Kaldırılması

Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.

Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronların nöronal morfolojilerinden mekanizmaları araştırmak için popüler bir modeldir. Da nöronlar böylece epidermal inerve ettikleri hücreleri ve immünofloresan hem nöronal ve epidermally ifade edilen proteinlerin in situ görselleştirme kendi analiz yararları ile iletişim gelişir. immünofloresan deneyleri için larva filetosu hazırlamak geleneksel yöntemler nöronal ve epidermal proteinleri görüntüleme için çeşitli zorluklar sunarak, vücut duvarının en kapsar kas dokusu bozulmamış bırakın. Burada Drosophila larva filetosu gelen kas dokusunu çıkarmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aksi takdirde kas dokusu tarafından gizlenmiş olan proteinlerin görüntüleme sağlayan sinyal gürültü oranını artırır ve da nöron gelişimini incelemek için süper çözünürlük mikroskobu kullanımını kolaylaştırır.

Drosophila larvalarının dendritik arborization (DA) nöronları dolayı genetik manipülasyona amenability ve görüntülenebilir kolaylığına nöronal gelişim çalışmak için değerli bir model sunmaktadır. Bu duyusal nöronlar dendrit morfolojilerinden ^1-3 kontrol sayısız yolların belirlenmesinde etkili olmuştur.

da nöronların dört sınıfları (sınıf I - IV) larva epidermis innerve. Bu nöronlar kendi dendritler büyük ölçüde iki boyutlu diziler ^4,5 oluşturan, bazal membran ve epidermis arasında yalan. Dört sınıfların, sınıf IV da nöronların diğer hayvanların duyusal nöronlar gibi en çok dallı milleri ve sahip, bu milleri detaylandırılması onların gelişiminde ^6-9 komşu dokulardan içsel faktörlerin yanı sıra kuyruklar, özellikle epidermis gerektirir .

Çalışmalar nasıl böyle nöronal ve ekstra nöronal gerçeği belirlemek içinors Immünofloresan in situ protein ifade algılamak için yeteneği dendrit morfolojilerinden fayda kontrol eder. Larva dış kütikül antikorlara aşılmaz, ama bu engel kolayca köklü diseksiyon yöntemlerinin ^10,11 ile larva filetosu hazırlanması ile aşılır. Ancak, bazal membran sadece iç yatıyor vücut duvarı kas dokusu da nöron ve epidermal hücrelerin görselleştirme yönelik çeşitli zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kas dokusu, vücut duvarının en çizgileri, büyük ölçüde nöronal veya epidermal dokudan kaynaklanan floresan sinyalleri örttüğü. Bu esas olarak örnek sinyal gürültü oranını azaltır. İkinci olarak, çok sayıda alakalı proteinler kas dokusu, hem de nöronlar veya epidermis eksprese edilebilir. Bu, kas kaynaklı floresans sinyali nöron veya epidermis bir floresans sinyalinin daha belirsiz algılama muhtemeldir. Son olarak, mikroskopi teknolojilerinde gelişmeleralt difraksiyon çözünürlükte numune B izin görüntüleme ve epidermal hücrelerin ^12,13 nöronlarda ifade edilen proteinleri lokalizasyonu ayırt ve çevresindeki özellikle yararlı olabilir. Ancak gürültü oranı ve lamel numune yakın güçlü bir sinyal süper çözünürlük mikroskopi faydaları aracılığıyla görüntüleme. sinyal gürültü oranını azaltmak için ek olarak, larva vücut duvarı kas mesafeleri böylece süper çözünürlük mikroskobu yöntemlerle elde edilebilir, geliştirilmiş görüntü çözünürlüğü sınırlayıcı lamel gelen da nöronlar. immünofloresan analizi için zorluklar yanında, kas dokusu larva vücut duvarı duyusal nöronlardan elektrofizyolojik kayıt için bir engel sunar. Onun kaldırma bu nedenle duyu nöronlarının ¹⁴ nörofizyolojik manipülasyon yararlanır.

Burada Drosophila larvalarının kas dokusunun elle çıkarılması için bir yönteme ilişkindir açıklanmaktadır. Bizim protokol p göstermektediraksi kas dokusu tarafından bulanıklaştırılmaktadır proteinlerin ermits immünofloresan görüntüleme, sınıf IV da nöronlar görselleştirilmesi için sinyal gürültü oranını iyileştirir ve daha da nöronlarda protein ve hücresel yapıların mekansal ilişkileri ayırmak için süper çözünürlük mikroskobu kullanılmasını sağlar ve epidermis.

