Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

Biz Lucifer Sarı (LY) hCMEC / D3 hücre monolayers, insan kan-beyin bariyerinin bir in vitro modeli görünür parasellüler geçirgenlik belirlemek için sağlam bir belirteç olduğunu göstermek için bir floresan tahlili salıyoruz. Bu analizi, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde etkili bir monolayer oluşumunun kinetiklerini belirlemek için kullandık.

Kan-beyin bariyeri BBB, gerekli olmayan iyonlar ve toksik maddelerin değişimini önlemek için sistemik dolaşım ve beyin arasında bir bariyer oluşturan endotel hücrelerinden oluşur. Sıkı kavşaklar (TJ) etkili bir bozulmamış bariyer sonuçlanan monolayers parasellüler alanı mühür. Bu çalışmada, görünür geçirgenlik katsayısını (P uygulaması) belirlemek için kullanılabilen LYtabanlı floresan titreci açıklanır ve buna karşılık konjenital monolayers oluşumunun kinetik ve ortaya çıkan sıkı kavşak hCMEC/D3 monokatmanlarında bariyer bütünlüğü. Transfected hücrelerde TJ fonksiyonel bütünlüğünü belirlemek için bu tispatın ek bir yararını da gösteriyoruz. LY P_uygulama analizinden elde edilen veriler, transwell kurulumunda tohumlanan hCMEC/D3 hücrelerinin LY parasellüler taşımayı 7 gün sonra kültürünü etkili bir şekilde sınırladığını göstermektedir. Sunulan çıktının ek bir faydası olarak, DNA nanopartikül transfeksiyonunun hCMEC/D3 monokatmanlarında LY parasellüler aktarımını değiştirmediğini de gösteriyoruz.

Kan-beyin bariyeri (BBB) beyin dokusuna plazma bileşenlerinin akını sınırlayan koruyucu bariyer ve perisitler gibi destekleyici hücreler ile birlikte beyin endotel hücrelerinden oluşur. BBB'nin ana rolü, nöral mikroçevrenin hemostazını korumak için periferik kan ve merkezi sinir sistemi (CNS) arasındaki boşluğu kapatan bir bariyer görevigörmektir. Beyin kapiller endotel hücreleri etkili hücreler arası sıkı kavşakoluşumu yoluyla parasellüler yolu mühür (TJs)¹. Bu koruyucu bariyer, glikoz ve seçilmiş besinlerin beyne girmesini sağlarken, iyonların, toksik maddelerin ve ilaçların çoğunun bu sıkı bariyerden geçmesini engeller. Koruyucu rolünün yanı sıra, BBB'nin doğal bariyer işlevi CNS'yi hedef alan ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde ciddi bir sorun teşkil etmektedir.

BBB in vitro hücre kültürü modelleri biyolojisini incelemek ve ilaç tedavisinin TJ bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini anlamak için yararlı araçlardır. İnsan beyin endotel 3'ün kabul edilen bir modeli olduğu ve bbb'nin birçok fonksiyonlarını özetlediğinden, insan serebral mikrovasküler endotel hücre hattını (hCMEC/D3) in vitro model olarak kullandık. hCMEC/D3is bbb in vitro modelleme için en sık kullanılan hücre hatlarından biridir^4,5,6,7,8,9. Bariyer sıkılığının bir ölçüsü olan transendotel elektrikdirencinin (TEER) nispeten düşük değerlerine rağmen, bu hücre hattı beyin endotel hücrelerinin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin çoğunu korur. cokültürd glial hücreler^6,7. hCMEC/D3 hücre hattı, kararsız fenotiplere defarklılaşma geçirmeden yaklaşık 35 geçişine kadar aktif taşıyıcılar ve reseptörler de dahil olmak üzere birden fazla BBB belirteçlerini ifade eder^{6,7,9 ,10,11}. Bir in vitro BBB modeli olarak hCMEC/D3 hücre hattının en çarpıcıözelliği TJs 5,^9,11,12oluşturmak için yeteneğidir. Kök hücre kaynaklı BBB modellerinin hCMEC/D3 hücre hattı ile karşılaştırıldığında birçok çalışmada daha yüksek geçirgenlik gösterdiği ve bazı BBB belirteçlerini ifade ettikleri unutulmamalıdır, ancak en yaygın BBB hücre modeli¹³olarak gelişmemiştir. Daha da önemlisi, kök hücre türetilmiş BBB modelleri hücrelerin kararlı BBB fenotipleri korumakiçin izin maksimum geçiş sayıları ile ilgili olarak karakterize olmaya devam 14 .

Teer ölçümü, sakaroz, inulin, Lucifer Sarı gibi küçük hidrofilik tracermoleküllerinin görünür geçirgenlik katsayısının (P uygulaması) ölçümü de dahil olmak üzere TJ bariyer bütünlüğünü belirlemek için üç ana yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. vb. ve claudin-5, ZO-1, oklüdin, vb⁵gibi TJs bilinen moleküler belirteçleri immunostaining . TEER, gözenekli membran substrat⁵üzerinde kültürlenmiş hücre monolayers arasındaki elektrikdirencini ölçen nispeten basit ve nicel bir yöntemdir. Ancak TEER değerleri, kültür ortamının bileşimi ve ölçüm aletinin türü gibi deneysel değişkenlerden etkilenebilir. Bu faktörlerin olası bir kombinasyonu, hCMEC/D3 hücre hattında 2-21 gün 13'te 2 ila 1150 Ωcm² arasında değişen TEER değerlerinin geniş bir dağılımına yol açar. İmmünoboyama, hedeflenen proteini antikorlar kullanarak etiketleyerek TJ proteinlerinin varlığını belirlemek için kullanılan görsel bir yöntemdir. Ancak, immünboyama deneysel eserler ve floresan sinyalleri zaman içinde kaybolabilir neden olabilir hücreleri düzeltmek / permeabilize ihtiyacı da dahil olmak üzere deneysel adımlar, bir dizi içerir. Yukarıdaki etkenler veri kalitesini etkileyen öznel hatalara yol açabilir.

Bu çalışmanın temel odak noktası, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde enfluent monolayer oluşumunun kinetiklerini belirleyen LY tabanlı belirgin geçirgenlik testini sunmaktır. Co-kültür sistemleri, mikroakışkan sistemler gibi diğer gelişmiş in vitro BBB sistemleri, fizyolojik olarak daha uygun mimikler önemli ölçüde geliştirilmiş bariyer fonksiyonu^15,16,17, hCMEC/D3 ile transwell kurulumu, TJ oluşumunun kinetiklerini tahmin etmek ve farklı ilaç formülasyonlarının bariyer fonksiyonu üzerindeki etkisini hızla taramak için basit ve güvenilir bir modeldir. Genel olarak, P_uygulama değerleri hCMEC/D3 monokatmanlarında çeşitli hidrofilik soluteler için tutarlıdır. Örneğin, farklı in vitro BBB modellerinde çeşitli düşük moleküler kütleli soluteler (sakaroz, mannitol, LY, vb. gibi) için bildirilen P_uygulama değerleri 10^-4 cm/dk^{5,18,19 , 20}- Deneysel kurulumumuzda beyin endotel hücreleri in vivo bariyerini taklit etmek için hücre eki ve monolayer oluşumu için kollajen kaplı mikrogözenekli membran üzerine seri olarak eklenir. Apikal tarafa eklenen LY'nin hücreler arası sıkı kavşaklardan geçmesi ve basolateral tarafta birikmesi beklenmektedir. Basolateral tarafta ki LY konsantrasyonlarının daha fazla olması olgunlaşmamış, tam olarak işlevsel olmayan bir bariyeri gösterirken, daha düşük konsantrasyonlar olgun bir bariyerle sonuçlanan fonksiyonel TJ'lerin varlığı nedeniyle sınırlı taşımayı yansıtır.

