Method Article
The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.
The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.
Son birkaç on yıl içinde, hücre dışı matriks (ECM) çoklu hücre fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol alan bir, çeşitli dinamik ve karmaşık bir ortam olarak kabul haline gelmiştir. Doku düzeyinde, ECM hücre sinyallerini, motilite, farklılaşma, anjiyogenez, kök hücre biyolojisi, tümörogenez, fibrozis, vb 1,2 etkiler. ECM organizasyon ve ECM-bağımlı süreçlerin çalışma böylece hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi için geniş etkileri vardır. ECM kompozisyon, organizasyon ve fonksiyonel özellikleri bir mekanistik anlayışa ulaşmak, ECM doğru izolasyon yöntemleri gereklidir. Doku 3 izolasyon güvenilemez ECM proteinleri erken tespiti ise, kültürlenmiş hücrelerden ECM'nin hazırlanması artık daha yaygın hale gelmiştir.
hücre kökenli ECM izolasyonu ve analiz iki ana nedenden dolayı karmaşıktır. İlk olarak, hücrelerin varlığı veir bol hücre içi proteinleri zor bir ayrık hücre dışı bir yapı olarak ECM izole etmek yapabilirsiniz. Gerçekten de, bazı ECM proteinleri hücre içinde hem de ECM 4 rollere sahiptir; ECM içinde proteinlerin çalışma, hücre içinde kendi rolleri ile karıştırılmamalıdır Bu nedenle, hücre kaynaklı ECM'den hücre içi proteinlerin etkili şekilde uzaklaştırılması önem taşımaktadır. İkinci olarak, hücre-türevi ECM genellikle kovalent olarak çapraz bağlantılı ECM montajı üzerine ve standart deterjanlarda nedenle çözünmeyen birçok büyük, oligomerik proteinler, oluşmaktadır. Bu özellikler çıkarma ve ECM daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu sorunları çözmek için, bir yöntem olup, hücresel bileşenlerden ECM proteinlerinin verimli ayrılmasını sağlayan gereklidir.
Çeşitli yöntemler, hücre kültürü veya doku ekstreleri ya ECM izolasyonu için literatürde tarif edilmiştir. Bu yöntemlerin birçoğu bol ECM pr çıkarılması hedefleniyorotein dokulardan kollajen ve nötr tuzlar 3, asidik koşullar 5,6 veya pepsin 7 kullanımını içerir. Doku özütlerinin toplam ECM izolasyonu genellikle önceden ECM izolasyonuna doku decellularization içerir. Örneğin, bir sıralı özütleme yöntemi, insan kardiyak doku 8 ECM izole tarif edilmiştir. İlk olarak, gevşek bağlı ECM proteinleri sodyum dodesil sülfat (SDS) önce, 0.5 M NaCI ile ekstre edildi hücreleri çıkarmak için kullanılmıştır. Son olarak, kalan ECM proteinleri 4 M guanidin 8 ile ekstre edildi. ECM ayrıca 8 M üre 9 kullanarak hücresizleştirilmiş örneklerinden çözündürülebilir. Diğer teknikler santrifüjleme ile çözünür hücre lizatından çözünmeyen ECM proteinlerinin ayrılması önce her iki hücreleri ve ECM çıkarmak için, örneğin deoksikolik asit 10 olarak deterjan kullanımı.
izolasyon ve bu raporda açıklanan hücre kökenli ECM analizi için yöntem Repro sağlarhücre malzemenin çıkartılması in situ imünofloresansta analiz ya da daha fazla biyokimyasal analiz için elde edilebilir hücresinden türetilmiş ECM bırakmak için tekrarlanabilir bir yöntem. Bu yöntem, herhangi bir yapışık hücre tipi için uyarlanabilir ve immunoblotting ya da kütle spektrometrisi, veya fonksiyonel çalışmalarda izole ECM'nin kullanımı için alt-prosedürler için ölçeklenebilir. Yöntem ayrıca, gerçek zamanlı olarak ilgi konusu bir etiketli protein ECM birikmesini izlemek için canlı hücre konfokal mikroskobu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu ızgaralı cam tabanlı bir çanak kullanımı ile elde edilir. Genel olarak, yaklaşım, hücre-türevli ECM ve tespit etmek ve çökelmesini ve bireysel ECM proteinlerinin dinamiklerini izlemek için kapsam doğru bir izolasyon sağlar.
