Tek hücreli Seviyesinde Kavitasyon Kabarcık (ler) -Hücre Etkileşim ve Sonuç biyoetkiler incelenmesi için yüzey Desenlendirme ile mikroakışkan Sistemi

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Bu yazıda, öncelikle kesin tandem kabarcıklar ve iyi tanımlanmış yerlerde ve şekillerle yakın desenli tek tek hücrelerin üretilmesini kontrol eden aynı cam alt tabaka, altın nokta ve fibronektin kaplı bölgeler ile, bir mikroakışkan çip üretim protokol açıklar. Daha sonra bir kaç-mikrosaniye zaman gecikmesi ile altın nokta bir çift aydınlatıcı iki darbeli lazer kullanarak tandem baloncuklar nesil göstermektedir. Biz yüksek hızda görüntüleme ile kabarcık kabarcık etkileşimi ve jet oluşumunu görselleştirmek ve parçacık görüntüleyerek hız ölçümü (PIV) kullanılarak bileşke akım alanını karakterize eder. Son olarak, biz makromolekül alımı ile hücre zarı poration, ekli integrin bağlayıcı boncuk değiştirmeler tarafından belirlenen lokalize membran deformasyon ve oranlı metrik görüntüleme gelen hücre içi kalsiyum yanıtı da dahil olmak üzere tek bir hücre analizi için bu tekniğin bazı uygulamaları sunuyoruz. Bizim sonuçları hızlı ve yön jeti akışı yanlısı olduğunu göstermekyakın yetişen bir hücrenin yüzeyi üzerinde yüksek ölçüde lokalize edilen kesme stresi getirebileceği ikili kabarcık etkileşimi tarafından üretilen. Ayrıca, farklı biyolojik etkileri ikili kabarcık hücreye dikme mesafe ayarlanarak püskürtme akışının gücü değiştirerek indüklenebilir.

Hücresel heterojenite, genler, proteinler ve metabolitleri stokastik ifadesi kaynaklanan büyük bir hücre popülasyonu içinde var ve hücre adaptasyonu ve evrim ¹ olanak sağlamak için biyolojinin temel prensip olarak hizmet dair büyüyen bir fark vardır. Nedenle, sık sık bireysel hücrelerin ve bunların etkileşimleri işlevini anlamak için toplum tabanlı toplu ölçümleri kullanmak yanlış ve güvenilmez. Tek hücre analizi için yeni teknolojilerin geliştirilmesi, bu nedenle, biyolojik ve farmakolojik araştırma yüksek ilgi ve daha iyi kök hücre biyolojisi ve kanser tedavisinde ^2-4 anahtar sinyal geçiş yollarından ve süreçleri, örneğin, de kullanılabilir. Son yıllarda, mikroakışkan platformların çıkması büyük ölçüde bireysel hücrelerin tepki konumlandırma, tedavi, gözlem yeni analitik stratejiler ⁵ ile yapılmıştır tek hücreli analizi kolaylaştırmıştır.

Kavitasyon yüksek yoğunluğu kanserlerinin tedavisinde de dahil olmak üzere biyomedikal uygulamalarda, çeşitli bir yelpazede önemli bir rol ultrason (HIFU) ⁶ odaklı çalış, şok dalga litotripsi ile böbrek taşlarının non-invaziv parçalanma (SWL) ^7, ilaç ya da gen teslimi sonoporation ⁸ ve hidrodinamik kavitasyon balon ^9,10 hücreler ya da dokuların en son rapor tahrip edilmesi. Buna rağmen, kavitasyon kabarcığı (ler) biyolojik doku ve hücreleri ile etkileşim dinamik süreçleri iyi anlaşılmış değil. Bu ultrason, şok dalgaları ve yerel hidrolik basınç tarafından üretilen kavitasyon başlatma ve kabarcık dinamikleri rastgelelik nedeniyle; ayrıca, özellikle tek hücre düzeyinde, biyolojik hücrelerin doğal olarak karmaşık ve hızlı yanıtları çözümlemek için teknikler sağlayan bir eksikliği vardır.

Bu zorlukların, şaşırtıcı değildir, çünkü çok az çalışma arı varn iyi kontrol deneysel koşullar altında kabarcık-hücre etkileşimleri araştırmak için bildirmişlerdir. Örneğin, tek tek hücrelerin membran gözeneklendirme süspansiyonu ¹¹ sıkışıp ve insan kırmızı kan hücreleri ¹² itici büyük deformasyon mikroakışkan kanal lazer tarafından oluşturulan tek kabarcıkları kullanılarak gösterilmiştir. İkinci teknik, bununla birlikte, çünkü sadece çekirdeğin ¹³ varlığı ökaryotik hücrelerde çok az deformasyon üretebilir. Ayrıca, süspansiyon içinde hücrelerin tedavi ederken aşağı biyoetkiler izlenmesi zordur. Diğer çalışmalarda, tek yapışık hücre membran gözeneklendirme ve / veya hücre içi kalsiyum yanıtları üretmek için bir hücreye bağlı mikro-kabarcık (ya da ultrason kontrast ajanı) ultrasonla uyarım ⁸ bildirilmiştir. Tek yapışan hücrelerin membran gözeneklendirme Ayrıca ışık emici Tripan mavi bir çözelti ¹⁴ ihtiva eden ince bir sıvı tabakası lazer tarafından oluşturulan ardışık kabarcıkları kullanılarak üretilen, ya damicrochambers ¹⁵ optik emici alt tabaka ile ışınlanması mikrosaniye lazer darbeleri tarafından üretilen bir salınım gaz kabarcığı ile. karşılaştırıldığında ikinci hücreler için toksik olduğu için, optik olarak emici alt-tabaka, lazer soğurucu Trypan mavi çözelti bir avantajı vardır. Daha da önemlisi, lazer tarafından oluşturulan kabarcıklar akustik heyecanlı kabarcıkların daha kabarcık boyutu ve konumu açısından daha kontrol edilebilir. Bununla birlikte, bütün bu daha önceki çalışmalarda, hücre şekli, yönlendirme ve yapışma şartları esas itibarıyla hücre yanıtı ve mekanik stresler ¹⁶ tarafından üretilen biyolojik etkileri etkileyebilecek, kontrol edilmemiştir.