LY farklı uyarma / emisyon zirveleri ile bir hidrofilik boya ve sakaroz, mannitol veya inulin gibi radyolabel tracer molekülleri ihtiyacını önler. Böylece LY'nin floresan değerleri, BBB monokatmanları arasında parasellüler geçirgenliğini doğrudan hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, floresan²¹gibi küçük Stokes vardiya muzdarip biyomedikal alanlarda kullanılan birçok ticari boyaile karşılaştırıldığında, LY Stokes kayması yeterli spektral ayırma ile yaklaşık 108 nm, böylece LY floresan veri olarak izin parasellüler geçirgenliği belirlemek için sağlam okuma. Biz sıkı kavşak marker protein, ZO-1, kültür zaman içinde ifade değişiklikleri göstermek için bir ortogonal teknik olarak Batı lekeleme kullanılır. Batı lekeleme yoluyla saptanan ZO-1 ekspresyonu LY P_uygulama verilerini tamamlamak için kullanılır ve bu veriler LY P_uygulama değerlerinde gözlenen değişikliklerin kademeli olarak sıkı kavşak işareti, ZO-1 ifadesi.

Daha önce de belirtildiği gibi, bu çalışmanın odak noktası, fonksiyonel sıkı kavşaklara sahip bir tek tabakanın oluşumunu izlemek için basit bir teknik olarak LY tözünü göstermektir. Ancak, geliştirilen testin ek bir faydasını göstermek için, LY P_{uygulamasını} DNA nanopartikül enine hCMEC/D3 monolayers cinsinden ölçtük. Nükleik asitler polimerlerin pozitif yüklü grupları ve nükleik asitlerin negatif yüklü fosfat grupları arasında elektrostatik etkileşim yoluyla 100-200 nm çapında polielektrolit nano tanecikleri içine yoğunlaşmış olabilir^{22, 23}. Bu kompleksleri çalışmamızda DNA nano tanecikleri (DNA NPs) olarak adlandırıyoruz. Amacımız hücreleri transfect ve istenilen proteinifade etmek iken, biz hCMEC / D3 monolayers bariyer özellikleri ödün olmadığından emin olmalısınız. Verilerimiz, standart 4 saat luciferase gen transfeksiyon rejiminin, LY P uygulamasının yararını gösteren LY geçirgenliğini, TJ bariyer bütünlüğündeki değişiklikleri belirlemek için ölçülebilir bir şekilde değiştirmediğini göstermektedir.

1.Genel hCMEC/D3 hücre kültürü

1. Dondurulmuş hücrelerin resüsitasyonu
   NOT: Tüm hücre kültürü bakım ve deneyleri steril bir biyogüvenlik başlığı içinde yapılmıştır. Kültür ortamı, takviyeleri ve reaktifleri ya steril ürünler olarak satın alındı ya da mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için 0.22 μm membran filtre kullanılarak filtrasyon yoluyla sterilize edildi.
   1. Bir doku kültürü şişesine 8,5 mL kollajen çözeltisi (0,15mg/mL) ekleyin (75 cm² büyüme alanı; bundan böyle T75 olarak anılacaktır) ve 1 saat boyunca bir kuvöze (37 °C, %5 CO₂₎yerleştirin.
   2. Kollajen çözeltisini çıkarın ve şişeyi sterilize fosfat tamponlu salin (PBS) ile hafifçe yıkayın. Şişeye 15 mL tam büyüme ortamı ekleyin ve CO₂ kuluçka makinesinde 15 dakika bekletin.
      NOT: Tam orta (son konsantrasyon) fetal sığır serumu (%5), penisilin-streptomisin (%1), hidrokortizon (1,4 μM), asit askorbik (5 μg/mL), kimyasal olarak tanımlanmış lipid ile desteklenmiş Endotel Hücre Büyümesi Bazal Orta-2 (500 mL) içeriyordu. konsantre (1/100), HEPES (10 mM) ve temel fibroblast büyüme faktörü (1 ng/mL).
   3. Sıvı nitrojen tankından dondurulmuş hCMEC/D3 hücrelerinden oluşan bir cryovial'ı hareket ettirin ve şişeyi 37 °C'lik su banyosunda (< 1 dk) hızla eritin.
   4. Bir kez buz sadece küçük bir pul görünür, hızlı bir şekilde aspire ve önceden ısıtılmış orta içeren şişe hücreleri aktarın. Yavaşça büyüme ortamı ile hücrelerin karıştırılması için şişe sallamak.
   5. Şişeyi kuvöze yerleştirin (37 °C, %5 CO₂₎ve hücrelerin bağlı olduğundan emin olmak için 2 saat sonra hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
   6. Hücreler şişenin dibine bağlandıktan sonra, eski büyüme ortamını kaldırın ve eski büyüme ortamı24'te dimetilsülfoksityerine 10 mL taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin.
   7. 24 saat sonra, mil şeklindeki hücreleri gözlemlemek için hafif bir mikroskop altında kontrol edin ve eski büyüme ortamını önceden ısıtılmış taze büyüme ortamıyla değiştirin.
2. Hücre kültürü bakımı
   1. % 100 birleştiği kadar her gün büyüme ortamı doldurmak. Eski büyüme ortamını çıkarmadan önce ve taze büyüme ortamı ekledikten sonra mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Kuvözden şişeyi alın ve sağlıklı görünmelerini sağlamak için hCMEC/D3 hücrelerini faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.
      NOT: Hücrelerin çoğunluğu şişenin altına ilolmalı, iğ şeklinde morfolojisi olmalı ve çoğu zaman membranlarının etrafında ışık kırılması da görülür. Büyüme orta şeffaf olmalıdır (olmayan bulutlu) ve pembemsi-turuncu renkli.
   2. Eski büyüme ortamını şişeden çıkarın ve önceden ısıtılmış 10 mL'lik taze ortamı şişeye aktarın.
      NOT: Hücre eki etkilememesi için ortam doğrudan hücre yüzeyine değil, şişenin üst tarafına eklenmelidir.
   3. Şişeyi yatay konuma geri döndürün ve birkaç kez hafifçe sallayın ve şişeyi kuvöze (37 °C, %5 CO₂₎geri vermeden önce mikroskop altında hCMEC/D3 hücrelerini kontrol edin.
   4. Hücreleri normal kültür çalışmaları sırasında ve deneyler sırasında, hücreleri kullanmadan önce ve sonra her seferinde ters ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Laboratuvar defterine hücre numarası veya morfolojisindeki gözle görülür değişiklikleri kaydedin.
3. Hücre geçişi
   1. Kuvözde 1 saat (37 °C, %5 CO 2) 8,5 mL kollajen çözeltisiiçeren yeni bir T75 şişesi inkübatın.
   2. Kollajen çözeltisini çıkarın ve şişeyi sterilize PBS ile hafifçe yıkayın. Yeni şişeye önceden ısıtılmış hCMEC/D3 ortamının 10 mL'sini ekleyin ve şişeyi kuvöze yerleştirin(37 °C, %5 CO 2).
   3. Kuvözden şişeyi alın ve hücrelerin %100 konfluent olup olmadığını kontrol etmek için hCMEC/D3 hücrelerini faz kontrastmikroskobu altında inceleyin.
   4. HCMEC/D3 hücre ortamını hücre içeren şişeden çıkarın ve hCMEC/D3 hücrelerini 10 mL PBS ile yıkayın.
      NOT: Büyüme ortamına eklenen FBS α1-antitripsin ve α2-makroglobulin gibi proteaz inhibitörleri içerir. Bunlar tripsinizasyon işlemini engeller. Bu nedenle, tripsinizasyon sürecinin inhibisyonunu önlemek için FBS izlerini kaldırmak için PBS ile hücreleri yıkamak esastır.
   5. %0,02 EDTA içeren %0,25 tripsin çözeltisi ve kuvözde 2-5 dakika (37 °C, %5CO 2) için trypsinize ekleyin (ayrışmaya yardımcı olmak için yanlara yavaşça şişeye dokunun).
      NOT: Hücreleri asla tripsin/EDTA'da 6 dakikadan fazla bırakmayın.
   6. Trypsinization işlemini durdurmak ve hCMEC/D3 hücresini birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak yeniden askıya almak için önceden ısıtılmış hCMEC/D3 ortamının 10 mL'sini ekleyin. Daha sonra, 15 mL tüp içine şişeden tüm hücre süspansiyon kaldırın.
   7. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini 15 mL'lik tüpten önceden ısıtılmış taze ortamla yeni şişeye aktarın (hücreleri 1:10'da bölün) ve yeni şişeyi kuvöze geri döndürün.
      NOT: Yeni şişeye aktarmadan önce, pipet hücre konsantrasyongradientlerini en aza indirmek için hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı yaslayın.