Not: kas kaldırma (Şekil 1) için prosedür larva fileto hazırlanması için daha önce tarif edilen yöntemlerin bir modifikasyonudur. Önce ve kas kaldırılmasını takip adımlar kısaca özetlenen ve okuyucu daha detaylı açıklamalar için önceki çalışmaların ^{10, 11} anılır.

Soğuk tuzlu su içinde 1 Dissect Larva

1. Soğuk HL3.1 tuz ¹⁵ veya soğuk Ca ^{2 +} içermeyen HL3.1 tuzlu ¹¹ (Tablo 1) bir çalışma seyreltme hazırlayın. çanak alt kapak için yeterli, soğuk tuz ile bir silikon elastomer çanak larva yerleştirin.
   NOT: tuzlu seçimi ile ilgili Tartışma bakın.

Soğuk Tuzlu Tablo 1. Bileşimi.

2. ventral yüzü yukarı bakacak şekilde larva yerleştirin. larva ventral yüzeyi anteriordan posterior çalışan birincil larva trakea tüpler tarafından karın Dentical kemer ve sırt tarafında ile tespit edilebilir. ön-arka yönde larva gerin ve bir baş ve kuyruk pinböcek pimleri kullanarak çanak diseksiyon silikon elastomer. bir ucunda başlayan ve diğer doğru ilerlemektedir, ventral orta hat boyunca kesmek için ince diseksiyon makas kullanın.
   NOT: Bu yönelim da nöronların yaygın çalışılan dorsal küme korur.
3. Larva açık kesildikten sonra, bir kitap açma gibi diseksiyon çanak dört köşe pin. MSS, gut, ve trakea gibi iç organları kapmak ve çıkarmak için forseps kullanın. fileto gergin ama maksimum gerilir böylece böcek işaretçilerine ayarlayın.
   NOT: Kaslar segmental sınırları vücut duvarına bağlı kalır. kas gövde duvarının en kapak rağmen, sırt orta çizgisi yakınındaki dar bölgede mevcut değildir.

2. Kas Kaldırma

1. kas dokusu yoktur larva, dorsal orta hat bulun. Bu en düz olan oryantasyon kas dokusunun altında eklenir öyle ki tek bir forseps çatal yerleştirin.
2. Buradan başlayarakdorsal orta hat, segmentinde ön sınırına yakın, dikkatli forseps ve epidermis arasındaki teması en aza indirmek için özen kas ve epidermis arasında forseps çatal kaydırın.
3. bir çapa noktada vücut duvarına kas eki kırmak için yukarı forseps çekin. ilgi kalan hemi-segmenti (ler) için bu işlemi tekrarlayın.
   NOT: Bu protokol, her da nöron dendrit alanının arka korunması optimize eder. dendrit alanın ön kısmını korumak için, her segmentin arka ucundaki forseps çatalı eklemek için en iyisidir.
4. larva fileto maksimum her yöne gerilir şekilde böcek pimleri tekrar ayarlayın.
5. yine de, 25 dakika süreyle PBS içinde soğuk taze hazırlanmış% 4 formaldehit ile kesme çanak tutturulmuş iken fileto düzeltildi.
6. PBS 5 kez durulayın.
7. conta en aza indirmek için özen dikkatle kalan bağlantı noktalarından kas dokusu çekmeye için forseps kullanabilirepidermis ile ct.
8. Sabitlemesini ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne diseksiyon çanak fileto çıkarın. Daha önce ¹¹ açıklandığı gibi, sonraki tüm yıkama, engelleme ve immünofloresan boyama adımları uygulayın.

3. Dağı Larva Fileto

1. İlk mümkün olduğunca örnek olarak düz hale getirmek için ince diseksiyon makas kullanarak baş ve kuyruk çıkarın. Lamel bakan fileto iç yüzeyi ile antifade mountant bir lamel fileto monte edin.
2. lamel bir mikroskop lamı yerleştirin ve montaj orta dağıtmak için hafifçe bastırın. üzerinde bir mikroskop lamı çevirin ve tırnak cilası kullanarak slayt lamel mühür. Slaytlar, en az bir ay süreyle -20 ° C'de saklanabilir.

Birlikte zar işaretleyici ile etiketlenmiş sınıf IV da nöronlar ile Septat birleşme proteinleri Coracle (Cora) ve Diskleri-büyük (DLG) co-görselleştirmek için immünofloresan deneylerinde sinyal gürültü oranını artırmak için, kas kaldırma prosedürü yararını göstermektedir CD4 tdTomato.