Önceki çalışmalarda, bu sakıncaların üstesinden gelmek için, kısa bir süre önce kabarcık üretimi, hücre desen, kabarcık kabarcıklı-hücre etkileşimleri ve gerçek zamanlı mikroimalat techn benzersiz bir kombinasyonunu kullanarak inşa mikroakışkan çipte hücre tepkisinin biyo-deneyler için deneysel bir sistem geliştirmişlerdiriques. Alanında diğerlerinden bizim deneysel sistem ayırt üç ana özellikleri şunlardır: 1) cam tabaka üzerinde mikron büyüklüğünde altın noktaların desenleme kabarcık nesil ¹⁷ için yerelleştirilmiş lazer emilimini sağlamak için; 2) aynı levha üzerine hücre yapışması için hücre dışı matrisin (ECM) mikron boyutunda adalar desen konumu ve tek tek hücrelerin geometrisini, hem kontrol etmek için; ve 3) yarı-2B uzaya 3 boyutlu kabarcık-bubble-hücre etkileşimi etki boyutunun sıkıştırma tüm yakalanan, akış alanları, hücre deformasyonu ve biyoetkiler jeti, kabarcık kabarcık etkileşimleri düzlem görselleştirme kolaylaştırmak için bir aerodinamik görüntüleme dizisi (Şekil 1d).

Şekil 1: mikroakışkan çip ve farklı deneyleri şematik. a) kanallı bir araya mikroakışkan çip mavi mürekkeple dolu görselleştirme için. b) desenli hücreleri ve altın noktalarla mikroakışkan çip içinde bir bölge (yakınlık iki altın nokta arasındaki mesafe) 40 mm. çalışma birimlerinin çoğu çifti, bir kanal düzenlenebilir. Altın noktaların bir çift ve hücre-yapıya model verme bölgesi yapıştırılmış bir HeLa hücre oluşan tek bir çalışma biriminin C) yakın çekim görüntüsü. Cihaz çalışma d) şematik. Bir tek hücre yapışır ve fibronektin ile kaplı "H" şeklindeki adada yayılır. Anti-faz osilasyonlu kavitasyon kabarcıkları (tandem balonu) bir çift yakın bir hedef hücreye doğru hareket eden bir hızlı ve lokalize jet oluşmasına yol (Şekil 4A), altın nokta darbeli lazer ışınları aydınlatılarak üretilir. Hücre, deforme makromoleküler alımı için gözeneklendirilmiş ve / veya ikili kabarcık hücrenin uzak-durma mesafesi (S _D) bağlı olarak, bir kalsiyum tepki ile stimüle edilebilir.f = "https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu platform, daha floresan deneyleri ve kavitasyon kaynaklı Biyolojik Etkileri için hücre yüzeyi bağlı fonksiyonalize boncuklar ile birleştirilebilir. Özel olarak, bu platform, tek hücre düzeyinde güvenilir ve ölçülebilir deneyleri için yolu açar. Şimdiye kadar, bizim ikili kabarcık kaynaklı hücre membran deformasyon hücre gözeneklendirilmesi ya da hücre içi alımını, canlılığı, apoptozi, ve hücre içi kalsiyum tepkisinin analizi için cihaz kullanmıştır. Aşağıdaki protokol, çip imalat işlemi ve yukarıda belirtilen çeşitli biyolojik etkileri analiz prosedürü açıklar. Ayrıca, chip işlemleri de tarif edilmiştir.

1. Mikro ve

NOT: Tüm mikroüretim prosedürleri bir temiz oda yapılmaktadır. Bir krom maskesi, önceki mikrofabrikasyon için tasarlanmış bakınız Şekil 2 edilir.

Şekil 2: mikroakışkan çip kanal tasarım ve çalışma birimlerinin boyutları şematik. ) (mavi ve kırmızı cam alt tabaka üzerine hizalanmış PDMS mikro kanallarda (yeşil) ve desen) Maske tasarımı. çalışma birimi diziler temsili bir bölümünde maske tasarımı b) Genişletilmiş görüntü. hücre deseni (mavi) ve altın nokta çifti (kırmızı) gösteren bir çalışma birimine c) şematik. Tüm uzunluk ölçekleri sağ alt gösterilir. Bir LAR görmek için buraya tıklayınızBu rakamın ger sürümü.