2. Hücre kaplaması

1. Mikro gözenekli membranlar (gözenek boyutu: 0.4 μm, malzeme: polietilen tereftalat (PET)) ile doku kültürü ekler yerleştirin 24-iyi kültür plakası içine.
2. Her doku kültürü eklemek kollajen tip I (0.15 mg /mL) 400 μL ekleyin ve CO₂ inkübatör (37 °C, 5% CO₂₎1 saat için inkübat. Doku kültürü ekler mikro gözenekli membran üzerinde kollajen çözeltisi bile yayılmasını sağlamak için 24-iyi plaka yavaşça rock.
3. Kollajen çözeltisini çıkarın ve mikro gözenekli membranı 0,4 mL 1x PBS tamponile hafifçe yıkayın.
4. Hücre uçlarında 50.000 hücre/cm² yoğunluğuna sahip hCMEC/D3 hücreleri (500 μL ortadaki 15.000 hücre).
   NOT: Her doku kültürü insertindeki hücre sayısı farklılıklarını en aza indirmek için, hücre süspansiyonu kesici uçlara hücre eklemeden önce 10 mL'lik pipetle yeniden askıya alınmıştır.
5. Hücre bağlanmasına ve çoğalmasına izin vermek için 24 kuyulu plakayı dokukültürü kurulumu ile bir kuvöze (37 °C, %5 CO 2) yerleştirin.
6. Hücrelerin %100 biraraya gelmesi için 7 gün boyunca plakayı kuluçkaya yatırın. Büyüme ortamını her gün çıkarın ve önceden ısıtılmış taze ortamın 0,5 mL'sini doku kültürü kesici uçlarına aktarın.
7. 12 kuyulu plaka, 48 kuyulu plaka ve 96 kuyulu plaka üzerine kaplama işlemini (adım 2.2-2.6) tekrarlayın. ZO-1 ifadesindeki değişiklikleri belirlemek için Batı lekeleme için 12 kuyulu plakayı kullanın. DNA NP transfeksiyonu için 48 kuyulu plakayı kullanın. Transfected hücrelerde hücre canlılığını belirlemek için ATP tsay için 96-iyi plaka kullanın.

3. Hücre büyümesinin kinetik.

1. Kollajen kaplı 24 kuyulu doku kültür plakasında hücreleri 50.000 hücre/cm² yoğunlukta tohumlayın.
2. Deneyin her gününde, büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 500 μL 1x PBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Daha sonra % 0,02 EDTA içeren %0,25 tripsin çözeltisinin 30 μL'sini ekleyin ve plakayı bir kuluçka makinesinde yaklaşık2-5 dakika (37 °C, %5 CO 2) bırakın.
   NOT: Konsepsiyon monolayer'ın kademeli oluşumu hücre kopma derecesini etkileyebilir ve burada belirtildiği gibi tripsin/EDTA hacimlerini artırmak gereklidir: tohumlama sonrası 1-5 gün için 30 μL, tohumlama sonrası 60 0L ve tohumlama sonrası 8-10 gün boyunca 100 μL .
3. Her kuyuda 500 μL hücre süspansiyonu hazırlamak için adım 3.2'ye eklenen trypsin/EDTA çözeltisinin hacmine göre 470 μL, 440 μL veya 400 μL büyüme ortamı ekleyin.
4. Her bir kuyuda birkaç kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak hücreleri askıya alın ve tüm hücrelerin büyüme ortamında askıya olduğundan emin olmak için mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Bazı hücreler birkaç kez pipetleme sonra hala plaka alt bağlı ise, yavaşça hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın.
5. Adım 3.3'te 500 μL hücre süspansiyonundan 0,1 mL hücre süspansiyonu çıkarın ve 1,5 mL'lik bir tüp ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonuna 0,1 mL %0,4 Trypan mavisi çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.
6. %70 isopropil alkol ile bir hemacytometre temizleyin. V-oluğunda her iki tarafa 3,5 adımdan 20 μL karışım ekleyin ve mikroskop altında 16 kareleri bulun. 16 kare tek bir ızgara olarak kabul edilir. Hemacytometer her iki tarafında iki rasgele ızgaraları bulmak ve tüm canlı, mavi olmayan hücreleri saymak.
   NOT: Mavi renkte görünen hücreler sayma dışında, <1% hücrelerin her zaman noktalarında mavi lekeli.
7. Aşağıdaki formüllere göre hücreyoğunluğunu (hücre/cm 2) hesaplayın.
   Hücrelerin/ızgaranın ortalama #u = (Eq.1)
   Seyreltme Faktörü= (Eq.2)
   Hücre yoğunluğu (canlı hücreler/cm²) =
   
   (Eq.3)
   Denklemler 1-3. Canlı hücreler her ızgarada sayılan hücre sayısıdır, ızgara sayısı mikroskop altında bulunan ızgara sayısına karşılık gelir, hücre süspansiyonu karışımının hacmi ve %0,4 Trypan mavisi 3.5 adımda hazırlanan hacimdir, çıkarılan hücre süspansiyonunun hacmi adım 3.5 5 000 μL hücre süspansiyon kaldırıldı hacmi, her kuyuda hücre süspansiyon hacmi adım 3.3 gelen 500 μL hücre süspansiyon, doku kültür plaka büyüme alanı 24-iyi plaka tek kuyunun büyüme alanıdır.