Amonyum hidroksit çözeltisi ile Hücreleri 1. Temizleme
Canlı hücreler Konfokal Mikroskopi Görüntüleme tarafından ECM Protein 2. Takip Biriktirme
Hücre Fonksiyonel Tahliller için Hücre türetilen ECM 3. Steril hazırlanması
SDS-PAGE, imüno-lekeleme analizi veya proteomik ECM'nin 4. Yalıtım
açıklanan protokol hücreleri çıkarmak ve hücre kökenli ECM geride bırakmak için 1.1-1.5 eylemleri adımları. Protokol COS-7 hücreleri cam lameller üzerine 96 saat için büyütülmüştür üzerinde gerçekleştirilmiştir ve hücre-türevi ECM floresan mikroskobu ile analiz edildi. DAPI ve falloidin boyama sırasıyla (Şekil 1) 'e göre, hücre çekirdeğinde aktin hücre iskeletinin kaybı ile oluşturulan amonyum hidroksit ile işlem, etkili bir şekilde hücre çıkarıldı. 2 M üre ile hücrelerinin alınması amonyum hidroksit kadar etkili değildir; DAPI ve Phalloidin boyama izleri tedavi sonrasında tespit edildi. 8 M üre amonyum hidroksit benzer bir etkiye (Şekil 1) vardı. Daha sonra, hücre kökenli ECM amonyum hidroksit, tedavi öncesi ve sonrası görselleştirildi (2.1-2.11 adım). COS-7 hücreleri bir monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile transfekte edildi trombospondin-1 C-terminal trimer (mRFPovTSP1C) 1 etiketli1 ve ızgarah cam tabanı ile 35 mm çanak yetiştirilen.
mRFPovTSP1C ifade eden çok sayıda sağlıklı hücreleri içeren iki saat sonra kaplama, uygun bir ızgara kare konfokal mikroskop altında görüntülendi. Bir referans resmi, faz kontrast bu alanda alındı ve daha sonra, floresan zaman atlamalı görüntüleme, 2 saat (Şekil 2A) her 1 dak gerçekleştirilmiştir. Hücreler daha sonra, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve çanak aynı ızgara kare faz kontrastı altında taşındı ve floresan mikroskobu ile yeniden analiz edilmiştir. Hücreler artık kılavuz kare mevcuttu, fakat mRFPovTSP1C karakteristik puncta (Şekil 2A) ve floresan mikroskobu ile tespit ECM içinde kalmıştır. Hücre çıkarılması öncesinde ECM yatırılır herhangi mRFPovTSP1C floresans model öncesi ve hücre sonrası kaldırma karşılaştırarak tanımlanmıştır. Her iki görüntüde tespit flüoresan puncta (Figu2A yeniden, örneğin ok) ECM ile ilişkili olduğu çıkarılmaktadır.
Amonyum hidroksit ile işlem daha sonra kültür, yapışkan hücrelerden alınan yerel ECM izole etmek için kullanılmıştır. İnsan dermal fibroblastları (HDF) 96 saat boyunca cam lameller üzerinde büyütüldü. Hücreler, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM karakteristik fibril ve ağ örgüsü boyama kalıbı 16 (Şekil 2B) göstermektedir, bir anti-kollajen I antikoru ile problanmıştır. Fibronektin model verme RCS hücreleri (Şekil 2C) çıkarılmasından sonra yaklaşık sabit olmayan permeabilize fare kondrosarkom hücreleri (RCS) ve ECM içinde incelenmiştir. "Test" hücreler fenotipik veya fonksiyonel çalışmalar için ECM üzerine yeniden kaplanabilir böylece ECM'nin amonyum hidroksit izolasyonu steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Örneğin, "test" COS-7 hücreleri, steril RCS hücreleri tarafından üretilen ECM ve t üzerine, 2 saat için kaplanmıştırTavuk kendi ECM üretiminde COS-7 hücreleri (3.1-3.9 adımlar) (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, sabit geçirgen ve FITC falloidin boyama ile F-aktin organizasyon için analiz edilmiştir.