1. Altın nokta desenleme
   NOT: buna yapışan tek tek hücrelerin önlemek için yeterli balon üretimi için lazer enerjisini emmek için yeterince büyük, fakat küçük olacak şekilde, her altın nokta alanı, 25-30 mikron ² içinde olacak şekilde tasarlanmıştır. Altın nokta üretimi için bir şematik diyagramdır Şekil 3a'da gösterilmektedir.
   1. (Kimyasal kaputu) temizlik cam slayt
      1. Izopropil alkol (IPA) ve ardından aseton ile cam slayt yıkayın ve daha sonra _N2 akışı ile kurutulur.
      2. 10 dakika piranha çözüm slayt (: H ₂ O ₂ = 4 1 H ₂ SO ₄₎ bekletin.
      3. , Slayt dışarı atın DI su ile durulayın ve daha sonra N ₂ akışı ile kurulayın.
      4. 10 dakika boyunca 120 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde cam slayt fırında.
      5. 90 s için 100 W bir plazma temizleyici slayt davranın.
   2. Spin kaplama (Spin-kaplama kaput)
      1. Bir ocak açmak ve sıcaklık 95 ° C'de stabil hale gelene kadar bekleyin.
      2. Kaplama işlemi uygulayın:
         500 dev / s rampa ile 5 s için 1000 rpm;
         Daha sonra 1.000 rpm / s rampa ile 30 saniye süreyle 3,000 rpm.
      3. Bir vakum uygulanarak sıkma kaplayıcı üzerine temizlenmiş cam slayt sabitleyin.
      4. P-20 ile slayt yüzeyini kaplayan ve kaplama tarifi başlar.
      5. NFR-negatif fotorezist kaplama işlemi tekrarlayın.
      6. 60 saniye için 95 ° C de slayt fırında ve oda sıcaklığına soğuyana kadar bekleyin.
   3. Fotolitografi
      1. Maske hizalama üzerine krom maskesi takın ve desen tarafı aşağı slayt doğru baktığından emin olun.
      2. maske ile cam alt tabakayı hizalamak hızlı UV ışınlarına maruz kalma 9 s sabit pozlama moduna fotolitografi tarifi ayarlayın.
      3. UV maruziyetini yaptıktan sonra, 95 ° C'de slayt fırında6, C, 1 dakika boyunca ve daha sonra oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.
   4. gelişme
      1. 60 saniye boyunca geliştirici çözeltisi içinde slayt desen geliştirin.
      2. , Geliştirici slayt çıkarın DI su ile yıkayın ve _N2 akımı ile kurulayın.
      3. Mikroskop altında kalıp geometrisi kontrol edin ve ölçmek ve özellik boyutunu kaydeder.
   5. Altın birikimi (E-ışın buharlaşma) ve havalanma
      1. 5 dakika boyunca 120 ° C 'de slayt fırında ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      2. 500 Torr ve 100 W 90 saniye boyunca reaktif iyon aşındırma (RIE) makinede plazma ile slayt temizleyin
      3. Depozito 5 Ti nm ve E-ışın evaporatör ¹⁷ kullanılarak slayt üzerine Au 15 nm.
      4. karşı NFR en altın dinlenme çıkarmak için çözücü, fotorezist çıkarıcı içeren bir cam beher içinde, gece boyunca slayt bekletin.
      5. slayt Al, floş iaseton ile T IPA ardından ve _{bir N2} akımı ile kurutun.
      6. 90 s için 100 W oksijen plazma temizleyici olarak temizlemeden önce 115 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde slayt kurutun.
2. Asansör-off moleküler montaj desenlendirme (MAPL)
   Not: Her fibronektin kaplı ada alanı 700-900 mikron ² ada araya birden fazla hücre şansını en aza indirirken, kare bölgede yayılan yeterli HeLa hücre kolaylaştırmak dahilinde ayarlanır. Hücre-desen adalar hazırlanması için bir şematik diyagramıdır, Şekil 3b'de gösterilmiştir.
   1. Spin kaplama
      1. Adımı tekrarlayın 1.1.2, ancak S1813-pozitif ışığa ve 115 ° C sıcaklığa kullanın.
   2. Bağlantısızlar fotolitografi
      1. Maske hizalama üzerine krom maskesi takın ve desenli yan ile slayt aşağı doğru baktığından emin olunaltın nokta.
      2. UV ışınlarına maruz 9 s sabit pozlama moduna fotolitografi tarifi ayarlayın.
      3. mekansal bir referans olarak, maske kenarı etrafında bulunan hizalama işaretlerini kullanarak alt slayt üst maske aynı hizaya getirin.
      4. Maskenin orta bölümünü kontrol edin ve desen özellikleri düzgün hizalanmış emin olun.
      5. bir post-fırında olmadan UV maruziyetini tamamlayın.
   3. gelişme
      1. 1.1.3 ama gelişme 45 s bir ocak kurutma ve _N2 depolama koruyarak önce adımı tekrarlayın.
3. kimyasal arıtma
   1. pasifleştirme çözeltisi hazırlayın: 0.5 mg / 10 mM HEPES tamponu mL PLL-g-PEG.
   2. N ₂ depodan slayt almak ve parametre ayarı ile Rie kullanarak temizleyin: 500 Torr basınç, 100-W güç ve 90 s beklemeli.
   3. parafin film parçası üzerine çözüm pasifize Pipet bir damla.
   4. desenli yan filmden aşağı doğru baktığından özellikleri emin, film ve slayt ile çözüm Sandwich; kabarcıkların oluşumunu önlemek.
   5. filmden slayt çıkarmadan önce 45 dakika boyunca bekleyin.
   6. fotorezist çıkarıcı, fotorezist sökücü ve Dİ su (1: 1) ardışık olarak slayt emmek ve DI suyun ve her bir sulama için 90 saniye süreyle bir ultrason banyosu içinde çalkalayın.
   7. Bir desikatörde onu mühürleme ve buzdolabında saklamadan önce nemi ortadan kaldırmak için bir ocak slayt kurutun.
4. Chip montajı
   1. Tekrarlayın 1.1.1-1.1.4 adımları ancak SU8-2025-negatif fotorezist ve parametre ayarı ile bir photomask bir silikon kalıp hazırlamak, Microchem protokolü ¹⁸ olarak adlandırılan başvurulmakta.
   2. PDMS Mikrokanallı (40 mm x 25 mm x 5 mm, U x G x Y) ve yumuşak litografi kullanarak küçük bir PDMS levha (800 mikron çapında oluk yapısı) Üretiyor.
   3. microchanne punchSıvı erişim noktaları için l ve temiz o bantla ve daha sonra IPA ile.
   4. PDMS levha cam substratın desenli alanını koruyun ve Rie uygulamak (100 W, 500 mTorr'luk, 60 ler) periferik alanından PLL-g-PEG kaldırmak için.
   5. RIE (25 W, 500 mTor, 25 s) bir azalma dozda Mikrokanallı davranın ve daha sonra (kaldırılmış küçük PDMS levha ile) buzlu cam alt tabakaya aynı hizaya getirin Mikrokanallı ve Stereoskop altında konformal temas buzlu cam alt tabakayı getirmek.