4. Lucifer sarı görünür geçirgenlik (LY P _uygulaması) teşp

1. Tohumlama sonrası her gün LY P_{uygulamasını} belirlemek için 4.3'ten başlayan adımları izleyin. Transfected hCMEC/D3 hücrelerinde P uygulamasının belirlenmesi için, transfeksiyon formülasyonunun 8.3 μL'sini (Şekil1)ekleyin ve 4 h. Transfeksiyon formülasyonları için 50 μL tam büyüme ortamı ile karıştırıldı.
2. 4 saat transfeksiyondan sonra, herhangi bir transfeksiyon karışımını çıkarmak için steril 1x PBS tamponu kullanarak apikal tarafı iki kez hafifçe yıkayın. Çıkarıldıktan sonra geride kalan çeşitli hacimlerde PBS tamponu apikal taraftaki LY konsantrasyonuna neden olabilir. Doku kültürü uçlarında artık PBS tampon tamamen kaldırılır emin olmak için dikkat edin. Hücre ayrışmasını en aza indirmek için artık reaktifleri ve orta yı dikkatlice aspire edin.
   NOT: HCMEC/D3 hücrelerinin her gün görünürgeçirgenliği (P uygulaması) ölçülürken bu adım atlanır.
3. Büyüme ortamını çıkarın ve 1,5 mL önceden ısıtılmış (37 °C) taşıma tamponunu (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 1 mM NaH₂PO₄, 5 mM glikoz, pH 7,4) basolateral tarafına ekleyin.
   NOT: Geçirgenlik katsayısı hesaplamasının doğruluğunu sağlamak için tüm bazoyan bölmelerde taşıma tamponhacmi eşit olmalıdır.
4. Her transwell kesici ucunun apikal tarafına 58,3 μL 20 μM LY çözelti ekleyin. Floresan ölçümleri için 20 μM LY çözeltisinin 50 μL'sini kaydedin. Artık PBS tamponu apikal taraftan tamamen çıkardıktan sonra, hCMEC/D3 hücrelerinin kurumasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk LY çözeltisi ekleyin. Apical tarafında LY çözeltisinin doğru hacimlerini sağlayın.
   NOT: LY floresan yoğunluğunun çürümesini en aza indirmek için ışığa maruz kalma sınırlandırılmalıdır. LY tozu yeniden oluşturulduktan sonra çözelti 4 °C'de saklanmalıdır ve ışıktan korunmalıdır.
5. 60 dk için bir döner plaka shaker (37 °C, 100 rpm) incubate. Daha sonra, her apikal bölmeden LY örneğinin 30 μL'sini çıkarın. Daha sonra 20 μM LY çözeltisini ve apikal yan numuneleri önceden etiketlenmiş tüplere aktarın ve taşıma tamponu kullanarak numuneyi 10 kat seyreltin.
   NOT: Bu numunelerin yüksek floresan yoğunluğu potansiyel olarak aşırı yüklenebileceği ve floresan mikroplaka okuyucunun floresan dedektörüne zarar verebileceğinden, 20 μM LY stok çözeltisinin ve apikal yan numunelerin seyreltilmesi gerekmektedir.
6. Her bazolateral bölmeden 500 μL çıkarın ve numuneyi önceden etiketlenmiş tüplere aktarın.
   NOT: Örnekler belirtilen zaman noktalarında ayrı transwell'den çıkarılır. Zaman noktaları her gün tohumlama sonrası 1 gün 10 güne kadar başlayarak vardır.
7. Standart eğri için bir dizi LY standardı hazırlayın (39.00 nM, 78.13 nM, 156.25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
8. Her bir standart (yinelenen), apikal ve bazolateral örnek her kuyuya siyah 96-kuyu plaka (Şekil1)100 μL ekleyin.
   NOT: Siyah plakalar ışığı emer ve kuyular arasında arka plan ve floresan geçişini azaltır.
9. P_{uygulamasını}hesaplamak için LY floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan mikroplaka okuyucu (ayar noktaları: uyarma 428 nm, emisyon 536 nm) kullanın. Bu çalışma için floresan levha okuyucu kullanılır.
10. Makale metninde açıklandığı gibi P_{uygulamasını} ve %LY kurtarma değerlerini hesaplayın.
    Denklem 4. P_uygulama değerlerini hesaplamak için formüller.
    Aşağıdaki denklemleri kullanarak görünürgeçirgenlik (P uygulaması) katsayısını ve %LY kurtarmasını hesaplayın. P_uygulama değerlerinin kütle 25'e veya LY konsantrasyonuna göre hesaplanabileceği unutulmamalıdır.
     Veya
    V_A - apikal bölmedeki hacim
    V_B - bazolateral bölmede hacim
    A - transwell ekleme membranının yüzey alanı (0,3 cm²)
    M_A0 - apikal bölmedeki ilk kütle
    ΔM_B/Δt - bazolateral bölmede zaman içinde kütle değişimi
    CA0 - apikal bölmedeki başlangıç konsantrasyonu
    ΔC_B/Δt - bazolateral bölmede zaman içinde konsantrasyon daki değişim.
    Denklem 5. % LY kurtarma hesaplamak için formüller.
    Kurtarma (%) = 
    M_Af son zaman noktasında apikal bölmede kütle, M_Bf son zaman noktasında basolateral bölmesi kitle, M_A0 apikal bölmede ilk kütle . ²⁶ Not: İlk kütle, adım 4.5'teki 20 μM LY çözeltisinin hacmine göre hesaplanır. Bu deney her zaman 35 numaralı geçit altındaki hücreler kullanılarak yapıldı ve dört kez bağımsız olarak yapıldı.

5. Kalsiyum tükenmesi

1. Transwell kesici uçlardan ve 12 kuyulu plakadan büyüme ortamını çıkarın ve transwell uçlarından kalsiyum iyonlarını çıkarmak için önceden ısıtılmış kalsiyumsuz ortam (Minimum Essential Medium Medium Eagle Spinner (S-MEM) ortamı nı kullanarak apikal kenarı ve 12 kuyulu plakayı nazikçe yıkayın ve 12-iyi plaka.
2. Kesici uçlara 500°L veya 2 mL önceden ısıtılmış S-MEM 1xmedium ekleyin ve kuvözde 24 saat kuluçka (37 °C,%5 CO 2) için kuluçka ya da kuluçka makinesi ekleyin. Kuluçkadan sonra, S-MEM 1x ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış 1x PBS tamponunu kullanarak hücreleri yıkayın.
3. LY tedavisi için 4.4-4.10 numaralı bölümleri ve sonraki adımları takip edin. Batı lekeleme ve sonraki adımlar için bölüm 8 açıklanan adımları izleyin.

6. Transfeksiyon

1. DNA nano taneciklerinin (DNA NPs) hazırlanması.
   1. 10 mM sodyum asetat (NaAc) tampon (pH 5.0) gWIZ-Luc plazmid stok çözeltisi seyreltmek ve DNA çözeltisi oda sıcaklığında 10 dakika (RT) durmak için izin.
      NOT: Ağırlıklı olarak tek DNA molekülleri içeren DNA NP' si 20-40 μg/mL^23. Bu nedenle, gWIZ-Luc plazmid stok çözeltisi seyreltilmelidir. Dondurulmuş gWIZ-Luc plazmid stoksıcaklık stresini en aza indirmek için buz tamamen çözülmüş olması gerekir. Hafifçe 3-5 pozisyonda ayarlanmış standart bir tezgah üstü girdap üzerinde 30 s için seyreltilmiş DNA stok çözeltisi girdap.
   2. NP kompozisyonu yansıtmak için burada sayısal parametre olarak kullanılan istenilen N/P oranlarını hesaplayın.
      
      Denklem 6. N/P oranı hesaplaması: Katyonik polimerlerin amin gruplarının benlerinin DNA fosfat gruplarına oranı. Katyonik polimerlerin kütlesi toplam tartılmış katyonik polimer miktarı anlamına gelir; (Kütle/Şarj) _{katyonik polimerler} katyonik polimer (poli (etilenglikol)5k-blok-poliasesemi ile 48 kanton-poliaspartamide (PEG-DET)) yüklü primer amin (48) sayısına normale anlamına gelir ( mol/mol), polimerimiz için bu değer 306 Da;; DNA'nın kütlesi, mg/mL'deki hacim ve konsantrasyonun çarpılmasıyla elde edilen formülasyonda kullanılan toplam DNA miktarı anlamına gelir; (Kütle/Şarj) _DNA, çift iplikli DNA başına fosfat grubu sayısına normalleştirilmiş DNA'nın molekül ağırlığını ifade eder (nükleobaz başına 325 Da).
      NOT: DNA NP hazırlamatablosu (Tablo 1) deneylerimizde test edilen farklı numunelerin formülasyon tarifini içermektedir. DNA NP hızlı titrasyon tekniği kullanılarak hazırlanmıştır. PEG-DET polimer çözeltisi tüpü yatay bir pozisyonda tutarken tüpün duvarları boyunca eklenmiştir. Daha sonra tüp dikey konuma geçti, ardından 10'lu maksimum hızda hızla girdap lar geldi. DNA NP'nin kullanımdan önce RT'de 30 dakika dayanmasına izin verildi. DNA NP dosing için başparmak kuralı 0.5 μg DNA'dır. Bu nedenle, 96 kuyulu bir plakadaki 48 kuyulu plaka/her kuyudaki her transwell kesici uç için, 0.157/0.5/0.195 μg-Luc DNA içeren N/P 10'da DNA NP'si hazırlayın.
   3. Poloxamer P84 (P84) konsantrasyonu içeren örnekler için, 5 s için DNA NP ve girdap P84 ekleyin. Her numunede P84'ün son konsantrasyonu %0.01 veya %0.03 wt'dir.
2. 48 kuyulu plaka kurulumunda DNA NP transfeksiyonu
   1. 48 kuyu plakasında 50.000 hücre/cm² yoğunluğuna sahip hücreleri tohumlayın ve kuvözde biraraya gelene kadar büyüyün (37 °C, %5 CO_2).
   2. Her tedavi grubu için, belirtilen numunenin 25°L'sini (transfeksiyon formülasyonu) ve 150 μL'lik tam büyüme ortamını ve bu karışımın 175°L'sini her kuyuya karıştırın.
   3. HCMEC/D3 hücrelerini mikroskop altında gözlemleyin ve hücrelerin sağlıklı görünmesini sağlayın ve deney sırasında %100 konca dır.
   4. Büyüme ortamını kuyulardan ve 175°L transfeksiyon karışımından her kuyuya çıkarın. Daha sonra, kuvözde 4 saat (37 °C, %5CO 2) plakayı kuluçkaya yatırın.
   5. 4 saat sonra transfeksiyon karışımını çıkarın ve hCMEC/D3 hücrelerini önceden ısıtılmış steril 1x PBS tamponuyla yıkayın.
      NOT: Yıkama adımları sırasında hCMEC/D3 hücrelerinin plaka/insert yüzeyinden kazara ayrılmasını en aza indirmek için, kuyuduvarları boyunca yeterince steril PBS pipetleme ve artık kültür medyasındaki nano partikülleri çıkarın.
   6. Plakayı birkaç kez hafifçe sallayın ve pbs yıkamayı dikkatlice aspire edin ve 500 μL hCMEC/D3 önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
   7. Hücreleri mikroskopik olarak inceleyin ve hücre morfolojisi ve transfeksiyonun olası etkileri üzerine gözlemleri kaydedin.
   8. 37 °C hücre kültüründe 24 saat boyunca inkübatör lüle üretimine izin vermek için. 24 saat sonra, büyüme ortamını tamamen çıkarın ve önceden ısıtılmış 1x PBS ile hücreleri bir kez yıkayın.
   9. 100 μL buz gibi luciferase hücre kültürü lysis 1x reaktif ilerleyerek transfected hücreleri lyse iyi başına.
   10. Luciferase protein içeriğinin ölçümü için, 20 μL hücre lisat ve 100 μL luciferase istin arabelleği (20 mM glislikin (pH 8), 1 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 3,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,27 mM koenzim A) 1,5 mL tüp içine ekleyin.
   11. Tek bir Otomatik enjektörlü bir Luminometre'de 6.2.10 adımda açıklanan numunenin Parlaklığını okuyun.
       NOT: Parlaklık okumadan önce 10 s üzerinde entegre edilmelidir.
   12. Üreticinin protokolünü izleyerek bilarchoninik asit test (BCA test) kiti kullanarak lysatdaki toplam hücresel protein miktarını ölçün.
   13. Toplam hücresel protein başına Göreli Işık Birimleri (RLU) olarak luciferase gen ekspresyonunu hesaplayın ve ifade edin.

7. Parlak ATP tsası

1. 96 kuyu plakasında 50.000 hücre/cm² yoğunluğuna sahip hücreleri tohumlayın ve kuvözde biraraya gelene kadar büyüyün (37 °C, %5 CO_2).
2. Transfeksiyon formülasyonunun 9.7 μL'lik hücreleri transfect (hazırlık detayları bölüm 6'dadır) ve 58.4 μL tam büyüme ortamı4 saat.
3. Transfeksiyon karışımını çıkarın ve tedavi reaktiflerini tamamen çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış PBS 1x tamponuyla iki kez hafifçe yıkayın.
   NOT: Farklı hacimlerde kalan arabellek ATP tsay reaktiflerini farklı ölçüde seyreltebilir ve verileri etkileyebilir.
4. Çok kanallı pipet kullanarak 1:1 seyreltmede 75 μL taze önceden ısıtılmış orta ve ATP istresiyonaracını karıştırın. Tüm çok kanallı pipet uçlarında sıvı seviyesinin aynı olduğundan emin olun.
5. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir besleyici shaker üzerine plaka yerleştirin. Reaktifleri 15 dk ekledikten sonra, her numunenin 60 μL'sini beyaz 96 kuyulu bir tabağa aktarın.
   NOT: Beyaz plakalar net veya siyah plakalar daha çıkış ışığı yansıtmak için daha iyidir.
6. Plaka okumadan önce bir iğne kullanarak herhangi bir hava kabarcıkları pop. 1 s entegrasyon süresi ile bir luminometre üzerinde plaka okuyun. ATP tsay reaktifleri ekledikten sonra 20 dakika içinde plakaokuyun. Parlaklık sinyali hızlı çürüme hızıile geçici olduğundan, zamanlama farklı plakalar arasında karşılaştırma için önemlidir.
7. Yüzdeyi hesaplama (%) bu formülü kullanarak hücre canlılığı: (transfected hücrelerin lüminesans / kontrol lüminesans, işlenmemiş hücreler) x 100.

8. Sıkı kavşak proteini ZO-1 ölçümü için batı lekeleme

1. Hücre lisisi ve protein ekstraksiyonu
   NOT: Hücrelerden protein çıkarma için gerekli tüm adımlar 2-8 °C'de yapılmalıdır.
   1. Kollajen kaplı 12 kuyulu doku kültür plakasında hücreleri 50.000 hücre/cm² yoğunlukta tohumlayın.
   2. Gün 3, gün 5, gün 7, gün 10 post-tohumlama ve gün 7 (hücreler önceden kalsiyum içermeyen orta ile kuluçka), büyüme ortamı kaldırmak ve yavaşça buz gibi 2 mL ile hücreleri iki kez yıkayın 1x PBS. Daha sonra, her kuyuda 3 μg/mL aprotinin içeren buz gibi 1x RIPA lysis tamponunun 300 μL karışımını ekleyin.
      NOT: Karışım taze olarak yapılmalı ve buzüzerinde tutulmalıdır. Aprotinin ilgi proteini aşağılayıcı lysates mevcut proteazlar inhibe etmek için kullanılır.
   3. İki donma-çözülme döngüsünden (-80 °C) sonra, hücreleri soğuk plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın. Mikrofuge tüplerde hücre lysates toplamak. Daha sonra tüpleri 200 x g'de 30 dk 4 °C'de santrifüj edin.
   4. Temiz tüpler içine supernatant toplamak ve buz üzerine yerleştirin. BcA test kitini kullanarak lysates'teki toplam hücresel protein miktarını üreticinin protokolünü izleyerek ölçün.
2. Sıkı bağlantı proteini ZO-1'in saptanabilirliği için batıda blotlama
   1. 95 °C'de 1x Laemmli tampon ile toplam protein 40 μg içeren toplam homojenatların denatüre aliquots, 5 dk ve bir azaltıcı elektroforezi tabi 6-7.5% sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel (SDS-PAGE) (90 V, istifleme jeli ile 10 dakika, 120 V jelleri çözme).
      NOT: Numuneleri veya standartları yüklerken, her şeride yavaş ve dikkatli bir şekilde yüklemeyi unutmayın, bu süreçte kuyuyu kırmamaya dikkat edin.
   2. Ayrılmış proteinleri 192 mM Glisin, 25 mM Tris Base, %10 metanol ve %0,1 SDS (75 V, oda sıcaklığında 110 dk) içeren pH 8.5 transfer tamponlu bir nitroselüloz membrana aktarın.
      NOT: Membrana dokunmayın. Membranı işlemek için %70 izopropanol yıkanmış plastik çömlek ler kullanın. ZO-1 proteininin (MW 200 kDa) membrana başarılı bir şekilde aktarılabilmesi için pH 8.3-8.5 civarında olmalıdır. Transfer tamponu bundan daha asidik sayılsaydı, aktarım gerçekleşmez. Merdiven bantları jel üzerinde hala görünür ise, transfer süresini ve SDS konsantrasyonu artırmak için yararlı olacaktır.
   3. %0,1 Arat20 (T-TBS) içeren Tris-tamponlu salin kullanarak membranı yıkadıktan sonra, membranları 60 dakika boyunca engellemek için bloklama çözeltisi (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris tamponlu salin) kullanın.
   4. Membranı dikkatlice iki şerit halinde kesin. İki ana antikor (ZO-1 monoklonal antikor, seyreltme, 1: 900 ve gliserindehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) antikor, seyreltme, 1: 10.000) 4 °C gecede kuluçka. Sonra, eşek anti-fare IgG (seyreltme, 1:50.000) ile ZO-1 ve GAPDH membranlar kuluçka. Membranları T-TBS kullanarak yıkadıktan sonra, 700 kanaldaki membranları 16 bit görüntüleyicide görüntüleyin.