daha büyük bir ölçekte, yöntem, biyokimyasal işlemler için ECM izole etmek için kullanılmıştır. Örneğin, RCS hücreleri 7 gün için iki 100 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında büyütülmüş ve adımda 4,1-4,7 prosedürler takip edildi. Hücre türevi ECM proteinleri, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınarak toplandı ve indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrıldı. Jel proteini için lekeli ve dört büyük bant her izole edilmiş ve kütle spektrometrisi (Şekil 4A) ile analiz edilmiştir. 5 / kıkırdak oligomerik matriks proteini (TSP5 / COMP) ve matrilin-1, trombospondin, fibronektin dahil olmak üzere ECM proteinleri, bir dizi (1, TSP1) trombospondin, (Şekil 4B) tanımlandı.
Alternatif olarak, ECM küçük ölçekli hazırlıkları immunoblotlarda tarafından değerlendirilebilir. Örneğin, ektopik mRFPovTSP1C bir anti-TTT antikoru (Şekil 4C) olan bir PVDF membrana aktarıldı ve RFP problanmış, SDS-PAGE ile ayrılarak ifade eden COS-7 hücreleri hücre-türevi ECM. Bu teknik, TSP1 (mRFPovTSP1C) bir yerli trimerik ve TSP1 C-terminal bölgesinde (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Şekil 4C) arasında pentamer bir mühendislik arasındaki birikme farklılıkları tespit etmek için yeterince hassastır. HDF endojen ECM incelemek için, hücre lizatı veya izole edilmiş ECM'de spesifik proteinlerin varlığı bağışıklık-beneklemesi ile incelenmiştir. Bol miktarda hücre içi proteinlerdir α-tübülin ve β-aktin izole ECM (Şekil 4D), eksik oysa karakteristik ECM proteinleri, fibronektin ve trombospondin-1, ECM tespit edilmiştir.
Şekil 1: Hücre çıkarması Yöntemlerinin Karşılaştırılması. COS-7 hücreleri% 2 PFA sabit lamelleri 96 saat için, yüksek yoğunlukta yetiştirilir ve% 0.5 Triton X100 geçirgen ya da hücre çıkarılması için belirtildiği gibi muamele edildi. Lameller sonra çekirdekleri görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle boyandı. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam Hücre Bilimi 11 Journal of orijinal yayından değiştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: İzole ECM ECM Proteinlerin tanımlanması. (A) Faz-kontrast ve floresan görüntülerimRFPovTSP1C ifade ve 2 saat boyunca bir cam tabanlı, ızgara baz ile, 35 mm bir kap üzerinde yetiştirilen COS-7 hücreleri. Fotoğraflar önce ve amonyum hidroksit ile hücrelerin çıkarılmasından sonra gösterilmiştir. Izgara harfi kenarı noktalı bir çizgi ile faz-kontrast görüntüleri gösterilir. Beyaz oklar önce ve hücre çıkarılmasından sonra mevcut olan flüoresan puncta örnekleri göstermektedir. Ben dolaylı immünofloresan HDF ECM kollajen (B) tespiti. HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve amonyum hidroksit ile kaldırılır ve ECM ECM sadece FITC-konjuge anti-tavşan ikincil antikoru ile boyanmış insan fibriler kollajen I için lekeli edildi. Indirekt immunfloresan tarafından tespit edilen (C) RCS hücreleri etrafında veya izole RCS ECM içinde fibronektin lokalizasyonu. RCS hücreleri% 2 PFA sabit 48 saat boyunca büyütüldü ve fibronektin ve DAPI ile boyanmıştır. Paralel yemekler, hücreler, 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM fibr için lekelionectin ve DAPI ile. Hücreler, tek başına FITC ile konjüge edilmiş anti-fare IgG antikoru ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Fonksiyonel Çalışmaları Steril ECM kullanımı. RCS "matris üretici" hücreleri cam lameller üzerinde 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, steril koşullar altında, 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. COS-7, "test" hücreler% 0.5 Triton X100 geçirgen,% 2 PFA, sabit ya da 2 saat süre ile izole RCS ECM olmayan lamelleri kaplama ve çekirdek görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle lekeli . RCS ECM üzerine kaplanır COS-7 hücreleri daha geniş yayılan ve büyük mikrofilaman demetleri (örneğin ok) ve kenar tüyler oluşanles. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: SDS-PAGE, kütle spektrometresi, ve immünolojik işaretleme ile izole edilmiş ECM Proteinlerin Tanımlanması. (A), RCS hücreleri 7 gün için büyütülmüştür ve 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı; ECM, 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınmıştır. ECM hazırlanması indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Dört önemli bantlar (oklar 1-4) protein lekeleme ile teşhis edildi. RCS ECM bantlar 1-4 (B) Proteinler MALDI kütle spektrometrisi ile tanımlandı. (C), ya mRFPovTSP1C (trimeri) ya da MRFP-TSP-5-1C (pentamer), 48 saat için kültürlenmiştir ifade eden COS-7 hücreleriH ve 20 mM amonyum hidroksit ile ayrılmış ve ECM 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde izole edilmiştir. ECM, preparat bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve anti-RFP antikoru ile problanmıştır. Bu panel Bioscience Reports 17 özgün bir yayından değiştirilir. (D) HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, ya PBS içinde% 2 deoksikolik asit (hücre lisatı) ile ya da 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. ECM, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kazınmıştır. belirtildiği gibi, iki fraksiyon, bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 10 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve antikorlar ile problanmıştır. her panel, moleküler ağırlık belirteçleri konumları kDa cinsinden belirtilmiştir. Bu fi büyük halini görmek için buraya tıklayınızşekil.
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
yöntem ECM başarılı izolasyon ve analiz sağlamak için takip edilmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Örneğin, amonyum hidroksit hücreleri çıkarmak için ve analiz için ECM izole etmek için kullanılır. amonyum hidroksit, karanlıkta, sulu çözeltiler içinde kararlı olan ve oda sıcaklığında muhafaza edilebilir olsa da, şişe sıkıca her kullanım arasında yeniden sızdırmaz hale getirilmelidir. Gaz ve böylece konsantrasyonunu azaltarak, çözümden buharlaşması olabilir, çünkü biz güçlü bir taze şişeyi her 6-8 haftada başlayan öneririz. Buna ek olarak, çalışma çözeltisi, her bir deney için taze yapılmış olmalıdır. Hücrelerin tam de-iyonize su içinde bol yıkar ile kaldırıldığını da esastır. Bu adımlar yeterince yerine getirilmemesi halinde, hücresel materyal çanak kalır ve alt analizler kirletebilir. Hücreler 10 gün ya da daha uzun süre için yetiştirildiği takdirde, ilave su yıkama gerekli olabilir. Bu n önemlidirgörüntüleme sırasında ECM belirlerken dikkat gerekir, böylece izole ECM tabakası, tipik olarak hücrelere 11 ile karşılaştırıldığında çok ince ote. SDS-PAGE numune tampon maddesi izole edilmiş ECM etkin ekstre için, numune tamponu bir indirgeme ajanı içerir esastır. ECM en etkili kaldırılması için, kaynar örnek tamponu kullanılmalıdır. ECM örnekleri protein lekeleme veya proteomik için SDS-PAGE elektroforezi ile çözülecektir olan deneyler için, örnek tamponu, aynı kısım halinde ECM'nin birkaç tabak değerinde kazıyarak konsantre örneği elde etmek için kritiktir.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
ECM proteinlerinin üretimi ve salgılanması hücre tipleri arasında önemli ölçüde değişebilir, bu nedenle ECM sekresyon ve birikimi için zaman periyodu, her hücre türü için de novo belirlenmelidir. ECM kompozisyon ilişkisi t dinamik değişecek farkında olmak da önemlidirkültür 18 o hücre yoğunluğu ve süresi. Deney tasarlarken Bu faktör dikkate alınmalıdır. Toplam ECM proteininde bir miktar gerekebilir kütle spektrometresi ile analiz için ECM ekstre özellikle Açıkçası, bu yöntem için bir hücre tipinin seçimi önemlidir.
