex vivo görüntüleme analizlerine güvenmiştir. MR görüntüleme yöntemleri, biyolojik süreçlerin takibine izin verir (örn., gen ifadesi değişiklikleri¹⁶) aynı hayvan içinde birden fazla gün, ama tek nöronlar ayrımcılık için uzamsal çözünürlük eksikliği. Klasik in vivo elektrofizyolojik teknikleri çok yüksek temporal çözünürlük ve membran potansiyelinin değişikliklere zarif hassasiyet sunar. Ancak, sınırlı bir uzamsal çözünürlüğe sahip ve daha uzun zaman dilimlerinde aynı hücreleri güvenilir bir şekilde izlemek için yeteneği eksikliği. Optik görüntüleme, yüksek temporal ve uzamsal çözünürlüklerde sayesinde daha çeşitli süreçlerin incelenmesine olanak tanır. Ancak, ex vivo görüntüleme yalnızca devam eden süreçlerin anlık görüntülerini sağlar ve böylece hayvanların bilgi öğrenmesi ve Hatırlanacağı uzunlamasına çalışmalar için uygun değildir.

In vivo optik görüntüleme, MR görüntüleme ve elektrofizyolojisinin bazı avantajlarını optik görüntüleme ile birleştirir. Bu nedenle, çok iyi fare beyin dinamikleri ve davranışının uzunlamasına ve bağıntılı analizler için uygundur. Bu, çok hızlı (milisaniyeye kadar) veya çok yavaş (haftalar) zaman ölçekleri ile Biyolojik süreçler çalışmaları ile ilgilidir. Nörobilim için uygun olan bu tür süreçler için örnekler membran voltajı dinamikleri, CA^{2 +} geçişler, hücresel plastisite ve yapısal değişiklikler, tüm bellek oluşumu ve hatırlama için çok önemli olduğuna inanılmaktadır. Farklı yöntemlerle dorsal hipokampus^{18,19,20,21,22}' ye vivo görüntüleme genişletilmiştir. Akut preparatlar, piramit nöron (PN) aktivitesinin yanı sıra dendritler ve dendritik dikenler birkaç saat için izleme izin verdi^20,22. Bu temporal zaman dilimi, ancak, uzun vadeli yapısal değişikliklere izin vermez, hangi artımlı öğrenme altında yatan olabilir, incelenecek. Kronik preparatlar-mikro-endoskoplar ile kombinasyon halinde^23,24 veya uzun çalışma mesafesi (WD) standart mikroskop hedefleri²¹ -birkaç üzerinde dorsal hipokampus tekrarlanan görüntüleme sağladı Hafta.

Burada, kalıcı olarak eklenmiş bir görüntüleme kanül kullanarak yaşayan fareler dorsal hipokampus CA1 alt alanına tekrarlayan optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık tarif. Bu hazırlık, fonksiyon bozukluğu olmaksızın CA1 'e tekrarlanan erişim sağlar ve intravital iki foton (2P) veya geniş alan epifluorescence görüntüleme için uygundur. Canlı fareler dorsal CA1 içinde 2P derin beyin kronik görüntüleme iki örnek ayrıntılı: dendritik yapı ve dendritik omurga dinamikleri ve aktivite-uyarılmış plastisite boyuna görüntüleme uzunlamasına görüntüleme. Tekniğin esnek avantajları ve sınırlamaları tartışılmaktadır.

Açıklanan yöntemlerin tümü üst Bavyera Hükümeti tarafından onaylanmıştır (lisans 2016_ROB-55.2 VET-2532. Vet_02-16-48) ve Stanford ve Max Planck Florida Enstitüsü tarafından Nörobilim laboratuvar hayvan bakımı yönetim panelleri.

1. görüntüleme kanülün hazırlanması

1. Hareketli cetvel tablosu ile birlikte verilen bir matkap standı üzerinde hassas bir matkap tutun.
2. 3,0 mm çapında paslanmaz çelik tüpü hareketli cetvel masasına kelepçele.
3. 1,6 mm uzunluğunda metal bir yüzük için tüpü keser. Eğer yüzük kenarları kestikten sonra künt değilse, usulsüzlükler dışarı dosya.
4. Metal yüzük ve dairesel 4 mm çapında cam lamel magazini% 100 aseton içinde durulayın ve ≈ 5 dk için kurumaya bırakın.
5. Metal yüzük ve cam lamel magazini bir stereoscope altında, pürüzsüz, hatta ve temiz bir çalışma yeri üzerine yerleştirin.
6. Bir damla UV-kür optik yapışkan bir petri tabak gibi pürüzsüz bir yüzeye yerleştirin. İnce (< 0.5 mm) katmanını oluşturmak için yapıştırıcıyı yaymak için bir iğne veya spatula kullanın.
7. Metal halka bir tarafı yapıştırıcı içine daldırma için forseps kullanın. Halka iç mühür değil özellikle dikkat. Bu durumda, halka optik yapıştırıcı kırmak için bir iğne kullanın.
8. Stereokapsamı kullanarak, metal halkası cam lamel magazini ortasına yapıştırma lamel magazini dokunmadan kaplı halka yanında konumlandırın. Yapışkan bir ince halka metal yüzük ve coverslip arasındaki arayüzde oluşturmalıdır. Coverslip merkezine yayılan herhangi bir yapışkan kaçının.
9. UV-kür LED sürücü ünitesi ve parlaklık ışık (365 Nm) 1 dakika için açın.
   DIKKAT: UV ışığı cilt yanıklarını provoke eder ve mutajisik bir ajandır. UV koruma gözlükleri giyin ve eller ve kolları eldiven ve deri pozlama önlemek için bir laboratuar-ceket ile kapak.
10. Yapıştırıcı eşit tedavi etmek için, halka tüm kenarları eşit ışık kaynağının yönünü değiştirerek aydınlatılmış olduğundan emin olun.
11. Yapışkan en az 2 saat, tercihen, bir gecede sertleşmesine izin verin.
12. Bir hemostat yoluyla metal halka açık ucunda kanül sıkıca tutun. Dönen bir dosya ile donatılmış ve stereokapsam altında çalışan bir diş matkap kullanarak, halka yanları ile floş kadar fazla cam lamel magazini kapalı dosya (Şekil 1a).

2. görüntüleme kanülün dorsal hipokampus üzerinde implantasyon

1. Ekipman ve Kurulum hazırlığı
   1. Tüm cerrahi enstrümanların temiz ve steril olduğundan emin olun. Sterilizasyon için cam boncuk Sterilizatörü kullanıyorsanız, enstrümanları temizleyin ve bunları kullanmadan önce 10 dakika boyunca sterilizatörü (250 °C ' ye ayarlayın) yerleştirin. Alternatif olarak, kullanmadan önce aletleri otoklav.
   2. Ameliyat için gerekli tüm materyalleri, hem de cerrahi enstrümanları, böylece kolayca ulaşılabilmesi için hazırlayın.
   3. Ağrı kesiciler veya anti-inflamatuar ilaçlar gibi yeterli taze hazırlanmış ilaçlar olduğundan emin olun.
   4. Ameliyatın tüm süresi boyunca yeterli isofluran olduğundan emin olun (ameliyat başına yaklaşık 1 saat).
   5. Isıtma halısını açın ve anestezi altında hayvan sıcaklığını kararlı tutmak için 37 °C ' ye ayarlayın.
   6. Isoflurane için atma sisteminin çalıştığından emin olun.
   7. Oksijen akışının valfi açın.
2. Anestezi indüksiyon ve hayvan fikreme
   1. Fare anestezi indüksiyon odasına 1 L/min O₂ % 3 izofluran yerleştirin ve bilinç kaybeder kadar bekleyin. Ayak tutam refleks testi kullanarak anestezi değerlendirmek.
   2. Hayvanı tartın.
   3. Anti-inflamatuar (Meloxicam, 1mg/kg) ve ağrı kesici (Vetalgin, 200mg/kg) ilaçlar subkutan uygulayın.
   4. Fare Isıtma halı üzerinde konumlandırın. Hayvan termal yanıkları önlemek için Isıtma halı ile doğrudan temas olmadığından emin olun.
   5. Kafa stereotaktik cihaz için güvenli ve burnu kapsayacak şekilde burun koni konumlandırın. Anestezinin korunması için, ısofluran 'ı% 1,5-2 ' ye azaltın. Ameliyat boyunca, görsel olarak nefes izleme ve ayak tutam refleks test ederek fare durumunu izleyin. Gerekirse Isoflurane yüzdesini düzenleyin.
   6. Susuzlaştırma ve potansiyel körlüğü önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
      Not: anestezi ve hayvan ilaçları Için alternatif yöntemler ve ilaçlar mümkündür. Lütfen, hayvan lisansınıza ve göreli literatürüne bakın.
3. Optik kanül implantasyonu
   1. Fiber optik ışık kaynağını açın.
   2. Saç çıkarın ve fare kafası üzerinde cilt dezenfekte.
   3. Makas ve forseps kullanarak, fare kafa derisi çıkarın. Lambda yakın bir konumda kafa derisi küçük bir kesim yaparak başlayın. İki tarafta kafa derisi açarak devam edin. Önce kulaklar yönünde yanal hareket, sonra rostrally, göz yörüngeleri yönünde, sagittal ekseni üzerinde bir üçgen oluşturmak için, yaklaşık 4 mm rostral bregma için. Kulak ve gözler çok yakın kesmek için dikkat, ama kemiğinin ve lambda, yanı sıra parietal kemikler ve frontal kemikler posterior yarısında açığa.
   4. Kafatasına bir damla (≈ 10 mg) lidokain (alkolde% 28,9 v/v) uygulayın.
   5. Periost temizleyin ve bir pamuklu çubuk kullanarak kafatası kurutun.
   6. Fare kafasını düzeltmek için kulak çubuklarını konumlandırın.
   7. 0,5 mm genişliğinde Burr ile mikro matkap kullanarak küçük bir kraniyotomi yapın. Deliği ön kemiğe karşı görüntülenmiş hipokampus, yaklaşık 1,5 mm sagittal sütür ve 2 mm uzak koronal sütür uzakta konumlandırın.
   8. 0,86 mm genişliğinde paslanmaz çelik kemik vidasını kafatası deliğine vidalayın.
   9. Gerekirse, enkaz temizlemek ve kafatası kuru.
   10. Hızlı yapıştırıcı çimento karışımı hazırlanması
       1. Küçük bir kaşık (≈ 4,5 mm çapı) kullanarak, 1-1,5 seviyeli L-toz kaymasını bir karıştırma kuyusu halinde dağıtır.
       2. Hızlı baz 3-4 damlalarını kuyu içine dağıtın.
       3. İyi içine Universal Catalyst 1 damla dağıtma.
       4. Karıştırın Mix 5-10 için bir hassas aplikatör kullanarak s.
          Not: alternatif çimentolar mevcuttur. Lütfen üreticinin talimatlarına bakın.
   11. Kafatası, vida ve çevreleyen cilt üzerinde hızlı yapıştırıcı çimento uygulamak için hassas aplatörler kullanın. 30 s için 1 dakika kurumaya bırakın.
   12. Parietal kemikte kraniyotomi yapmak için 3,0 mm çap trefin matkap kullanın. Delik yaklaşık 1,5 mm sagittal sütür ve 2 mm uzak lambdoid sütür uzak konumlandırın.
   13. Kemik kapağını dikkatlice çıkarın.
   14. Uygun olduğundan emin olmak için kanül kullanarak kraniyotominin boyutunu kontrol edin. Gerekirse kraniyotomi büyütmek için 0,5 mm veya 0,9 mm genişliğinde mikro matkap kullanın.
   15. Dumont forseps kullanarak menenjlerin çıkarın.
   16. Ablate kortikal madde, dış kapsüle ulaşmak için. Bir vakum pompasına bağlı 0,9 mm çap (19 ölçer) künt iğne kullanın. Maruz kalan dokuların dehidrasyon önlemek ve kanama çözüldükten sonra kalıntı kan yıkayın için tuzlu ile irrigate. Emmek kortikal doku yavaşça, ≈ 50-100 μm bir seferde, korteks kapsüllerden ayrılıncaya kadar, beyin veya Corpus kallozumlifleri açığa. Tıkanma önlemek için, sık iğne değiştirin.
   17. Elyaflar ağırlıklı olarak üç yönde uzanır (Şekil 1B). Derin lifleri (hipokampusAlveus ) maruz kalıncaya kadar dorsal lifleri dikkatle soyma.
   18. Dokusunu tuz ile durulayın. Alt kanül tuz içine daldırma ve kafatası deliği üzerinde konumlandırmak için ince forseps kullanın. Kanül ve doku kanül ve doku arasında hava kabarcıkları bindirme önlemek için tuz ile mühürlenmiş olması gerekir.
   19. Cam lamel magazini liflerle temas edene kadar kanül kafatasına (Şekil 1C) itin.
   20. Emici üçgenler, pamuk bezlerden ve/veya vakum pompası kullanarak iyi kafatası kuru.
   21. Hızlı yapıştırıcı çimento karışımı hazırlanması (2.3.10. adıma bakın).
   22. Kafatası üzerinde hızlı yapıştırıcı çimento uygulamak için hassas aplatörler kullanın. Ayrıca kanülün kenarına yapıştırıcı uygulayın. Yapışkan kanül içine çalıştırmak izin vermeyin dikkatli olun. 30 s için 1 dakika kurumaya bırakın.
   23. Kafatası ile temas halinde bir baş tutucu plakasını kanül üzerine yerleştirmek için stereotaktik bir kol kullanın.
   24. Diş akrilik karışımı hazırlanması
       1. Bir kaşık (≈ 9 mm çapında) kullanarak, 1 seviye Kepçe (1 parça) tozu bir karıştırma kuyusu halinde dağıtır.
       2. Aynı iyi sıvı 2-3 parçaları dispense. Tüm tozu sıvıyla koru.
       3. Bir spatula kullanarak ≈ 1 dk için karıştırın.
          Not: alternatif Akrilikler mevcuttur. Lütfen üreticinin talimatlarına bakın.
   25. Kranium üzerinde akrilik uygulamak için bir spatula veya hassas aplikatör kullanın. Kapak tüm maruz kafatası, vida ve diş akrilik ile açık cilt. Bu hazırlık kararlı hale getirir. Akrilik boyun, kulak ve gözleri çalıştırmak izin vermeyin.
   26. Akrilik kuru ve yaklaşık 15 dakika sertleşmesine izin.
   27. Enkaz kanül girmesini önlemek için, baş tutucu plaka üzerine çıkarılabilir bir yapışkan film uygulayın. Bu film boyutu plaka eşleşmeleri önerilir.
   28. Isoflurane akışını kapatın, hayvanı stereotaktik cihazdan çıkarın ve anesteziden uyanırken fizyolojik vücut sıcaklığını korumak için bir Isıtma plakasına konumlandırın.
   29. O sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazandı kadar hayvanı izleyin.
   30. Sadece tam olarak kurtarılan diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş hayvan dönün.