İlk olarak, TJ oluşumunun görünür kinetiklerini belirlemek için zaman diliminin LY geçirgenliği üzerindeki etkisini belirledik. 1. günden 10'a kadar olan ortalama LY P_uygulama değerleri Şekil 2a'dagösterilmiştir. 1. günde, ortalama P_uygulaması 4.25 x 10^-4 cm/dk idi ve 2. Ortalama P_uygulama değeri 3. P_uygulama değerleri, 7. P_uygulama değerleri 7 günden 10 güne kadar 2,14 x 10^{-4 ve} 2,36 x 10^-4 cm/dk aralığında stabilize edilmiştir ve bu da bariyer oluşumunun tam ve işlevsel olduğunu ve LY parasellülerin taşınmasının azalmasına neden olduğunu ima etti. Yüzdeyi hesapladık (%) LY her gün yaklaşık % 80 olarak kurtarıldı, p_uygulaması değerini güvenilir bir şekilde hesaplamak için en uygun olarak kabul edilen bir değer²⁷ (Figure 2b). Kurtarma% LY satodur önemli bir indekstir. Örneğin, hücreler en çok LY metabolize, LY hücrelerde hareketsiz veya hücre zarına yapışır veya LY inkübasyon sırasında bozulursa, bazolateral bölmede gözlenen düşük LY sinyalinin sıkı bir bariyer ilerlediği yorumu yanlış olur. Böylece, kurtarma% biz yukarıda bir veya daha fazla olasılık nedeniyle LY önemli miktarda kaybetmedi ve güvenle LY P_uygulama değerleri tahmin sağlar daha fazla güven verir. Giriş bölümünde daha önce de belirtildiği gibi, bazolateral tarafta ki LY konsantrasyonlarının daha fazla konsantrasyonu eksik bir bariyeri gösterirken, düşük konsantrasyonlar kısıtlı taşımayı yansıtır ve fonksiyonel varlığından dolayı olgun, tam bir bariyer olduğunu düşündürmektedir. Tjs. Ayrıca, LY P_{uygulamasında} gözlenen değişikliklerin sıkı kavşakların oluşumuile ilişkili olduğunu doğrulamak için, ZO-1 proteininin Batı lekelenme saptama (Şekil4)ortogonal tekniği kullanılarak ek kanıtlar salıyoruz.

Transwell insert kurulumu hücre yoğunluğundaki değişiklikleri doğrudan izlemesine izin vermediğinden, standart bir Trypan mavisi dışlama testini kullanarak hücre yoğunluğundaki değişiklikleri belirledik. Bu nedenle, hücre büyümesi kinetiğini izlememizi sağlayan saydam bir doku kültürü plakasında hücre yoğunluğundaki değişiklikleri belirledik. Hücre yoğunluğundaki artış 5.5 ± 1.0 x 10⁴ hücre/cm 2'den 1.9 ± 0.2 x 10⁵ hücre/cm^2'den 10-post tohumlama (Şekil3)regresyon katsayısı 0.94 ile doğrusal dı. Bu veriler aynı zamanda LY P_{uygulamasında} (Şekil2a)gözlenen değişikliklerin 10 günlük süre içinde bir konfluent monolayer oluşumunun bir sonucu olduğunu göstermektedir. Hücreleri her gün ters ışık mikroskobu altında gözlemledik ve hücre sayısında ve monolayer oluşumunda kademeli bir artış olduğunu görsel olarak belgeledik.

Zaman içinde sıkı kavşak proteini ZO-1'in ekspresyonundaki değişiklikleri tespit etmek için Batı lekeleme kullandık (Şekil 4). ZO-1 ifadesindeki değişiklikler, LY P_uygulama verilerinin ortogonal olarak tamamlanır ve LY P_{uygulamasında} gözlenen değişikliklerin sıkı bir bariyer oluşumunu gösterir olmasını sağlamak için kullanılır. ZO-1 bant yoğunlukları densitometri ile analiz edildi ve bir temizlik geni olan GAPDH'nin ekspresyonuna göre normalleştirildi. Şekil 3a'daki iki bant iki ZO-1 isoform'u (ZO-1α⁺ ve ZO-1α^-)^28'itemsil eder. Densitometri analizi ZO-1 piksel değerinin 3-7 sonrası tohumlama dan arttığını ortaya koymuştur, TJ protein ZO-1 gün 3-7 sürekli oluşan düşündürmektedir. 7. gün sonrası kalsiyum tükenmesi tedavisinden sonra ZO-1 bandı neredeyse tespit edilememiyordu, bu da ZO-1'in kalsiyum iyonlarının yokluğunda oluşamadığını gösteriyor. Ayrıca, ZO-1 piksel değeri belirgin gün 10 post-tohumlama azaldı. GAPDH'nin 3-10. Kalsiyum ile tedavi edilen hücrelerde düşük GAPDH ekspresyonunun olası bir nedeni, yine daha az toplam protein (28.9 g toplam protein) nedeniyle olabilir, yine de kalsiyum tükenmesi nedeniyle. Genel olarak, bant densitometri analizi zo-1 ekspresyonunda kademeli bir artış (GAPDH'ye göre) 7. Analiz de zo-1 daha düşük bir ifade ortaya (GAPDH göreli) kalsiyum içermeyen orta ile tedavi hücrelerde gün 7.

Bu çalışmanın odak noktası LY P_uygulama testinin tek katmanlı bir oluşumun kinetiklerini belirlemek, geliştirilen tsayın ek bir faydasını göstermek için bir yöntem olarak sunulması iken, DNA NP transfeksiyonunun TJ bariyerini etkileyip etkilemediğini belirledik. lyCMEC/D3 hücreleri 4 saat transfeksiyon sonrası LY P_uygulaması ile ölçülerek bütünlük (Şekil 5). Poloxamer P84 içeren DNA NP'lerimiz, transfect hCMEC/D3 hücre hattında yüksek düzeyde gen ekspresyonuna aracılık eder (Şekil6a). Özellikle, DNA NPs'lerimizdeki Poloxamer P84'ün hidrofobik etki alanlarının transfected hücrelerde TJ bütünlüğünü etkip geçiremeyecek lerini belirlemek istedik. Her bir tedavi grubunda elde edilen %LY %92'lik bir oran olup, hesaplanan P_uygulama değerlerinin güvenilir olduğunu düşündürmektedir (Şekil5b). Çeşitli formülasyonlar kullanılarak yapılan transfeksiyon işleminin LY P_{uygulamasını}etkilemediğini, tek başına LY'ye maruz kalan transfected olmayan hücrelere göre olduğunu kaydettik. Ekstrasellüler kalsiyum çeşitli hücre tipleri hücre-hücre kavşaklarının bakımı için kritik bir bileşenidir^29,30,31, beyin mikrodamar endotel hücreleri de dahil olmak üzere. Böylece, kalsiyumsuz ortamda hücreleri korumak (CFM) TJs bozulmasına yol açar^32,33. Bu nedenle, cfm ile 24 saat boyunca tedavi edilen hücreleri pozitif kontrol olarak kullandık.

Verilerimiz, CFM ile inkübe edilen hücreler için LY P uygulamasının, normal büyüme ortamı ile kuluçkaya yatan kontrol hücrelerine kıyasla 2 kat daha yüksek olduğunu göstermektedir. P_{uygulamasındaki} bu %100'lük artış, hücrelerin oluşumu için gerekli kalsiyum iyonlarının kaybı nedeniyle TJ'lerini kaybettiğini göstermektedir. Özellikle, gerçek değer (5,14 x 10^-4 cm/dak) TJ'lerin henüz tam olarak oluşmadığı1-6 posta tohumu (Şekil 2) gününden ortalama P_uygulama değerinden biraz daha yüksekti. Önemli olmasa da, %0.01-0.03 Poloxamer P84 içeren DNA NP ile transfeced hücreler, normal kültür ortamında tutulan tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla LY P_uygulama değerlerinde küçük bir artış gösterdi. Bu gözlem, DNA NP + P84 transfeksiyonunTBariyer bütünlüğü üzerinde önemli bir etkisi olmadığını ileri sürmüştür. Genel olarak, transfected hücrelerdeki LY P_uygulama değerleri yaklaşık olarak 2,5x10^-4 cm/da ortalama olarak ve bu değer, LY P uygulamasının en az olduğu gün 7-10 tohumlama sonrası (Şekil2)belirtilen ortalama değere karşılık gelir, LY parasellüler naklini etkili bir şekilde kısıtlayan fonksiyonel TJ'lerin varlığını düşündürmektedir.