Şekil 3: mikroüretim ve yonga montaj şematik diyagramı. Cam alt tabaka üzerinde altın noktaların) Modeli. MAPL yoluyla hücre desen için cam alt-tabaka, b) hazırlanması. c) Plazma bağı ile mikroakışkan kanal montajı. o tanımları için Malzeme Listesi görünkısaltmalar f. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. hücre eki
   Not: HeLa hücreleri rutin bir hücre kültürü inkübatöründe% 10 FBS ve% 1 antibiyotik / antimitotik çözeltisi ile takviye edilmiş DMEM içinde muhafaza edilir. Çip düzeneği ve hücre bağlanması için bir şematik diyagramdır Şekil 3c'de gösterilmiştir.
   1. Prime 1 uL / ​​dakikada, 30 dakika boyunca PBS ile çip ve daha sonra süzülür fibronektin çözeltisi (PBS içinde 50 ug / mL, 1 mL / dakika) ile 45 dakika boyunca karıştırılır.
   2. % 0.25 tripsin-EDTA ile tripsinize edin hücre kültürü beklerken, kültür ortamı, santrifüj, tek tek hücrelerin yıkayın ve 5x10 ⁶ hücre / mL önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı içinde hücre süspansiyonu sulandırın.
   3. PBS ile fibronektin çözeltisi yerine ve 5 dakika boyunca 10 uL / ​​dakika çip yıkayın.
   4. enjekte etmekçip halinde hazırlanan hücre süspansiyonu, akışını durdurmak çıkış kelepçe ve 30 dakika için bir hücre kültürü inkübatöründe çip korumak.
   5. çıkış bırakın ve 5 dakika boyunca 10 uL / ​​dakika ile hücre kültür ortamı ile çip yıkayın. 0.75 uL / ​​dak kültür ortamı perfüzyon akış oranının azaltılması ve inkübatör içinde 2 saat boyunca hücre kültürü korumak.

2. Kabarcık Üretimi ve Akış Görselleştirme

NOT: deney düzeneği şematik tandem kabarcık üretimi ve bir mikroakışkan kanal yakındaki yetiştirilen tek bir hücre ile bileşke akım etkileşimi Şekil 4a gösterilmiştir.

1. Tandem Nesil iki lazerler ve zamanlama kontrolü ile kabarcıklar
   1. ters bir mikroskop sahnede mikroakışkan çip yerleştirin ve iki darbeli Nd odakları align: desenli altın nokta ayrılmış b bir çift YAG lazer (λ = 532 nm, 5-ns darbe süresi)Y 40 um.
   2. altın nokta başlatılan iki kabarcıklar üretmek için 2.5 us hakkında bir zaman gecikmesi ile iki lazer tetiklemek için bir dijital gecikme jeneratör kullanın.
   3. 50 ± 2 um olan kabarcıklar maksimum çapı üretilmesi için bir lazer çıkış enerjisi (~ 10 μJ) ayarlayın.
   4. lazerlere bir yüksek hızlı kamera (200 ns pozlama ve saniyede 2 milyon çerçeve (fps)) senkronize etmek ve kabarcık genişleme, çöküşü, kabarcık kabarcık etkileşimi ve jet oluşumu dinamiklerini.
2. Jet hızının kantifikasyonu
   1. İlk baloncuk (B ₁₎ ve B ₁ uzak ucunun yakın ucunda püskürtme ucu (J ₁₎ konumunu kaydedin ikinci ısıtıcıların (B ₂₎ oluşturulması başlayan ve J gol ile biten B ₁ uzak ucuna doğru _1; Şekil 5a şematik bakın.
   2. Lineer bot için pozisyon zaman ders uygunh proksimal (jet ucu) ve distal uçları. yakın uç jet hızını belirlemek için zaman eğrisi uç pozisyon eğimini hesaplayın. iki satır kesişim jet konma zamanı gösterir. Daha fazla detay Referans 19 bulunabilir.
3. Tandem kabarcık kaynaklı akış alanının görselleştirilmesi
   1. DI su 1 mikron polistiren (PS) boncuk süspansiyonu ve mikroakışkan çip içine boncuk enjekte (w / v% 2.6) hazırlayın.
   2. Adım 2.1.1-2.1.3 açıklandığı gibi tandem kabarcıklar oluşturur.
   3. 100 ns pozlama süresi ile 5 M fps çerçeve hızında bir yüksek hızlı video kamera kullanarak tandem kabarcık dinamiklerini kaydedin.
   4. ticari bir PIV yazılımı içine elde edilen görüntü dizisi yükleyin.
   5. % 75 örtüşme ile 16 x 16 piksel (px) küçük sorgulama pencere içine her görüntüyü bölün.
   6. hız alanı hesaplama hataları azaltmak için multi-pass yineleme ve bölgesel filtreleri uygulayın veçıkış hız vektörü haritası sonuçları.

Şekil 4: Deney düzeneği ve görüntü kayıt şematik. tandem kabarcık üretimi için) deney düzeneği. b) Zaman dizisi görüntüleme satın almalar farklı türleri için kullanılır. FL: floresan mikroskopi, BF: Aydınlık alan, IFT: interframe zaman. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Tek hücreli Analizi ve Biyolojik Etkileri

Not: Tandem balonu hedef hücrelere aşağıdaki üretilir ve elde edilen biyolojik etkileri, bir uzak-durma mesafesi bağımlı bir şekilde incelenmiştir. Görüntü satın alma farklı zaman dizisi Şekil 4b'de gösterilmiştir.