3. ameliyat sonrası bakım

1. Ağırlık ve genel davranışı izleyerek, ameliyat sonrasında 2 gün için farenin durumunu kontrol edin.
2. Ameliyatı takiben 2 gün boyunca anti-inflamatuar (Meloxicam, 1mg/kg) ve ağrı kesici (Vetalgin, 200mg/kg) ilaçlar subkutan uygulayın
   Not: postoperatif bakım için alternatif izleme prosedürleri, ilaçlar ve Dozajlar mümkündür. Lütfen, hayvan lisansınıza ve göreli literatürüne bakın.

4. görüntüleme seansının hazırlanması

1. Görüntüleme kurulumunu önceden açın ve gerekirse lazerin ısınması ve stabilizasyonu için izin verin.
2. Fare anestezize (adım 2.2.1 bakın).
3. Yapışkan filmi baş tutucu plakasından dikkatle çıkarmak için forseps kullanın. Fareyi bir elle ve baş tutucu plakasının parmaklarıyla tutun. Hazırlığa zarar vermemek için filmi yavaşça çıkarın.
4. Fareyi mikroskop altında, Isıtma halısının üzerine getirin ve kafa plakasını tutucuya sabitleyin (Şekil 1D).
5. Burun konisini, burnu örtbas etmek ve Isoflurane 'ini% 1,5-2 ' ye düşürmek için konumlandırın.
6. Fare gözleri için oftalmik merhem uygulayın.
7. Görüntüleme kanülsini deiyonize suyla durulama ile temizleyin. Bir şırınga ve ince iğne kullanın kanül ve bir vakum pompası içine su düşürmek için kaldırmak için.

5. görüntüleme oturumu

1. Kalıntı su, kir, bütünlük ve floresans varlığı için kanulu görsel olarak kontrol etmek için düşük büyütme, uzun çalışma mesafesi hedefleri kullanın.
2. Baş tutucu kollarının açıları ayarlayarak kanül optik eksenine hizalayın.
3. 25X 1,0 NA, 4 mm WD veya 40X 0,8 NA, 3 mm WD, su daldırma hedeflerini değiştirin. Kanül doldurmak için yeterli deiyonize su ekleyin ve kanülün üstünde aşırı su korumak. Hava kabarcıklar oluşumundan kaçının.
4. 2P uyarma ve görüntü floresan sinyalleri kullanın.
   Not: görüntüleme protokolü, görüntülemesi gereken zaman ve uzamsal ölçeklerde son derece bağımlıdır. Bu makalede gösterilen görüntüleri üretmek için kullanmış olduğumuz görüntüleme ayarları hakkında ayrıntılar için lütfen bölüm temsili sonuçlarına ve tartışmalara bakın.

Kanül CA1 sadece dorsal yerleştirilir beri, CA1 dorsal yönü, ventral bir karşılaştırıldığında mikroskop daha proksimal. Alveus , Stratum Oriens (so), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) ve stratum lacunosum moleküler (slm), en distal katman (rakamlar 1B) tarafından takip edilen en proksimal yapıdadır. , C). Hücre çözünürlüğü ile nöronal yapının uzunlamasına 2P görüntüleme ve hücresel çözünürlüğe sahip aktivite-uyarılı plastisite temsili sonuçlar olarak sunulmaktadır. Fluorophores yeşil floresan protein (Gfp), d2Venus ve TurboFP635, bir femtosaniye darbeli Ti: Sapphire lazer 920 nm için ayarlanmış ve ortalama lazer gücü, numune 5-25 MW için ayarlanır heyecanlandırmak için. Farklı emisyon dalga boyları emisyon filtreleri ve farklı fotomultipler tüpler kullanılarak ayrılır.

Dendritik yapı ve dendritik dikenler dinamikleri uzunlamasına görüntüleme.

Hipokampal PNs 'i seyrek olarak etiketlemek ve yapısını görselleştirmek için Thy1-GFP transjenik fare çizgisi (M hattı) kullanılır. Thy1-Gfp fareler bir seyrek, PNS²⁵rasgele nüfus Thy1 Organizatör kontrolü altında sitoplazmik gelişmiş Gfp ekspres. Genellikle, CA1 PNs büyük ekseni kabaca XY-görüntüleme düzlemine dik (rakamlar 1B, Şekil 2a ve Tamamlayıcı film 1). Bazal dendritler so genişletir, Soma kanül doğru, apikal ve apikal tutam dendritler kanül için distale uzatmak ise, ters yönde (Tamamlayıcı film 1). Preparat Alveus 'un en derin liflerini sağlam bırakmasından dolayı, kanülün hemen altında, görüş alanını geçebilen birkaç floresan lifleri görünür olmalıdır (Şekil 2a ve Film 1). Hazırlık, PN dendritler omurga çözünürlüğü ile görüntüleme sağlar (Şekil 2 A-C). Görüntü dendritler ve dendritik spines, bir 25x 1,0 na, 4 mm WD, su daldırma ticari objektif lens kullanılır.