Cora önce da nöron dendritler epidermal hücreler tarafından alınmış ve da nöronun morfogenezine ve fonksiyonu ile ilişkili olarak ele ^4,6-9,16 dendritlerindeki olan birçok tespit epidermal faktörlerden biridir olan yolları tespit etmek kullanılmaktadır. Anti-DsRed ile immün nöronlar (kırmızı) ve anti-Cora antikoru (yeşil) kas kaldırıldı (kas-off) ile larva filetosu yapıldı algılamak ve sağlam kas (kas-on) için. Her durum için, sınıf IV da nöron posterior dendrit alanı lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Görüntüler kimliği kullanılarak elde edilmiştirher iki durum için entical görüntüleme parametreleri. Biz ayrıca kas dokusu girişime telafi etmek için artan lazer gücünü kullanarak filetosu kas görüntülendi.

Kas-off örneklerinde, Cora açıkça sınıf IV da nöron dendritler boyunca kesintili kanallarda, epidermal hücre sınırları tespit ve sınıf IV da nöron soma (Şekil 2C) özetleyen olabilir. Buna karşılık, bu etki onun lokalizasyonu büyük ölçüde (Şekil 2A-2B) lazer güç arttı bile, kas-on örneklerde kapatmamasını. Kas-on numunelerin, Cora öncelikle kas, trakea görüntülenmiştir edildi ve kas kaldırma işleminin bir sonucu olarak vücut duvardan ayrılmış haline nöromüsküler bileşke (NMJ), en. Bu dokulardan kaynaklanan floresan sinyali hücre sınırlarını epidermal ve vücudun vel dar şerit haricinde, risaleler dendritine lokalize Cora en gizlenmişkas yoktur dorsal orta hat yakınında l. Sınıf IV da nöron soma özetliyor Cora kas-numunelerin (Şekil 2A-2B) görüntülendi değildi. Bu Dlg aynı zamanda yüksek kas dışavuran epidermally ifade edilen proteinlerin, görselleştirilmesi özellikle sorunludur. Kas ile ilgili örneklerde, epidermiste Dlg dağılımı neredeyse tamamen kas ve NMJ (Şekil 2D) ile ilgili floresan obscured. Kas çıkarıldıktan sonra, Dlg kolayca da nöron dendritler boyunca kesintili yolları olarak, epidermal hücre sınırları tespit ve sınıf IV da nöron soma (Şekil 2E) özetleyen bir. Böylece, kas kaldırma, aksi takdirde kas ve ilişkili dokular tarafından gizlenmiş epidermally ve nöronal ifade proteinlerin görselleştirme sağlar.

Buna ek olarak, bu sınıf IV da nöron işaretleyici floresans yoğunluğu azalır yazı gözlenmiştir filetolar kas-ile ilgiligörüntüleme parametreleri iki örnek hazırlıkları (Şekil 2A, 2C) arasında sabit tutulması sırasında kas-off filetosu ile karşılaştırıldığında. Artan lazer gücü sayesinde, sınıf IV da nöron işareti görünür floresan yoğunluğu kas-off örnekleri uyumlu olabilir ama arka plan gürültüsü (Şekil 2B, 2C) artmıştır. Bu nedenle, kas çıkarma eden örneklerde sinyal gürültü oranını iyileştirir.

Son olarak, biz kas dokusu kaldırarak kazanılan gelişmeler alt kırınım çözünürlükte sınıf IV da nöronların görüntüleme uygulanabilir olup olmadığını test ettik. Bunu yapmak için, 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) görüntüleme yaklaşık 120 nm yanal çözünürlük ¹³ ulaşır ki, gerçekleştirildi. konfokal görüntüleme gibi, biz ilk özdeş görüntüleme koşullarında ve daha sonra lazer gücünü optimize sonra, Cora ve sınıf IV da nöronlar için immunohistokimyasal kas ve kas-off filetosu, Fuar Görüntüleri karşılaştırıldığındakas-on örnekler için ure süresi ve görüntü işleme. Kas dışı dolgular (Şekil 3A-3C) ile karşılaştırıldığında benzer konfokal mikroskopi, kas ON gürültü oranı büyük ölçüde azaltılmış bir sinyal gözlenmedi. Ayrıca, görüntü oluşturma kas-off örneklerinde keskin çıktı. Kıyasla kas-ile ilgili örnekleri, daha az belirgin eserler gözlendi ve Cora dendrit yolları daha kolay (Şekil 3b, 3c) çözüldü. Dendrite membranlar, kas-off filetolarındaki genişliği yaklaşık 114 nm'de ölçülmüştür ancak kas-on filetosu (Şekil 3D, 3E) geniş 272 nm olduğu ortaya çıktı olabilir. Böylece, bizim protokol sınıf IV da nöronların görselleştirme süper çözünürlük mikroskopi uygulama sağlar.