LY P_{uygulamasındaki} (Şekil 5) değişiklik eksikliğinin önemsizbir gözlem olmadığını göstermek için ek transfeksiyon verileri sıyoruz. DNA NPs+P84 grubunda gözlenen transfeksiyon un yüksek seviyelerine rağmen, LY P_{uygulamasında} formülasyonlarımızın TJ bariyerini rahatsız etmediğini düşündüren bir değişiklik olmadığını kaydettik. Plazmid DNA'sının aniyonik doğası (omurgasındaki fosfat grupları nedeniyle) ve hidrofilik yapısı hücresel alımı sınırladığı için, çıplak DNA ile tedavi edilen hücrelerdeki nispeten düşük transfeksiyon verimi tipiktir. DNA NP'de yoğuşturulan DNA, transfeksiyonda çıplak pDNA'ya göre 50 kat artışa aracılık etti (Şekil 6). DNA NP'ye %0.01 P84 eklenmesi, tek başına DNA NP'ye göre 18 kat artışla sonuçlandı (P< 0.01). P84 konsantrasyonu 0.03 wt.% için artırılması DNA NP-yalnız (P < 0.001) ile karşılaştırıldığında 30 kat artış ile sonuçlandı. Bu sonuçlar beyin endotel hücrelerinin transfect hücre tipi nin zor olduğu düşünülürse dikkat çekicidir.

Transfeksiyon prosedürünün hücre stresine yol açmadığını doğrulamak için farklı koşullar altında transfeced hücrelerin hücre canlılığını ölçtük. Adenozin trifosfat (ATP) yaşamın enerji para birimidir ve hücresel metabolik fonksiyonu yansıtır. Lüminesans değerlerinin ATP düzeyleriyle doğru orantılı olduğu luciferase tabanlı BIR ATP titreşme kullandık. Possimo ve ark. lüminesans ATP tsay metabolik hücre canlılığı sağlam bir ölçüsü olduğunu bildirdi³⁴. Çeşitli formülasyonlarla transfece hCMEC/D3 hücrelerinin hücre canlılığı, işlenmemiş hücrelerle karşılaştırılabilir (Şekil5b)ve ATP düzeylerinin de benzer olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle Poloxamer P84 içeren DNA NP'leri (%0.01 ila %0.03 w/w) güvenli gen iletim formülasyonlarıdır.

Şekil 1 . LY P için deneysel kurulum _uygulama çalışma. Transwell kesici uçlar içeren 24 kuyulu plaka kurulumu (DNA nanopartikül transfeksiyonuna örnek olarak göstermek için uyarlanmıştır, Şekil5'teki veriler). Her kolon 4 saat için belirtilen örnekle tedavi edildi. Kontrol, tam büyüme ortamı ile tedavi edilen hCMEC/D3 hücrelerini gösterirken, kalsiyum tükenmesi 24 saat hücrelerin LY maruziyetinden önce kalsiyumsuz ortamla kuluçkaya yatırıldığını gösterir. Sağ şablon, siyah 96 kuyulu bir plakada LY floresan yoğunluğu ölçümü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2 . LY P kullanılarak belirlenen TJ bariyer oluşumunun görünür kinetiği _uygulama titretin. (a) LY P transwell uçlarında kültürlenen hCMEC/D3 monolayers aracılığıyla _uygulama günlük post-tohumlama hücreleri ölçüldü. (b) Her tedavi grubunda %LY kurtarıldı. Veriler iki bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini (n=3/experiment) temsil eder. İstatistiksel karşılaştırmalar eşleşmemiş t-testi (*P< 0.05, N.S. anlamlı değil) kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Şekil 3 . Hücre büyümesinin kinetik bir Trypan mavi dışlama tsay kullanılarak belirlenir. hCMEC/D3 hücreleri 50.000 hücre/cm²hücre yoğunluğunda 24 kuyuluk bir plaka içinde tohumlandı. Deneyin her gününde hücreler ayrıştırıldı ve hemacytometredeki canlı hücreleri saymadan önce %0,4 trypan mavisi eşit hacimle karıştırıldı. Veriler, üç bağımsız ölçümün ortalama ± SD'sini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4 . ZO-1 ekspresyonunun belirgin kinetikleri batı lekeleme kullanılarak saptanmıştır. (a) hCMEC/D3 hücreleri 50.000 hücre/cm²hücre yoğunluğunda 12 kuyulu bir plaka içinde tohumlandı. Deneyin her gününde (3 gün, 5 gün, 7. gün ve 10-post tohumlama) hücreler 3 μg/mL aprotinin içeren 400 μL 1x RIPA tamponu ile lysed edildi. 40 g toplam protein içeren hücre lisatları %4-7.5 SDS-poliakrilamid jele yüklendi. (b) Bant densitometri analizi, ZO-1 proteininin GAPDH'ye normalleştirilmesine olanak sağladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Şekil 5 . DNA NP transfeksiyonunun LY P kullanılarak ölçülen TJ bariyer sıkışması üzerine etkileri _uygulama titretin. (a) hCMEC/D3 hücreleri transwell kesici uçlarda 7 gün boyunca kültürlendi, PEG-DET ile transfekslendi gWIZLuc plazmid DNA içeren gWIZLuc plazmid DNA ile/Pluronic P84 olmadan 4 saat ve daha sonra 1 saat için 50 μM LY içeren önceden ısıtılmış taşıma tamponu ile değiştirildi. hCMEC/D3 hücreleri 4 saat büyüme ortamı ile kuluçkaya yatırılarak LY maruziyeti (n=4, *P<0.05, N.S. önemli değildir). (b) Her tedavi grubunda %LY kurtarıldı, sunulan değerler ortalama ± SD (n = 4). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Şekil 6 . DNA NS hCMEC/D3 monolayers transgen ekspresyon yüksek düzeydearacılık. (a) hCMEC/D3 hücreleri 7 gün kültürlendi ve PLuronic P84 (N/P 10, DNA dozu: 0.5 g) ile gWIZLuc plazmid DNA içeren PEG-DET ile transfeced edildi 4 saat, transfeksiyon karışımı çıkarıldı ve hücreler tam büyüme 24 saat kültürlendi gen ekspresyonunu ölçmeden önce orta. Luciferase gen ekspresyonu düzeyleri bağıl ışık birimleri (RLU) olarak ifade edildi toplam hücresel protein içeriğine nornalized. Veriler üç bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini sunar. İstatistiksel karşılaştırmalar eşleşmemiş t-testi (** P< 0.01, *** P< 0.001) kullanılarak yapılmıştır. (b) DNA NP'leri hCMEC/D3 monolayers'da güvenli transfeksiyon formülasyonlarıdır. DNA DNA NP transfeksiyonunun hücre canlılığı üzerindeki etkileri Parlak ATP testi kullanılarak değerlendirildi. hCMEC/D3 hücreleri, ATP testinin üreticiprotokolüne göre yapıldığı 4 saat boyunca belirtilen numunelerle transfekslendi. Yüzde (%) hücre canlılığı aşağıdaki gibi hesaplanmıştır: (transfected hücrelerin lüminesansı/kontrolün lüminesansı, işlenmemiş hücreler)x100. Veriler iki bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini (n=3/experiment) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Bildirilen verileri elde etmek için kullanılan NP formülasyonları.