Uzunlamasına izleme için, kanülün görüş alanı içinde birkaç beyin bölgeleri ilk görüntüleme oturumunda tanımlanır. Her bölge yaklaşık 240 x 240 μm alana karşılık gelir ve 1 ile 7 dendritik segmentler arasında bulunur (Şekil 2B). Bu bölgeler, görüntüleme kanülün altındaki birimde GFP ifadesinin desenini gösteren düşük büyütme üç boyutlu yığınıyla el ile eşleştirilir (Şekil 2a). Sonra, CA1 PN bazal dendritler 1 μm z aşamalı görüntü yığınları yaklaşık 14 gün (Şekil 2C) kadar farklı zaman aralıklarında (24 saat 3 gün) elde edilir. Daha uzun görüntüleme süreleri ve aralıkları mümkündür²⁶. Her görüntüleme oturumu yaklaşık 60 ila 90 dakika sürmektedir. Çoğu görüntü so dendritik dikenler olmasına rağmen, aynı zamanda eğik dendritler içinde görüntü dendritik dikenler mümkündür SR (rakamlar 2D-F). Omurga yoğunluğuna ek olarak, bu yöntem, hayatta kalma, kazanç ve kayıp oranlarını ölçmek suretiyle omurga dinamiklerinin incelenmesi sağlar²⁶,^{27,28,29,30, 31 , 32}. zaman içinde dendritik dikenler puan ve izlemek için (Şekil 2C), özel bir MATLAB arayüzü kullanılır. Bu, farklı zaman noktalarında elde edilen görüntü yığınları hizalamasını sağlar ve zaman içinde dendritik uzunlukları ve omurga pozisyonları takip ederken dendritler ve dikenler manuel etiketleme destekler²⁶. Önemlisi, bu yöntem önceden mevcut ve yenidoğan dendritik spines arasında (her zaman noktasıbaşına , ilki hariç) ayırt etmek için kullanılabilir. Bu dendritik dikenler farklı sınıflar bellek edinme ve saklama³³farklı rolleri olduğu düşünülmektedir olarak önemlidir.

Aktivite-uyarılmış plastisite uzunlamasına görüntüleme.

Bir görüntü aktivitesi için-CA1 PNs, dorsal CA1 hipokampal alan bir viral vektör yeşil floresan d2Venus sinaptik aktivite-duyarlı eleman (E-SARE) ark içinde gelişmiş bir form yoluyla istikrarsızlaştırılmış ifade ile enjekte edilir artırıcı/organizatör ve kırmızı floresan TurboFP635 aracılığıyla EPGK Organizatör³⁴. Bu her hayvan³⁵CA1 PNS yüzlerce aktivite uyarılmış plastisite görüntüleme seviyeleri için izin verir. PNS çok yoğun etiketleme göz önüne alındığında, genellikle CA1 PNS dendritler çözmek mümkün değildir (Tamamlayıcı film 2).

CA1 PNs, bir 40X 0,8 NA, 3 mm WD, su daldırma objektif objektif somata görüntü için kullanılır. Uzunlamasına izleme için, ilk görüntüleme oturumunda 1 ila 9 beyin bölgesi fare başına tanımlanır. Her bölge yaklaşık 300 x 300 μm olan bir alana karşılık gelir ve 50 ile 150 arasında hücre içerir (Şekil 3A). Bu bölgeler, daha düşük bir büyütmede görülebilir yerel doku simgeleriyle el ile eşleştirilir. Sonra, 3 μm z-Step görüntü yığınları, yaklaşık 30 güne kadar farklı zaman aralıklarında (24 saat ile 6 gün arasında), CA1 PNs (Şekil 3A ve Tamamlayıcı fılm 2) SP 'yi kapsar. Her görüntüleme oturumu yaklaşık 60 ila 90 dk. e-Sare aktivasyon doruklarına 6 ila 8 h yeni veya zenginleştirilmiş bir ortama (ee, Şekil 3B) bir pozlama sonra ve birkaç gün boyunca bozunmaları sürer. Böylece, biz genellikle görüntü 6 için 8 saat deneyim sonra ve izin 5 görüntüleme oturumları arasında³⁵gün.

D2Venus ve TurboFP635 floresan değerlerinin ölçülmesine yönelik olarak, bir nöral hücre gövdesine göre daha küçük olan ve Soma hücresine ortalanmış dairesel bir 4,64 μm çapı çizilir. Sonra sonraki zaman noktasına ilerleme, aynı şekilde aynı hücrenin Soma puan ve tüm zaman noktaları ve uzunlamasına veri kümesindeki tüm görünür hücreler için bu yordamı yinelemek. Her neuron (aktiviteye bağlı) d2Venus emisyonunun ortalama değeri, ortalama (aktivite bağımsız) TurboFP635 emisyonu ile normalleştirilir. Bu yöntem, CA1 PNs³⁵ (Şekil 3c) topluluk plastisite uzun vadeli dinamiklerinin soruşturulması sağlar.