Kas Sökme Prosedürü 1. Genel Bakış Şekil. Bir larva disseke ve bir silikon tutturulmuş olanelastomer çanak diseksiyon. kas dokusu kaldırmak için, bir forseps sivri uç, bir kademeli bir sınır (2.2) bulunduğu yerde dorsal orta hat başlayarak kas ve epidermal hücre katmanı arasına yerleştirilir. Forseps kas ve vücut duvarı (2.3) arasındaki bağlantı kırmak için yukarı doğru çekilir. Bu ilgi segmentleri için tekrar edilir ve daha sonra larva formaldehid (2.5) sabitlenmiştir. Tespit edildikten sonra, forseps vücut duvarı (2,7-2,8) kalan kas dokusu ayırmak için kullanılan larva manikür ve epidermis kırmızı, turuncu sınıf IV da yeşil nöronlar ve kas tasvir edilmektedir. (2.2) ve (2.7) 'de takmalar tek larva hemi-segment kesitsel görüşlerini temsil etmemektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Kas Kaldırma. (, AC yeşil) ya da Dlg (yeşil; DE) kas dokusu (A, B, D) ve kas dokusu (C, E) olmadan tespit edildi Konfokal da Nöronlar ve Cora Epidermis İmmünofloresan Görüntüleme geliştirir. Sınıf IV da nöronlar UAS CD4 ifade GAL4 ^'477 sürücü ile etiketlenmiştir: tdTomato ve bir anti-DsRed antikoru (kırmızı) ile tespit edilir. Cora etiketlenmiştir kas-ile ilgili ve kas-dışı örnekleri önce aynı şartlar (A, C) altında konfokal mikroskop ile görüntülendi ve daha sonra artan bir lazer gücü kas girişim (B) telafi etmek için. Dlg etiketlenmiştir kas-ile ilgili ve kas kapalı numuneler ayrı ayrı optimize koşullar altında görüntülendi. Tüm görüntüler konfokal Z-projeksiyonları vardır. Orta (yeşil) ve alt (kırmızı) paneller bireysel kanalları gösterir; üst paneller birleştirilmiş kanallardır. kas dokusunun sınır (kesik çizgiler), sınıf IVda nöron soma (camgöbeği oklar), Cora ve Dlg risaleler (beyaz oklar), epidermal hücre sınırları (eflatun oklar), NMJ (sarı oklar), ve trakea (turuncu oklar) gösterilir dendritine. Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Kas Kaldırma da Nöronlar ve Epidermal Hücreler. Kas bozulmamış (A, B) ve sonra kas kaldırma (C) sınıfı IV da nöronlar Cora (yeşil) immünofloresan tespiti Görüntüleme Süper çözünürlüğü sağlar. . Sınıf IV da nöronların Şekil 2'de olarak etiketlenmiş edildi Kas-ve kas-off numuneler ilk özdeş koşullar (A, C) altında yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile görüntülendi; kas örnek(A), daha sonra, kas girişim (B) telafi etmek için yüksek lazer gücü ve maruz kalma süreleri ile yeniden görüntülendi. Tüm görüntüler Z-projeksiyonları vardır. AC ortası (yeşil) ve alt (kırmızı) paneller bireysel kanalları gösterir. AC üst paneli birleştirme olduğunu. Epidermal hücre sınırları (eflatun oklar), Cora dendrit yolları (beyaz oklar), ve bir görüntü rekonstrüksiyon eser (sarı ok ucu) gösterilir. B ve C alt panellerdeki ilaveler, sırasıyla D ve E karşılık gelmektedir. Dendrit membran belirgin genişliği kas-on (D) ve kas-kapama (E) örnekleri gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 3 mikron (AC) ve 0,5 mikron (D, E). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İşte bir protokol Drosophila larva filetosu kas dokusunun elle çıkarılması için açıklanmıştır. Bu protokol daha önce larva diseksiyon teknikleri ^10,11 tarif değiştirir. Larva bir silikon elastomer çanak disseke sonra, dorsal orta hat yer almaktadır. Tek bir forseps uçlu olarak, en düz mümkün olan yönde, dikkatli bir şekilde dorsal orta hattın yakınlarındaki, kas dokusu ve epidermis arasına yerleştirilir. forseps yavaşça ilgi her larva segmentinde bir çapa noktasından ayrı kas dokusuna yukarı doğru çekilir. larva fileto sonra forseps kalan bağlantı noktalarından kas çekmeye tekrar kullanıldığı sonra soğuk formaldehit sabittir.