1. Membran gözeneklendirme ve makromolekül alımı
   Not: hedef hücreye, hücre dışı makromoleküllerin alınması, hücre zarı üzerinde gözeneklendirme sitesi üzerinden membran geçirgen olmayan propidyum iyodür aşamalı difüzyon (PI) ile karakterize edilir.
   1. Aşama 1.5 takiben deney süresince 0.5 uL / dakikalık bir perfüzyon akış hızında çalışan PI çözeltisi (DMEM içinde 100 ug / mL) ile normal kültür ortamı (yani, DMEM) değiştirin.
   2. otomatik olarak 200 ms bir pozlama süresi ile floresan görüntü yakalamak için PI floresan uyarma ile CCD kamera zamanlamasını dönen taret PI floresan küp seçin ve senkronize etmek için mikroskop kontrol yazılımı programlayın.
   3. iki lazer odak aşağıdaki ardışık balonu tedaviden önce, bir hedef hücre, kayıt parlak saha (BF) hem de flöresanlı (FL) görüntü altın nokta bir çift hizalanmış sonra.
   4. hemen mikroskop kontrol yazılımı kullanınkısa bir süre sonra PI alımı tarihini yakalamak için 2.1 adım hedef hücrenin bir time-lapse floresan görüntü kaydı başlatın.
2. membran deformasyon
   1. 1 mikron boncuk (a / h,% 1 suda çözünen karbodiimid ile aktive edilmiş) hazırlanması ve Peptid-2000 (PBS içinde 100 ug / ml) ile işlevselleştirilmesi.
   2. Aşama 1.5 ardından, 30 dakika boyunca 37 ° C'de 1x10 ⁹ boncuk / ml yoğunluğunda fonksiyonalize boncuklarla bağlı hücreler inkübe edin.
   3. Adımı yineleyin 2.1 hedef hücreye yanında tandem kabarcıklar üretmek ve ultra yüksek hızlı kamera 5 milyon fps çerçeve hızında çalışan hücre deformasyonu kaydetmek için.
   4. Deney boyunca görüntüleme düzleminde kalır 3 boncuk bir üçlü belirlemek ve bunların konumlarını (x _1, y ₁₎ (x _2, y ₂₎ derlemek ve (x _3, y ₃₎ deneyde koordine eder.
   5. öncesi ve af üçlüsü alanı hesaplayınformülü kullanarak tandem kabarcık tedavisi ter:
      
   6. Alan zorlanma olarak hesaplayın:
      
   7. Öncesi ve tandem kabarcık tedavi sonrası üç köşe koordinatları dayanarak kurulan protokolleri ^20,21 aşağıdaki yerel ana gerilme ve alan gerginlik hesaplar.
3. Canlılık ve apoptoz
   NOT: FITC Annexin V fosfatidilserin (yeşil floresan) haricileştirilmesinin yoluyla, apoptotik olanlar da dahil olmak üzere hücreleri, etiketler. PI nekrotik hücreler (kırmızı floresan) çekirdekleri etiketler. Aydınlık alan görüntüleme hücre morfolojisi belgelemek ve hücre canlılığı ve apoptozun tanımlamasına yardımcı olmak için kullanılır.
   1. Şekil 2b, bkz kanal adres etiketleri tarafından kolaylaştırılır mikroakışkan kanal (her tedavi hücrenin konumunu kaydedin ) adımı 3.1 tekrarlayarak ederken.
   2. 15 dakika boyunca FITC Annexin V çözeltisi ile çip perfüze önce 2 saat daha hücre kültür ortamı içinde muamele hücreleri inkübe edin. Pozitif hücreler, yeşil floresan gösterirler.
   3. 24 saat tandem kabarcık tedaviden sonra adımı yineleyin 3.3.2 hedeflenen hücrelerin uzun süreli biyoetkiler incelemek için.
4. kalsiyum yanıtı
   1. W 3 uL 10 ile% fura-2:00 stok solüsyonu 3 uL (DMSO içinde 1 mg / ml) karışımı / Pluronic F-127 son etiketleme çözeltisi (6 uM) hazırlanması için düşük serum ortamı 500 mL hacim.
   2. Aşama 1.5 ardından etiketleme çözeltisi ile hücre kültür ortamı yerine ve 40 dakika boyunca (1 mL / dakika perfüzyon oranı) boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. Hücre deney başlamadan önce düşük serum ortamında (0.75 mL / dak perfüzyon oranı) ile kanal doldurun.
   4. oranlı metrik görüntüleme başlatın (dalga boyu: 340/380 nm, 50 ms maruz kalma)Hedef hücrenin ticari PTI sistemi kullanılarak.
   5. dinlenme seviyesinde hücrenin oranlı metrik görüntüleme, adım 2.1 olarak tandem kabarcıkları üretmek 10 sn sonra; 1 dakika boyunca 0.1 sn interframe zamanında (IFT) ile ilk kayıt, daha sonra başka bir dakika 1 s IFT artırmak ve 2 dakika sonra 5 sn daha fazla artış.
   6. hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile orantılıdır ilgili bölge (ROI) olarak oranı R = F340 / F380 hesaplamak için PTI yazılımını kullanarak.

Bu çalışmada tarif mikroakışkan platformu balonu kabarcıklı etkileşimlerini incelemek ve tek hücre düzeyinde kavitasyon kaynaklı Biyolojik Etkileri çeşitli analiz etmek için kullanılabilir. Burada, deneysel sistemde gerçekleştirilebilir deneysel çalışmalar ve biyo-tahliller, çeşitli göstermek için çok sayıda örnek sunulmuştur. Biz ilk jet oluşumu, ortaya çıkan akış alanının görselleştirme ve jet hızı (Şekil 5a) hesaplanması ile tandem baloncuklar geçici etkileşimleri açıklayacaktır. Bu ikili sonra, bu örnekler, lokalize hücre zarı deformasyon kabarcık kaynaklı olacaktır (Şekil 5B), PI alımı (Şekil 5C), ve hücre içi kalsiyum tepki (Şekil 5d) ile kesin olarak membran gözeneklendirme. Bu hücre canlılığı ve apoptozis tahlilleri gibi diğer örnekleri, Referans 22 bulunabilir.