Şekil 1: in vivo derin beyin optik görüntüleme hazırlığı. (A). üst (sol) ve yan (sağ) örnek görüntüleme Cannuals görünümleri. Görüntüleme kanüller Hippocampus optik erişim sağlamak için şeffaf bir cam alt vardır. (B). görüntüleme kanulunun göreli konumunu vurgulayan hazırlığın şematik açıklaması, BIR CA1 PN ve dorsal 'dan ventral liflerin üç tabakası. (C, D). Görüntüleme oturumu sırasında görüntüleme kurulumunun (C) ve hayvan fiksasyonu (D) şematik açıklaması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Dendritik yapı ve dendritik dikenler dinamikleri uzunlamasına görüntüleme. (A). 2p görüntü yığını (Maksimum yoğunluk projeksiyon (mıp) 59 görüntü düzlemleri, 2 μm z-Aralık) nöronlar ve dendritler Gfp tarafından etiketlenmiş canlı bir THY1-Gfp fare. (B). yüksek büyütme (MIP of 53 görüntü düzlemleri, 1 μm z-Aralık) ayrıntılı bazal dendritler içinde bulunan so. (C). 14 gün boyunca görüntülenmiş bir dendritik segmentin zaman atlamalı görüntü dizisi. Ok uçları, dendritik dikenler 14 gün boyunca izlenen gösterir. (D, E). canlı bir Thy1-GFP faresi içinde GFP tarafından etiketlenmiş nöronların ve dendritlerin 2P görüntü yığını; (D) ZY projeksiyon (31 görüntü uçağı, 3 μm z-Aralık) ve (E) XY projeksiyonları (17 görüntü uçağı, 3 μm z-Aralık). (F). yüksek büyütme (tek görüntü düzlem) içinde bulunan apikal dendritler ve dendritik dikenler detaylandırma SR. ok uçları dendritik dikenler gösterir. Uyarma: 920 Nm; emisyon tepe: 510 Nm. Ölçek çubukları: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D ve E, 15 μm; F, 4 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Şekil 3: Aktivite-uyarılmış plastisite uzunlamasına görüntüleme. (A). 2p görüntüleri (tek görüntü düzlemleri) canlı bir fare, aynı hücreleri gösteren temel gün 0 ve sonra Ee gün 1. (B). 2p görüntü yığınları (mıps of 4-6 görüntü düzlemleri, 3 μm z-Aralık) a (gün 1, 19 ve 25) ve çevre B (gün 7 ve 13) Için özel E-Sare etkinleştirme desenleri gösteren. Yeşil: d2Venus flüoresan. Kırmızı: TurboFP635 flüoresan. Uyarma: 920 Nm; d2Venus emisyon tepe: 530 nm; TurboFP635 emisyon tepe: 635nm. Ölçek çubukları: A, 20 μm; B, 10 μm. Bu rakam Attardo et al., 2018³⁵güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: Üç foton (3P) mikroskobu kullanılarak hipokampal DG nöronal yapının görüntülenmesi. (A-H). GFP tarafından etiketlenmiş bir canlı Thy1-GFP faresi (A-E), CA1 ve (F-H) granül hücrelerinde DG 'de PNs olan nöronların ve dendritlerin 3P görüntüleri (tek görüntü uçakları). Uyarma: 1400 Nm; emisyon tepe: 510 Nm. Ölçek çubuğu: 40 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Tamamlayıcı film 1: canlı Thy1-GFP faresinde görüntüleme alanı. 2 p görüntü yığını (83 görüntü düzlemleri, 7 μm z-Aralık) ve GFP tarafından etiketli dendritler (beyaz) canlı bir Thy1-GFP faresi, kanülün alt kısmından SLM 'a kadar uzanıyor. Artan derinlik ile floresan sinyalinin çürümesini hesaba eklemek için, fotomultiplier tüplerin kazanımı doğrusal olmayan bir degrade kullandık. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Ek film 2: aktivite-uyarılmış plastisite görüntüleme. 2P görüntü yığını (28 görüntü düzlemleri, 3 μm z-Aralık) E-SARE muhabirinin ıEG ifadesi olan SP. Green: d2Venus floresans kapsayan canlı bir fare ifade nöronların. Kırmızı: TurboFP635 flüoresan. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Burada, canlı fareler içinde dorsal CA1 tekrarlanan 2P görüntüleme için bir prosedür açıklanmıştır. Ameliyattan sonra, fare genellikle 2 gün içinde kurtarır. Prosedür en az astrogliosis^26,43. Ameliyatı takip eden hemoraj ve ödem genellikle 10 ila 14 gün içinde yeniden adsoryatur. Genellikle, 14 gün sonra implantasyon sonrası hazırlık intravital görüntüleme yapmak için yeterince açıktır. Ameliyatın başarısı steril bir ortamda çalışmaya bağlı değildir. Ancak, cerrahi ilişkili enfeksiyonlar nedeniyle komplikasyonları önlemek için, yüksek düzeyde hijyen sağlamak için çok önemlidir. Bu, ameliyattan önce ve sonra cerrahi enstrümanları titizlikle temizleyerek ve her kullanımdan hemen önce ısı sterilizasyon yoluyla elde edilir (adım 2.1.1). Optik kanül temiz, sterilize edilmiş bir kap halinde tutulur ve implantasyon hemen önce steril tuz ile durulanır. El dezenfeksiyon ve cerrahi istasyon temizliği ile ilgili yaygın cerrahi uygulamalar yapmak da çok önemlidir. Hazırlık istikrarlı kalır ve birkaç hafta için hücresel ve hücre içi çözünürlük görüntüleme sağlar^26,35.

Kritik adımlar, değişiklikler ve sorun giderme.