BBB'nin önemli bir rolü, sinirsel mikroortamın hemostazını korumak için sistemik dolaşım ve beyin arasında gerekli olmayan iyonların ve toksik maddelerin değişimini önlemektir. BBB'nin karakteristik özelliklerinden biri, kapiller endotel hücrelerinin parasellüler taşıma rotasını etkili bir şekilde kapatan sıkı kavşaklar (TJs) oluşturabilme yeteneğidir. Kültürlü hCMEC/D3 monolayers TJ bariyer oluşumunun görünür kinetik belirlemek için nicel bir yöntem olarak bir LY P_uygulaması tsay gösterdi. Batı lekeleme ortogonal yoluyla tespit edilen ZO-1 ifadesi, ly p_uygulama çalışmalarından elde edilen verileri aşağıdaki paragrafta ayrıntılı olarak ele alınarak doğrulamıştır. Geliştirilen çıktının ek bir faydası olarak, DNA NP transfeksiyonunun deneysel bir kurulumda TJ bariyer özelliklerindeki değişiklikleri belirlemek için bu tişin uygunluğunu gösteren LY P_{uygulamasını} ölçülebilir bir şekilde değiştirmediğini de gösterdik.

Batı leke verileri gün 3, 5, 7-post tohumlama ve gün 10-post tohumlama hafif bir azalma ZO-1 ifade net bir artış ortaya (Şekil 4a). Şekil1'den LY P uygulamasının 1-7 gün sonrası tj oluşumunu düşündüren tohumlama sonrası azaldığı görülmektedir. Kalsiyum tükenmesi tedavisinden sonra LY P_{uygulamasında} belirgin bir artış (Şekil2a)gösterirken, ZO-1 ekspresyonu belirgin azalma (Şekil4a)gösterdi. Ekstrasellüler kalsiyum çeşitli hücre tipleri hücre-hücre kavşaklarının bakımı için kritik bir bileşenidir^29,30,31, beyin mikrodamar endotel hücreleri de dahil olmak üzere. Büyüme ortamıkalsiyum eksikliği tjs³³bozuldu ve ayrıştırıldı. Beklendiği gibi, kalsiyum tükenmiş hücrelerin P_uygulama değeri önemli ölçüde tedavi edilmemiş hücrelerden daha yüksek ve hiçbir hücre içeren boş eklerin P_uygulama değerine yakın (Şekil2a). LY, 7-10'dan itibaren P_uygulama değerlerinde sabit bir plato ortaya çıkardı (Şekil2a),bariyerin 7. Batı leke verileri, 10. Gözlemdeki bu fark, bariyer sıkılığının korunmasında ZO-1 dışında diğer hücre dışı proteinlerin katkısından kaynaklanmaktadır. Özetle, BBB'nin insan hücre modelinde sıkı kavşak bariyer oluşumunun kinetiklerini belirlemek için iki ortogonal teknikten elde edilen verileri başarıyla kullandık. LY P_uygulaması tsay TJ bariyerinin işlevselliğini ölçtü, Batı leke verileri zo-1'i marker protein olarak kullanarak TJ'lerin oluşumunu takip etti.

Geliştirilen tsay ek bir yarar olarak, biz hCMEC / D3 monolayers DNA NP transfeksiyon TJsbütünlüğünü etkilemez doğruladı (Şekil 5). Büyüme aracı ile kuluçkaya yatan tedavi edilmeyen hücreler negatif kontrol olarak kullanılmış, 24 saat kalsiyumsuz ortam ile ön kuluçkaya yatan hücreler pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Kalsiyum tükenmesi sonucu TJ'lerin bozulduğunu gösteren hücreler, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla LY P_{uygulamasında} %210'luk bir artış gösterdi. Verilerimiz, P84'ün varlığında veya yokluğunda DNA NP transfeksiyonunun TJ bütünlüğünü etkilemediğini göstermektedir. Transfected hücrelerde LY P_uygulaması değişikliklerinin eksikliğinin önemsiz bir gözlem olmadığı unutulmamalıdır. Aslında, BIZIM DNA NPs zor transfect hCMEC/ D3 monolayers 9,^35,36,37gen ekspresyonunun önemli düzeyde aracılık . 0.01 veya 0.03 wt. % P84 içeren DNA NP'leri, sadece DNA NP'lerine göre sırasıyla 18 ve 30 kat artmıştır (Şekil6a). Ayrıca NP tedavilerimizin burada fonksiyonel hücre canlılığının bir göstergesi olarak kullanılan hücresel ATP düzeylerini olumsuz etkilemediğini de gösterdik (Şekil 6b). Sonuçlarımız, deneysel bir transfeksiyon kurulumunda TJ bariyer bütünlüğünü belirlemek için bu LY P uygulamasının genişletilmiş yararının altını çizer.

LY suresinin yürütülmesinde kritik bir adım, tüm deneydeki çeşitli zaman noktaları boyunca aynı miktarda LY'yi apikal tarafta ve eşit hacimli taşıma tamponu olarak tutmaktır. Kuyularda farklı miktarda LY veya eşit olmayan taşıma arabelleği kullanılırsa, P_{uygulamasının} hesaplanması güvenilmez olur ve bu da yapay olarak büyük standart sapmalara yol açacaktır. Bir diğer kritik yönü de LY floresan yoğunluğunun çürümesini en aza indirmek için ışığa maruz kalma nın sınırlandırılmasıdır. Ayrıca, ly çözeltisi ve taşıma tampon apikal yan ve bazolateral yan içine tam olarak aynı hacim eklemeden önce sıvı tamamen kaldırılması gerekir, sırasıyla. Bu, floresan okumanın P_uygulaması hesaplaması için güvenilir bir şekilde kullanılabilmesini sağlar. Bu deneydeki bir diğer kritik adım da, bazolateral numunelerin LY floresansını hemen ölçmek ve toplama sonrasında numunelerin dondurulması ihtiyacını önlemektir. LY içeren numunelerin donma-çözülme döngülerine tabi tutulması, floresan sinyalinin grup içi daha büyük bir varyasyonu ile sonuçlanır. Transwell kurulum kullanarak bir sınırlama canlı hücrelerin konvansiyonel mikroskopi ile görselleştirilmesi veya konfokal mikroskopi ile görüntülenebilir zor olmasıdır. Ayrıca, söz, glial ve endotel hücrelerinin karışık kültürbir arada farklı hücre türleri karma sağlayan bir kurulum içine çevirmek kolay değildir bir olasılıktır. Bununla birlikte, LY analizinin şu avantajları vardır: LY, farklı uyarma/emisyon zirvelerine ve sodyum floresan gibi boyalara göre nispeten büyük bir Stokes kaymasına sahip bir boyadır, bu da BBB'yi geçen sondanın sağlam bir ölçüme olanak sağlar ve sakaroz veya mannitol gibi izleyiciler durumunda olduğu gibi ek radyolabel ihtiyacı. LY'nin yüksek kurtarma %s's's's's'i, P_uygulama değerlerini güvenle hesaplamak için güvenilir veriler sağlar.

Bulgularımıza dayanarak, LY P_uygulama yönteminin hCMEC/D3 hücreli monolayers arasında parasellüler geçirgenliği ölçmek için basit ve sağlam bir test olduğu sonucuna vardık. LY P_uygulama yöntemini kullanarak, bozulmamış bariyerin oluşumu için kültür süresini optimize ettik ve DNA NP transfected hücre monokatmanlarında TJ bütünlüğünü belirleyerek gelişmiş bir çıktının ek bir faydasını gösterdik.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yazarlar, Amerikan Eczacılık Derneği'nin 2017 Yeni Araştırmacı Ödülü, Duquesne Üniversitesi'nden Hunkele Dreaded Disease ödülü ve Manickam laboratuvarı için Eczacılık Fakültesi'nin başlangıç fonlarından gelen mali destek için müteşekkirler. Biz sızıntı laboratuvarı (Duquesne Üniversitesi) batı bloting yardım ve onların Odyssey 16-bit görüntüleyici kullanımına izin için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Batı blotting ile ilgili yardım için Kandarp Dave (Manickam laboratuvarı) için takdir özel bir not eklemek istiyorum.