Şekil 5a yüksek hızlı görüntüleme ile yakalanan jet oluşumu, ve PIV tarafından ortaya Elde edilen akış alanı ile tandem kabarcık etkileşimin bir örneğini göstermektedir. Özellikle, maksimal genişleme sonrasında (0 us üretilen) ilk balonu B ₁ çöküşü bir "yukarı" oluşumuna yol açan, (2.5 us üretilen) ikinci baloncuk B ₂ hızla genişlemesi ile asimetrik bozulduğu 5.4 us gösterilen 3.4 us jet (J ₁₎ ve sonraki püskürtme akışı. Ortalama püskürtme hızı gol önce B ₁ yakın ucuna (ya da kutup) konumu için, uydurulmuş çizginin eğimini ile belirlenir (örneğin, B ₁ uzak ucu ile temas) zamana karşı. Ortalama püskürtme hızı olduğunda B maksimum çapı 40 ila ₂ artar 60 um 20 ila 58 m / s arasında geliştirmek için bulunmuştur. PIV analizi, tand etrafında yönlü püskürtme akışının sonuçlarına dayanarakem kabarcık 10 m / s mertebesinde olduğu ve 10 mikron mertebesinde bir genişlik içinde sınırlıdır. Bu yakın yetişen bir hedef hücre üzerine bir itici ve lokalize kayma gerilme ve gerilme degrade üretme böylece yeteneğine sahiptir.

Şekil 5b'de gösterilen diğer bir örnek tandem tarafından üretilen yönsel ve lokalize püskürtme akışının neden olduğu hücre membranı deformasyon uzak-durma mesafesi S _D = 40 um kabarcıklar göstermektedir. Membran deformasyonu ve geri hücre zarı ön kenarına bağlanmış (sarı noktalı çizgi ile gösterilir), bir işlevselleştirilmiş boncuk yer değiştirmesi ile vurgulanır. yerel alan suşu bitişik boncuk üçlüsü koordinatları hesaplanabilir. hücre yüzeyi üzerindeki farklı yerlerde hesaplanan maksimum alan değişikliği şematik ortasında gösterilmiştir. öncü öncelikle, (yeşil çevreleri bakınız) gerilir firar kenarında veya enlem süre(Kırmızı daireler ile belirtildiği gibi), hücrenin taraflı kenarları ikili kabarcık neden püskürtme akışı ile üretilen hücre deformasyon heterojenite işaret sıkıştırılmıştır. Hücre öncü alan suşu zamansal değişimi sağda gösterilmiştir. Yaklaşık 100 uS (FWHM) ve birkaç ms bir zaman ölçeğinde, bir sonraki kademeli bir toparlanma için büyük ve sürekli gerilme ardından başlangıcında birkaç hızlı salınım, oluşmaktadır.

Gösterildiği gibi Ayrıca, geniş bir alan gerilimi ve hücreye entegre soyu öncü, küçük S _d gözlenen hücre membran gözeneksiz sorumlu olabilir Şekil 5c. Küçük S _d (örneğin, 10 um, ya da bazı durumlarda, 20 um olarak) ve ara S _D (yani, 20 ve 30 um arasında çoğunluk), lokalize bir membran bozulması hücre dışı PI bir iğne ucu emme içine yol indüklenirSitosol. hücre içinde PI yoğunluğu doygunluğu olmadan artan devam ederse, nekroz meydana gelir. PI yoğunluğu büyüklükte bir düzen düşüktür ve tandem kabarcık tedaviyi takiben 10 saniye içinde bir platoya ulaştığı takdirde karşılaştırıldığında, olası hücre canlılığı ile onarılabilir gözeneklendirme ayrıca hücre morfolojisi minimal değişiklik tarafından desteklenen, ortaya çıkar. Büyük S _d (yani, 40 mikron), en önemsiz PI alımı önemsiz veya non-gözeneklendirme belirten tandem kabarcık tedavisini takiben bulundu edilir. Hücre düzenli büyümesi ve çoğalması ²² ile yaşayabilir. Genel olarak, sonuçlar _{D d} ≈ 20-40 um aralığı içinde olmayan, gözeneklendirme işleminden tamir membran gözeneksiz yoluyla nekroz hücre yanıt olarak açık bir geçişi göstermektedir.

Son olarak, farklı S tek tek hücreler tandem kabarcıkları ile ortaya çıkarılan hücre içi kalsiyum tepkisinin rasyometrik görüntüleme sonuçlarını göstermektedird özellikle S _d öldürücü olmayan aralığında = 30-50 mikron (Şekil 5d). yoğunluk oranı, hücre içi kalsiyum miktarı ile orantılıdır. Küçük S _d (yani, 30 mikron ya da, bazı durumlarda, 40 mikron olarak), arka kenarından diğer kenarına seyahat bir kalsiyum dalgası açıkça tandem kabarcık tedavisi sonrasında birkaç saniye içinde görülür. hücre içi kalsiyum bir zirve konsantrasyonu ulaştıktan sonra, yavaş yavaş geri birkaç dakika içinde dinlenme düzeyine bozunur. Bunun aksine, büyük S _D (yani, 50 um'lik bir kısmı, ya da bazı durumlarda, 40 um), hücre içi kalsiyum artışı çok hafif ve Resim açıkça görülebilir yolculuk kalsiyum dalga tespit edilebilir. Bu iki farklı kalsiyum tepkileri de zirve seviyesi istirahat yoğunluk oranı yükselme zamanını en yüksek genliğinde anlamlı bir fark ile, onların yoğunluk oranı zamana karşı profil ayırt edilebilirdeğer. Daha büyük bir S _D (yani, 60 um ile elde edilmiş) 'de, herhangi bir kalsiyum tepki gözlenebilir. Çeşitli S _d kalsiyum yanıtları görüntüleme HeLa hücrelerin yüzdesi Şekil 5D (sağda) özetlenmiştir.

Sonuç olarak, bizim bulgularımız püskürtme akışının gücünü değiştirme (veya S değiştirme _D) ile Biyolojik Etkileri çeşitli olası genlik ve süresi ile ilişkilidir içindeki kültür koşulları altında ayrı ayrı HeLa hücrelerinde üretilebilir olduğunu göstermiştir hücre membranı ²² uygulanan mekanik deformasyon.