En derin lifleri maruz kadar dış kapsül soyma önemlidir. Alveus açığa başarısız PNS Soma odaklanmak için yetersizlik neden olabilir, ya da azaltılmış çözünürlük görüntüleme dendritik spines, 3-veya 4-mm WD ile ticari hedefleri kullanırken. Bu amaçla, bir 0,9 mm çapında iğne kullanarak çok yavaş neokorteks ablate ve daha sonra en dorsal lifleri çıkarmadan emme daha ince bir kontrol için 0,3-0.5 mm çapında (24-29 Gauge) iğne geçmek yararlıdır. Alternatif olarak, ince forseps fiber pozlama³⁶sonra kalan korteks kaldırmak için kullanılabilir.

Ameliyat sırasında kanama sorunlu olabilir, çünkü kan görüşü engelliyor. Pıhtının oluşmasına ve sonra da kalan kanı yıkamak için tuzlu su ile durulaması bekleniyor. Gerektiğinde tekrarlayın.

Kanül ve kraniyotomi arasında uygun bir uyum, özellikle kanülün dış kenarı kafatası ile floş ise, çimentonun uygulanmasından önce kanulayı yerinde tutarak hazırlığın stabilitesini artırmaya yardımcı olur. Trefin matkap ve kanül boyutları eşleştirilir beri, gevşek bir uyum kanül tarafında düzensizlikleri nedeniyle ortaya çıkabilir-uygun biraz daha büyük kraniyotomiler gerektirir (adım 2.3.14 bakın)-veya düzensiz kraniyotomi. Herhangi bir kanül düzensizlikleri (adım 1,3 ve 1,12) kapalı olmalıdır ve kraniyotomi tamamlanana kadar trefin kafatasına dik tutulmalıdır (adım 2.3.12). Kraniyotomi tamamlanmadan önce kafatasından trephinin çıkarılması düzensiz kraniyotomiye neden olabilir.

Sınırlamalar- Preparatın Invasiveness ve istikrar.

Doğrudan ve dolaylı olarak etkilenen alanları tam olarak tanımlamak zor olduğu için kortikal ablasyon etkisini değerlendirmek zordur. Genel olarak, cerrahi parietal korteks bir parçası kaldırır ve görsel ve hindekstremite duyusal korteks parçası²¹. Abalı korteks doğrudan Hippocampus ve hipokampal doku proje değil ne dokundu ne de yaralandı. Daha da önemlisi, bir görüntüleme kanulunun implantasyonunun hipokampal fonksiyonunu ve özellikle hipokampal-bağımlı öğrenme^{21,36,37,38, 39}. Yine de, hangi ölçüde hem kanül ve implant dış kısmı (baş tutucu plaka ve Dental Akrilik Kapak) ölçmek için önemli olacaktır kronik stresler ile karşılaştırıldığında kortikoone kan seviyeleri ve adrenal bez ağırlığı değerlendirerek implante edilmemiş fareler.

Hazırlık genellikle haftalar aylar²⁶istikrarlı kalır. Uzun vadede, cilt ve kemik büyüme akrilik kap yerinden ve görüntüleme hazırlama istikrarsızlık artırmak eğilimindedir.

Optik sınırlamalar.

Konvansiyonel 2p mikroskobu, neokortikal doku^40,41yaklaşık 1 mm derinliğe kadar görüntüleme sağlar. Bu ile tutarlı, görüntü dendritler ve dendritik dikenler bulunan mümkündür SR (Şekil 2D-F) veya slm³⁶. Ancak, bir kanül aracılığıyla görüntüleme etkili NA sınırlamaları oluşturur. Maksimum çözünürlüğü elde etmek için, görüntüleme kanullarının çapı ve derinliği, daha küçük çaplar ve daha uzun derinliği yüksek NA hedeflerini aydınlatacak şekilde görüntüleme NA ile eşleştirilmelidir. Örneğin, 1,6 mm uzunluğunda bir kanül ile 1,0 NA su daldırma amacı ile görüntüleme, tam NA tutmak için bir 3,65 mm iç çapı gereklidir. Ancak, bu çapın bir kanül kullanarak Hippocampus üzerindeki sıkıştırma artar ve doku sağlığını etkileyebilir, bu nedenle, daha küçük bir çapla bir kanül kullanıyoruz. 1,6 mm uzunluğunda bir kanül ile 0,8 NA su daldırma amacı ile görüntüleme, bir iç çapı 2,5 mm tam NA tutmak için yeterli olacaktır. Ancak, 0,8 NA su daldırma hedefleri daha kısa bir WD (3 mm bizim durumda), SP odaklanmasını engelleyebilir.

Bu hesaplamalar, kanül altındaki görünüm alanının merkezine uygulanır. Ancak, görünümün görüntüleme alanı yana hareket-daha yakın kanül kenarları-veya doku içine daha derin odaklama-daha uzak kanül cam yüzeyinden-daha fazla odak düzleminde etkili na azalır ve böylece çözünürlüğü azaltır. Bu, farklı hacim görüntülenmiş doku arasında homojen olmayan çözünürlüğe yol açacaktır ve özellikle 2P-STED mikroskobu⁴²gibi süper çözünürlüklü teknikler kullanırken, alt hücresel çözünürlükte nicel görüntüleme için bir endişe olabilir. Bu sorunlar, hücresel çözünürlükte görüntüleme yaparken daha az önemlidir.

Doku hareketi.