kas kaldırma işlemi sonrası tespitin tamamını gerçekleştirmek için cazip olsa da, biz gerilmiş kas, bir kez sabit render, düzleştirilmiş kalır ve yakından hatta bir çapa noktasından ayrıldıktan sonra epidermis apposed bulmakzor yatan doku zarar vermeden işlemek için. Ayrıca, bizim deneyim, sabit kas dokusu kırılgan ve vücut duvarı onun tümüyle kaldırılmasını engelleyen, kolayca gözyaşları. Buna karşılık, kas önce tespite bir çapa noktasından ayrıldığında, daha kolay forseps ile yakaladı ve larva vücut duvarı çekilebilecek doku taslakları bırakarak, fiksasyon sırasında kalan çapa noktasına doğru daralacak.

en güzel örneklerini korumak için, hatırı sayılır bakım kas kaldırma işlemi sırasında forseps ve epidermis arasındaki teması en aza indirmek için alınması gerekir. Bunun bir sonucu olarak, protokol daha önce tarif edilen diseksiyon teknikleri ^10,11 için birkaç dakika ekleyebilir. dokusu bozulmasını önlemek için, tespit öncesi parçalara olan larva sayısı geçen zaman en fazla 25 dakika olacak şekilde sınırlı olmalıdır. Ayrıca, forseps birden çiftleri denemenizi öneririz - Aynı mo forsepsdel şekil ve keskinlik önemli ölçüde değişebilir - ve kapsamını ayarlama hangi filetosu doku korunması ve diseksiyon hızını artırmak amacıyla önce kas kaldırılması gergin için.

Son olarak, biz larva diseksiyonu sırasında standart HL3.1 tuzlu karşı Ca2 ⁺ içermeyen HL3.1 tuzlu su kullanımı ile denemeler yapmanızı öneririz. kalsiyum yokluğunda, larva kas kasılmaları büyük ölçüde azaltılır. Böylece, larva filetosu ^{Ca2 +} içermeyen HL3.1 tuzlu disseke zaman manipüle etmek daha kolay olabilir. Bununla birlikte, kas kasılması, kas ve epidermis arasında boşluk oluşturur ve epidermis zarar görme riskini en aza indirerek bu durum bu dokular arasındaki forseps sokulmasını kolaylaştırmak fark etmiştir. Bunun bir sonucu olarak, standart HL3.1 epidermis ve da nöronlar bütünlüğünü korumak için tercih edilebilir. tuzlu ve seçim ya kullanıcıya bırakılmıştır ile Biz iyi sonuçlar elde ederiz.

Bizim protokol artarkenDaha önce açıklanan diseksiyon teknikleri ^10,11 süresi ve karmaşıklığı, bu larva duyusal nöronlar ve epidermal hücreleri görüntüleme için yararlıdır çeşitli iyileştirmeler sunuyor. İlk olarak, başka bir kas dokusu tarafından bulanıklaştırılmaktadır nöronal ve epidermally ifade edilen proteinlerin görüntüleme izin verir. İkinci olarak, gürültü oranı floresan sinyalini geliştirir. Son olarak, da nöron ve epidermis protein mekansal ilişkilerin üstün ayrımcılık süper çözünürlük mikroskobu kullanımını sağlar. Biz kas çıkarılmasını takiben gözlemlemek gelişmiş görüntüleme kalitesi olasılıkla örnek ve lamel arasında azaltılmış foton emilimi ve saçılma yanı sıra düşük mesafenin sonucudur. Burada ortaya olmasa da, kas kaldırma olasılığı da Immünofloresan kalitesinin artırılması, epidermis ve da nöronlara antikor iyileştirir. Daha antikor erişilebilirlik Absen yapılan imüno-protokolleri için özellikle faydalı olabilirmaddesi ⁴ permeabilizing bir doku ce.

Bu protokolün kullanılması ile elde edilen gelişmeler duyusal nöronlar dendrit morfolojilerinden düzenleyen nöronal ve epidermal faktörlerinin çalışmaları fayda görürler. Ayrıca, kas kaldırma önce larva vücut duvarı duyusal nöronların elektrofizyolojik çalışma kolaylaştırmıştır ve bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu larva duyu nöronlarının nörofizyolojik manipülasyon istihdam gelecek çalışmalar için yararlı olabilir. Son olarak, bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu gibi gen ifadesi profil için tek da nöronların izolasyonu gibi diğer uygulamalara yönelik yararlı olabilir.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz mikroskobu üzerinde yararlı tartışmalar için Gary Laevsky teşekkür ederiz. NIH tarafından finanse edildi Bu çalışma ERG R01GM061107 ve R01GM067758 verir