Şekil 5: ikili kabarcık etkileşimi, hücre zarı deformasyon, membran gözeneklendirilmesi ve kalsiyum tepki deneyleri sonuçları. a) Sıvı hareket ve jettandem kabarcık etkileşim yoluyla uyarılan. Sol: Seçilen kareleri jet oluşumu ile tandem kabarcık etkileşimleri gösteren ve PIV ortaya alanını akış. İki kabarcıkların en küçük çaplar yaklaşık ± 2 um 50 vardır. Orta: jeti tandem kabarcıklarının şematik, ilk balonu B ₁ merkez ekseni koordinatları (o) kökeni ve yakın ve uzak uçlar (veya kutuplar) gösteren. Sağ: proksimal ve B ₁ uzak ucunda (hata ile = ± 1 mm) ölçülen pol pozisyonu. b) Hücre zarı deformasyon. Sol: sarı bir kesikli çizgi, yerel membran deformasyon ve kurtarma gösteren hücre zarı ön kenarına bağlanmış bir PS boncuk yer değiştirmesini etiketler. Orta: şematik pik alanı gösteren sol tarafta gösterilen hücre yüzeyi üzerinde farklı konumlarda zorlamaktadır. Sağ: Hücre ön kenarının ortasında alan suşları zamanlı kurslar. _Δ ε alan suşu hesaplanan bas olduğunuasıl suşları üzerinde ed ve _Δ Δ üçlü geometri değişikliği üzerinden hesaplanan alan türdür. Alan zorlanma hesaplama ve hata analizi hakkında daha fazla detay Referans 22. c) Hücre zarı gözeneklendirme belgelenmiştir. Sol: parlak bir alan görüntüler öncesi ve PI alımı (0 ve 120 ler) in tandem kabarcık tedavisi ve time-lapse floresan görüntüleri sonra. beyaz oklar püskürtme akış yönünü gösterir. Orta: hücre içinde ortalama PI yoğunluğu zamana göre tipik bir değişiklik. Sağ: Farklı S _d nekroz (kırmızı), tamir gözeneklendirilmesini (mavi) ve non-gözeneklendirme (yeşil) uygulanan hücre yüzdesi istatistiksel sonuçları. Hücre sayısı tedavi: n = 9, 14, 14, ve _{S, d} = 10, 20, 30 8, 40, sırası ile. Istatistik hatası ± 1 / √ N. d) Hücre içi kalsiyum yanıttır. Sol: Bireysel hücrenin hücre içi kalsiyum yanıtları gösteren oranlı metrik görüntülerin dizileri30 mikron ve 50 mikron S _d s. kırmızı oklar jet yönünü gösterir. Orta: Farklı S _d tipik tepki profilleri (oran-zaman eğrileri). Sağ: Farklı S _d kalsiyum tepki olasılığı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1: PIV sonuçlarından akış fiziği parametrelerin bir listesi. Reynolds sayısı Tahmini ve farklı soğukluk mesafeler (S _d) göre kayma gerilmesi ortalama. YZ düzlemi kanal genişlik x yükseklik düzlemine gelir. kanal hücre yüksekliği yaklaşık 6-7 mikron olduğu için ortalama kayma gerilmesi kanal alttan 0 um 7.7 yükseklikten tahmin edilmektedir.

Tek hücre analizi, canlı hücre görüntüleme ile birlikte, büyük ölçüde bu tür fenotip gelişimi ve bağışıklık yanıtı ²³ olarak bireysel hücrelerin, dinamik ve sık sık değişen süreçlerin anlayışımızı artırmıştır. yemekleri ya da şişelere konvansiyonel hücre kültürü tersine, mikrokanallar gerçek zamanlı olarak aşağı doğru tek hücre seviyesine mikro hassas kontrolünü, sağlar. Sonuç olarak, mikroakışkan teknolojik gelişmeler ve teknikler büyük ölçüde tek hücre analizinin verimi ve tekrarlanabilirlik düzeldi. Yumuşak litografi ve yüzey desenlendirme entegre ederek, mikroakışkan sistemleri daha spatiotemporally değişken uyaranların karmaşık desenleri tek bir hücrenin tepkisinde derinlemesine analizini kolaylaştırmak için tasarlanmış olabilir. Örneğin geçici kimyasal ya da mekanik ipuçları başarılı biyolojik veya mekanik yanıtları otomatik olarak kaydedilir ise tek hücrelere verilen ve ² analiz edilmiştir4. Bu genel eğilime rağmen, hücresel düzeyde kavitasyon kaynaklı biyoetkiler analiz için Mikroakiskan uygulanması çok sınırlı kalmıştır. En önemlisi, bu sadece micropillars ¹¹ tarafından tutulan süspansiyon içinde tek tek hücrelerin balon kaynaklı membran gözeneksiz uygulanmıştır. yapışık hücreleri üzerinde çalışmaların çoğunda, dinamik kabarcık hücre etkileşimleri tutarlılığı korumak için hücre morfolojisi kontrol yararı bulunmadığı veya büyük ölçüde ihmal olduğunu.

Biz tam başlatılması, daha sonraki genişleme ve kavitasyon baloncukları çöküşü dinamiklerini kontrol etmek için bir mikroakışkan sistem geliştirdik; jet oluşumu ile kabarcık kabarcık etkileşimleri; ve bu nedenle yeniden üretilebilir püskürtme akışı sağlayan hücre şekli, yönlendirme, yapışma modeli ve kabarcıkları uzak-durma mesafesi, iyi kontrol edilen deneysel koşullar altında tek tek hücrelere uygulanır. Bu yeni mikroakışkan sistem temel st yürütülmesi için idealdirkavitasyon kabarcığı (ler) udies gibi SWL, HIFU, ve sonoporation gibi terapötik ultrason uygulamalarında, çeşitli bir yelpazede alakalı etkileşimleri cell. Biz mikroakışkan sistemi daha kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir bir şekilde, hücre zarı deformasyon, membran gözeneksiz, canlılığı ve kalsiyum tepki de dahil olmak üzere, çeşitli kavitasyon kaynaklı biyoetkiler araştırmak için kullanılabileceğini göstermiştir. En önemlisi, tandem kabarcıkları tarafından üretilen yönlü püskürtme akışı iyi karakterize edilmemiştir yüksek gerilme-oranları altında tek tek hücrelerin içinde mekanik özellik ve kalsiyum yanıtını araştırmak için bize izin verir. Böyle bir püskürtme akışı tarafından üretilen lokalize, dürtüsel mekanik stres klasik germe gibi mikropipet aspirasyon ²⁵ gibi yöntemlerle ve optik ²⁶ kullanımı ve manyetik cımbız ²⁷ ile elde edilemez. Ayrıca, ultrason kontrast ajanları ^8,28-30 veya kullanarak önceki çalışmaların aksine lazer kaynaklı tek bubbles ^31,32, bizim mikroakışkan sistemi böylece hücresel tepki ve biyolojik ¹⁶ üzerindeki büyük etkisini azaltarak, hücre geometrisi ve yapışma koşullarının daha iyi kontrol sunmaktadır.

Bizim teknik, güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, bir deneysel sistem aslına sadık kalınarak emin olmak için dikkatlice protokolü takip etmelidir. Mikrokanallı yüzey desenleme kalite kabarcık-bubble-hücre etkileşimleri tekrarlanabilirlik ve mansap biyolojik etkilerin oluşması çağlayan birinci derecede sorumludur. Örneğin, HeLa hücreleri, her bir altın nokta alanı yapışan hücrelerin önlerken stabil kabarcık oluşumunu sağlamak için yaklaşık 25-30 um ² olmalıdır. Öte yandan, her bir fibronektin kaplı ada alanı ada agrega oluşturucu birden fazla hücre olasılığının azaltılması ise yeterli bir kare içinde tek bir hücre yayılmasını kolaylaştırmak için yaklaşık 700-900 mikron ² olmak zorundadır. hizaAltın noktalar ve fibronektin kaplı adalar arasında tam olarak 1 ° ve 0.5 um olan eksenel hata içinde, açısal hata tutmak için maske hizalama yardımıyla gerçekleştirilmesi gerekir. (: Ps, hücre deformasyon: ms, membran gözeneklendirme: s, apoptosis: h, örneğin kabarcık dinamikleri) Dahası, bu deneysel sistem onların zaman büyüklüğe göre farklılık ölçeği ile, bir dizi etkinlik izlenmesinde çok yönlülük sağlar. Nedenle, doğru (bir dijital gecikme üreteci tarafından kontrol edilen) başlatma sinyali ince ayar her dizinin görüntü elde etme ve kayıt zamanını kontrol etmek önemlidir. tek hücre kültürü de fenotipinde, hücre-hücre varyasyonu en aza indirmek için mikrokanal içinde muhafaza edilmelidir (çoğunlukla morfoloji olarak anılacaktır). Bu nedenle, en az 2 saatlik inkübasyon hücre eki için gerekli ve aşağı hücre tedavisi ile devam etmeden önce adalarda yayılıyor. Her zaman microchann akış hızını tutmak için tavsiye edilirBöylece 3 uL / ​​dakika altında El hücre dolaşan kültür ortamı tarafından üretilen akım kesme stresi fizyolojik aralığı içindedir.

Bizim tekniğin bir akım sınırlama altın nokta, lazer ışınlaması ile kesilip olacaktır çünkü ikili kabarcık etkileşimi ve elde edilen püskürtme akışı sadece bir kez bir hedef hücreye uygulanabilir olmasıdır. Bu dezavantajı hücreleri genellikle kavitasyon olaylara maruz kalan terapötik ultrason, tarafından üretilen biyoetkiler taklit etmek bizim deneysel sistem yeteneğini sınırlar. Ancak, bu geçici sınırlama sıvı ^15'te direkt maruz altın nokta korumak için silikon dioksit başka ince bir tabaka uygulanarak hafifletilebilir. Genel olarak, bizim mikroakışkan sistem kavitasyon kabarcığı (ler) cell etkileşimler üretilen biyoetkiler araştırmak için iyi kontrollü deneysel koşullar sunuyor ve birçok benzersiz özelliklere sahiptir. İlk olarak, boyut ve kavitasyon yeri hem e kabarcıklarXperimental sistemi tam olarak altın noktalar tarafından emilen gelen lazer enerjisini ayarlayarak kontrol edilebilir. İkinci olarak, tek tek hücrelerin geometrisi ve yapışma daha tekrarlanabilir sonuçlara yol açan, hücre yanıtları ve biyolojik üzerindeki etkilerini en aza indirmek için, hücre desenlendirme tarafından standardize edilmiştir. Üçüncü olarak, mikroakışkan çip tasarımı paralel çalışma birimleri her hücre ele alınması ve ayrı ayrı izlenebilir beri mümkün, bu tür kavitasyon maruz kaldıktan sonra, hücre büyümesi, çoğalması, ve potansiyel gen ifadesinin gibi aşağı biyoetkiler, çalışma yapmak. Özetle, bizim mikroakışkan sistemi ve metodolojisi geliştirilmiş hassasiyetle tek tek hücrelerin biyoetkiler incelemek için güvenilir kabarcık kabarcık etkileşimleri oluşturmak.

Mevcut Fiş HeLa hücrelerinin analizi için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, diğer memeli hücre hatları için model adalar modifikasyonu da mümkündür. Çeşitli geliştirmeler daha uyg genişletmek için yapılabilirçip ns. Örneğin, PLL-g-PEG moleküllerinin yerine bile 24 saat sonra göç eden bireysel desenli hücrelerin durdurmak için araştırılabilir. Böyle floresan belirteçleri veya toksik reaktif olarak kimyasallar sadece çip diğer bölgelerde hücreleri etkilemeden, belirli bir konuma uygulanacak, böylece ek olarak, mikroakışkan vanaları ile yeni yonga tasarımları, hücrelerin yerel mikro kontrol etmek için keşfedilmeyi olabilir . Bu gelişmelerle birlikte, burada sunulan mikroakışkan sistem kavitasyon maruz kalma veya bir itici akışı ile üretilen mekanik uyaranlara aşağıdaki gibi metabolizma, ayrımcılık, farklılaşma ve gen ifadesi olarak tek hücreler, uzun vadeli biyoetkiler incelemek için fırsat sağlayabilir.

The authors have nothing to disclose.

We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.