Doku içinde hareket-anestezize hayvanların nefes ve kalp atışı kaynaklanan-görüntüleme kanüden artan mesafe ile daha şiddetli hale eğilimindedir. Bunun nedeni, görüntüleme kanülinin beyne mekanik basınç uygulatması ve böylece kanülün çevresinde (neokortikal preparatlara benzer şekilde) bazı hareketlerle karşı koymak olması muhtemelen. Böylece, dendritik dikenler görüntüleme mümkün olmasına rağmen SR ve slm, bizim elimizde, bu kadar ≈ 200 μm kanül yüzeyinden kadar en sağlam dorsal olduğunu. Hareketi telafi etmek için rezonant tarayıcılar ve çevrimdışı ortalamasını kullanırız. Çeşitli görüntüler (4-6 tekrarlar) en yüksek hızda (30 kare/s) bir z-yığınının görüntü düzlemi başına elde edilir. Her z-düzlem için tüm tekrarlar daha sonra (ticari yazılım, AutoQuant kullanarak), kayıtlı (ımagej kullanarak) ve tek bir resim²⁶ortalamasını deconvolved vardır. Somata görüntüleme için, hareket genellikle anestezi³⁵ üzerine ihmal edilir ve iki ortalamalar genellikle hareket eserler telafi etmek için yeterlidir.

Gelecekteki uygulamalar veya yöntemin yön .

Preparat mikro-endoskoplar ile kombine edilebilir^26,43. Mikro-endoskoplar, derin doku¹⁸' e kadar ışığa rehberlik etmek için degrade refraktif indeksini (sırıtma) mikromercekten kullanan rijit Optik Problar. Mikro-endoskopların kullanımı daha küçük çapların kanüller veya hiç kanüller sağlar. Ancak, ticari mikro-endoskoplar daha az optik sapmalar için düzeltilmiş ve ticari hedefleri daha düşük NA var. Geçerli problar sırasıyla^17,18,44, ≈ 0.6-1 μm, ≈ 10-12 μm lateral ve Aksiyel çözünürlüklerde ulaşır. Mikro-endoskopların kullanımı da bu preparatın baş montajlı entegre Widefield mikroskoplar^45,46,47ile kombinasyonunu sağlar.

Yöntem aynı zamanda anestezik olmayan farelerde kullanmak için kendini ödünç, ve CA kullanarak hücresel aktivite araştırmak için kullanılan olmuştur^{2 +} uyanık kafa-sabit fareler^21,37,48,49. Bu durumlarda, fluoresans değişimlerinin hızlı zaman ölçekleri nedeniyle, hat kaydı⁵⁰uygulanması tavsiye edilir. Dentat girus (DG)^39,51,52gibi diğer hipokampal alt bölgelerinin görüntülenmesi için hazırlanmaya adapte olmak da mümkündür. 3P uyarılma⁵³ile bu hazırlık birleştiren^,54 1 MHz frekans darbeli Lazer ile 1400 nm için ayarlanmış, biz moleküler katmanına ulaşan hipokampal oluşumu daha derin görüntü başardık, granül hücre tabakası ve DG hilusunda (Şekil 4) CA1 overdöşeme çıkarmadan.

Sonuç olarak, dorsal hipokampus optik erişim sağlayan bir yöntem sunuyoruz ve hipokampal yapı ve aktivite dinamiklerinin uzunlamasına ve bağışık çalışmalar sağlar. Bu teknik, fizyolojik ve patolojik koşullarda hipokampal fonksiyonun analizinin olanaklarını genişletir.

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

U. A. F. Schram Vakfı tarafından desteklenmektedir; C.-W. T. P. ve W. G. Max Planck Derneği tarafından desteklenmektedir; Ly ve R.Y. Max Planck Derneği ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01MH080047, 1DP1NS096787) tarafından desteklenmektedir; A. C. Avrupa Araştırma Konseyi, ERANET ve ı-CORE programlardan bir FP7 Grant, Israil Sağlık Bakanlığı baş bilim adamı ofisi, Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı, Roberto ve Renata Ruhman, Bruno ve Simone Lich tarafından desteklenmektedir. Nella ve Leon Benoziyo nörolojik hastalıklar Merkezi, Henry Chanoch Krenter Biyomedikal görüntüleme ve Genomics Enstitüsü, Israil Bilim Vakfı Perlman ailesi, Adelis, Marc besen, Pratt ve Irving ı. Moskowitz temelleri; A. A. Max Planck Derneği, Schram Vakfı ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmektedir. 3P görüntüleri, nörobilim için Max Planck Florida Enstitüsü 'nde nörogörüntüleme teknikleri gelişmiş kursu sırasında elde edilmiştir. Nörogörüntüleme teknikleri gelişmiş kursu Max Planck Derneği, Florida State Max Planck bilimsel burs programı ve Max Planck Florida Institute Corporation ortaklık programı tarafından desteklenmektedir. Kurs sırasında 2P/3P görüntüleme sistemi için destek ve ekipman sağlamak üzere Thorlabs, tutarlı ve SpectraPhysics 'e teşekkür etmek istiyoruz. Biz de Henry Haeberle ve Melissa Eberle ders sırasında sistem ile yardım için minnettarız.