Tekniğin Sınırlamalar
ECM proteinlerinin çok düşük seviyelerde salgılayan hücreler bu yöntemle kullanım için daha zor olacaktır. Yapışkan olmayan hücreler, 3D hücre kültürleri veya hücre istilası tahlilleri bu yöntemle ECM izolasyonu için şu anda uygun değildir. yöntemi standart "2 boyutlu" hücre kültürleri ile kullanım için uygundur. amonyum hidroksit ekstraksiyon tamamen ECM hücrelerin üst tarafı ile ilişkili ve salgılanmış hücreleri ortadan kaldırır, fakat sınırlayıcı olmayan çapraz bağlı olduğundan, ECM proteinleri aynı zamanda aşağıdaki ve bazlar çevresinde tabak üzerine monte ECM ince bir tabaka bırakmak çıkarılır hücrelerin 11,17 arasında Sup. Malzeme, aynı zamanda serbest salgılanmadan önce ya da hücre yüzeyinden alımından sonra da hücre içi ECM proteinlerini içerdiği için, amonyum hidroksit ekstre serbest ne kadar ECM ölçmek için karmaşıktır.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
İzole ECM ile deneyler geniş bir yelpazede yürütebilme hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi bağlamında önemlidir ve aynı zamanda doku rejenerasyonu ve doku mühendisliği alanlarında etkileri vardır. yöntem, hücrelerin, doğal çapraz bağlama mekanizmaları ile kökenli hücre tipine uygun oranlarda mevcut tek tek ECM proteinleri ile, kendi ana boyutta karmaşık ECM yapıları monte bu saflaştırıldı kollajenler ya da saflaştırılmış ECM proteinleri oluşan jeller üzerinde avantajlara sahiptir. beklenen Örneğin, RCS ECM'nin proteomik çalışmada, bol matrilins COMP / TSP5 gösterdikıkırdak ECM 19,20 (Şekil 4). Genel olarak, hücre kaynaklı ECM analizi kovalent çapraz bağlanma ile sonuçlanan bir geniş, çok-protein ağı ve bir çok ECM proteinleri çözülemediği olma özelliği ile engellenmektedir ve ayrıca ECM potansiyel kirlenme hücre içi proteinleri ile ayıklar. Proteomik analizi için doku ECM fraksiyonunu izole etmek için tasarlanmış bir çok-aşamalı bir prosedür 21 tespit toplam protein grubu ECM proteinlerinin% 8 elde edildi. Ancak, ECM proteinleri gelen peptidler belirlenen toplam peptitlerin% 73 idi. hücresinden türetilmiş ECM izolasyonu ve analiz için bu yöntem, hızlı ve güvenilir bir şekilde ECM proteinlerini muhafaza ederken, hücresel maddeyi temizler. Bu yöntem, hücre tipleri ve alt bir uygulama aralığı için kullanılan ve hücre kültüründe ECM biyoloji ve hücre-ECM etkileşimlerin analizine kolaylaştırır. yöntem farklı ölçeklerde nasıl uygulanabileceğini Bizim protokoller detay exp geniş bir yelpazede ele almakECM organizasyon, dinamikleri, ya da kompozisyon ile ilgili erimental sorular ve hücreler izole ECM fonksiyonel etkileri.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Geleceğe bakıldığında, yöntem, 3D hücre kültürleri ile kullanım için adapte edilebilir; Bu fizyolojik alaka genişletmek olacaktır. Hücresizleştirilmiş yerel doku kayıp ya da hasar görmüş doku rejenerasyonu için ve kalp yetmezliği 22 sonra da transplantasyon alternatif olarak bir iskele olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Verici kullanılabilirliği ve immunorejection sorunlarının üstesinden gelmek için bir potansiyele sahiptir. Bu raporda açıklanan yöntemin gelecekte uygulamaları daha bu yaklaşımın kapsamını artıracak 3D hücre kültürleri veya doku Decellularization ile kullanımını araştırmak olabilir.
The authors declare that they have no competing financial interests.
Biz RCS ECM proteomik analizi yürütmek için, Dr. Belinda Willard, Proteomik ve Metabolomik Laboratuvarı, Lerner Araştırma Enstitüsü, Cleveland Clinic en müteşekkiriz. Biz JKA'li için, numara K018043 hibe, theMedical Araştırma Kurumu İngiltere'de mali destek için minnettarım.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır