Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

mezenkimal geçiş (EMT) için epitel epitel mezenşimin içine transdifferentiating işlemi anlatılmaktadır. EMT da yaygın, glioblastoma en sık malign beyin tümörü meydana embriyonik gelişim sırasında temel bir süreçtir. EMT, aynı zamanda, göğüs kanseri, akciğer kanseri, kolon kanseri, mide kanseri de dahil olmak üzere beyin dışında çok karsinom gözlenmiştir. EMT merkezi göç, işgali ve metastaz oluşumunu teşvik ederek malignite bağlantılıdır. EMT indüksiyon mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değildir. Burada kortikal nöral kök hücre (NSC'lerde) ve daha sonra EMT indüksiyonu standart izolasyonu için in vitro bir sistem tarif eder. Bu sistem tek hücreler veya eksplant kültürü ya da kullanmak için esneklik sağlar. Bu sistemde, sıçan veya fare embriyonik ön beyin NSC'lerde, tanımlanmış bir ortam içinde kültürlenmiş ve serum enzimlerin yoksundur. NSC'lerde oligodendrositlerin gözlenen olig2 ve Sox10 iki transkripsiyon faktörleri olarak ifadeYTE ön-madde hücreleri (OPC). Bu sistemi kullanarak, FGF-, BMP- arasındaki etkileşimler Zeb1, Zeb2 içeren TGFβ-sinyal ve Twist2 TGFβ etkinleştirme önemli ölçüde sinerjistik BMP- / TGFβ-etkileşim olduğunu, hücre göçü geliştirilmiş burada gözlenmiştir. Sonuçlar EMT indüksiyonu ve bakım dahil olmak FGF-, BMP- ve TGFβ-sinyal ağı işaret eder. Bu model sistemi, in vitro EMT araştırmak için uygundur. Bu düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik göstermektedir. Ayrıca, göç yanıtlara göre (kantitatif mesafe ölçümü) ve inhibe etmek veya EMT (kalitatif ölçümü) geliştirmek için bileşikler yüksek verimli tarama ile farklı bileşiklerin karşılaştırılmasına imkan verir. modeli bu nedenle de EMT etkileyen maddeler için ilaç kütüphaneleri test etmek için uygundur.

Embriyonik gelişme birkaç aşamalarında, epitel hücreleri birbirine (örneğin, sıkı kavşaklar) için güçlü bağlılığı kaybeder ve mezenkimal geçiş (EMT) ¹ bir süreç olarak adlandırılan epitel bir göçmen fenotip kazanır. EMT gibi mezenkimal nöral tepe hücreleri gibi ek hücre tiplerinin oluşumu neuroepithelium ² ayıran bir popülasyon için gereklidir. EMT evrelerinde sadece gerekli değil, aynı zamanda lezyonlar ⁴ demiyelinizan böyle yara iyileşmesi ³ ve merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon olarak yetişkin organizmada fizyolojik süreçleri, korumak için yetişkin hayatının ileriki aşamalarında gerekli değildir.

Epitelyal tümörler sonuçta kanser oluşumunu ^1,3 giden, göç, istila ve metastaz için bir başlangıç ​​adımı olarak EMT yeniden bilinmektedir. EMT gerçekten merkezi güçlü göç ^1,3 bağlantılıdır. c hücresel adımlarıonditioning, başlatılması geçiren ve EMT sürdürmek tam olarak anlaşılamamıştır ve daha fazla araştırma ihtiyaç değildir.

Burada tanımlanan büyüme faktörleri ve ortam (hiç serum ve enzim) kullanılmasına NSC'lerde göre standart bir in vitro EMT model sistem sunulmuştur. Bu model sistem EMT üzerinde çalışan bilim adamları için öneme sahiptir. Salyangoz, Zeb ve büküm protein aileleri Geliştirme ve hastalık ¹ EMT için kritik olduğu gösterilmiştir. Salyangoz, Zeb ve Büküm aileler de sunulan sistemde yer almaktadır. Sistem normal EMT EMT indüksiyon sırasında ilk olayların incelenmesi için özel bir avantaj sağlayarak uğramayan önbeyin belirli bir bölgeye dayanmaktadır.

Bu Salyangoz, Zeb ve büküm proteinleri gibi önemli EMT indükleyiciler, aynı zamanda merkezi sinir sistemi dışındaki doku sistemleri EMT sırasında bulunan yana model sistem, potansiyel olarak, merkezi sinir sistemi dışındaki epitelde EMT çalışma uygulanabilir. Bu model sistem, özellikle, kök hücre, genel olarak özellikleri ve EMT çalışma gelişmekte korteksten NSC'lerde standart izolasyon sağlar. Bu sistemi kullanarak, biz, NSC'lerde izole kaynaklı EMT ve FGF2'deki ve BMP4 etkisindeki sonraki göç okudu. Biz FGF- ve böylece model sistem doğrulayarak, hücre göçü teşvik etmek TGFβ-sinyal ile etkileşime BMP-sinyalizasyon görülmektedir.

Tüm hayvan prosedürleri 'Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu' (NIH yayın, 8 ^th edition, 2011) izledi ve Basel Hayvan Refahı Komitesi (Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için İsviçre Kuralları) tarafından onaylanmıştır. bu kurallara hayvan protokolü "düşük hayvan şiddeti notu" olarak kabul edilir.

Genişletme maddesi hazırlanması 1.

Not: Doku kültürü için standart olarak aseptik koşullarda çalışmak.

1. İki adet 15 ml tüpler alın ve 5 L-glutamin içermeyen DMEM / F12 ilave edin (1: 1) 500 ml'lik ortam şişe içine iki adet 15 ml tüpler her biri. İlk 15 ml tüp, 50 mg, insan apo-transferrin, putreskin 1 M stok (0.1 mM son konsantrasyon) ve 50 ul sodyum selenyum 500 uM hazır (nihai konsantrasyon 30 nM) 30 ul ekle.
   1. Orijinal DMEM / F12 şişeye 0.2 um'lik bir şırınga filtre ile filtrelenir.
2. İkinci 15 ml tüp, 12.5 mg insülin ekleyin. Eklemek6-1 M NaOH 9 damla. Vortex tamamen insülin çözmek için. Orijinal DMEM / F12 şişeye 0.2 um'lik bir şırınga filtre ile filtrelenir.
   Not: NaOH toksik ve korozif değildir. Koruyucu eldiven, ceket ve koruyucu gözlük kullanın.
3. DMEM / F12 ortamı şişeye, 5 ml penisilin (10,000 birim / mL) / streptomisin (10.000 mg / ml) / amfoterisin B (25 ug / ml) eklenir.
4. glutamin içeren 5 taze çözülmüş, 200 mM L-glutamin için stoklar ml veya oligopeptitler ekleyin (200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptit) DMEM / F12 ortamı şişeye.
5. İyi çalkala. 50 ml lik kısımlar halinde hazırlayın.
   Not: genleşme maddesi, 4 ° C de en az 2 hafta boyunca depolanabilir. Numunesi borular 500 ml'lik şişelerde muhafaza ortamına kıyasla daha az, pH değişiklikleri gösterir.

Pasajlanması Orta 2. Hazırlık

1. Ve Mg ^{2 +} içermeyen HBSS ortam, 990,85 mg glikoz (5 mM nihai konsantrasyon) ve 840,10 mg ekleme NaHCO ^{_3-2 +} 1 L Ca (10 mM son konsantrasyon). HCI (1 M stok) ile 7.3 pH ayarlayın. Filtre 0.2 mikron filtre ile sterilize ve 50 ml alikotları olun.
   Not: Pasajlanması ortamı, 4 ° C'de en az 4 hafta süreyle saklanabilir.

Büyüme Faktörleri 3. hazırlanması

1. % 1 BSA (PBS-BSA), tek başına ya da 4 mM (PBS-BSA-HCI) hidroklorik asit (HCI) olan steril 1 x PBS hazırlayın.
   Dikkat: HCl korozif ve zehirli ve özel güvenlik önlemleri (mont, gözlük, eldiven, davlumbaz) gerektirir.
2. Çözündürülür 10 ug / ml rekombinant insan Fibroblast Büyüme Faktörü 2 PBS-BSA içinde (rhFGF2) (10 ng / ml nihai konsantrasyon), 10 ug / ml yeniden birleştirici insan kemik morfogenetik protein 4 PBS-BSA içinde (rhBMP4) (nihai 10 ng / ml PBS-BSA-HCl 1 (rhTGFβ1 p olan konsantrasyon) ve 20 ug / ml rekombinant insan transforme edici büyüme faktörü) (40 ng / ml son konsantrasyon).
   1. sterilize filtre yok. alikotları hazırlayın.
      Not: büyüme faktörü tam bölünen miktarları saklanabilir-20 ° C sıcaklıkta en az 2 yıldır.

Hücre Kültürü Yemekleri 4. Kaplama

1. Bir 250X PLO stok hazırlamak için 1.875 mg poli-L-ornitin, 500 ml (PLO) damıtılmış _H2O içinde çözülür. Filtre 0.2 um'lik bir şırınga filtresi kullanılarak sterilize ve 2 mL'lik olun.
   Not: Bu tam bölünen miktarları, en az 2 yıl, -20 ° C'de saklanabilir.
2. 1,000x fibronektin stok hazırlamak için, 1 ml steril damıtılmış _H2O 1 mg büyükbaş hayvan fibronektin çözülür. Bu yapışkan proteini pıhtısı olabilir girdap yok. 10 dakika süre ile hafif bir şekilde elle çalkalanır.
   1. Ara sıra çalkalanarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. tam kapatılması için kontrol edin. fibronektin tamamen erimesi için en az 37 ° C bir çözüm ısıtın. Do not filtre-sterilize edin.
      Not: Çözelti 6 aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
3. için gerekli olan plazma ön tedavi plastik hücre kültürü yemekleri (100 mm veya diğer boyutları kullanındeney). göçü değerlendirmek için, 500 mikron ızgara ile 35 mm yemekleri kullanın. % 5 _CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 12 saat boyunca 2 mi 1 x FKÖ'yle gece boyunca yemekler inkübe edin. PBS 1X 2 ml ile iki kez yıkanır.
4. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 12 saat en az yemekler 2 mi 1 x fibronektin (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ilave edin ve inkübe edilir. sadece hücreleri kaplama önce fibronektin çıkarın.
   Not: fibronektin kaplı tabaklar, 37 ° C de en az 2 hafta boyunca depolanabilir.

5. Standart Diseksiyon ve Kortikal subventricular bölgesi Hazırlanması (SVZ)

1. Sıçan embriyonik gün 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) ve fare E 13.5 (C57BL / 6) zamanlanmış-çiftleşme embriyolar elde edin. 08:00 ertesi sabah 18:00 hayvanların çiftleşme. çiftleşme gün sonra öğlen E0.5 olarak kabul edilir.
2. % 5 İsofluranın ve 0.8 L / dk oksijen akışı ile hamile hayvan anestezisi. Keskin diss ile pençe sıkıştırma ile tepki kontrolection forseps. hayvan başını kesmek. CO ₂ hücre kurtarma kök etkilediği CO ₂ boğulma kaçının.
3. sezaryen ile embriyolar al.
   1. yatar pozisyonda hayvan koyun ve% 70 etanol ile kürk dezenfekte edin. rahim yukarıda alt karın bölgesinde yaklaşık 8 cm V-şekilli cilt kesi yapmak için cerrahi forseps ve makas kullanın. sağlam kas duvarları tutarken kürk sadece cildi İnsizyon.
   2. Periton girmek için kasları ve karın kas duvarı kesilirken taze forseps ve makas kullanın.
   3. alt arka periton rahim belirleyin. çevre dokulardan keskin ayrılması ile rahim kaldırmak.
   4. buz gibi soğuk 1x PBS içinde steril 1x PBS ile embriyolar ve yer ile rahim yıkayın.
   5. (3X büyütme, Şekil 1B) bir diseksiyon mikroskobu altında embriyo embriyo serbest bırakmak için rahim duvarları açmak için ince uçlu makas kullanın. (Embriyonik tekneleri kaldırmak için forseps bir çift kullanın Şekil 1 B). Buz üzerinde genişletme ortam içinde embriyolar tutun.
   6. Gelişmekte Rat Sinir Sistemi ⁵ Atlas doğru gelişim aşamasını doğrulayın. Doğru embriyo boyutu Şekil 1B 'de gösterilmiştir.
   7. Şekil 1A gösterildiği gibi sıçan ön ayakları (FL) basamaklı oluşumunu başlayan varlığıyla daha da doğru yaş edin.
      Not: arka bacak (HL) henüz haneli ayrımı (Şekil 1B) göstermez.
4. Diseksiyon için, buz soğukluğunda 1 x PBS ile doldurulmuş kaplanmamış Petri tabaklarına embriyo aktarımı. otoklavlanmış ince forseps kullanarak (20X büyütme 3X) stereo diseksiyon mikroskobu altında diseksiyon.
   Not: Petri kapları plazma kaplı hücre kültür yemekleri ile olabilir gibi çanak yüzeye doku eki önler. Bilenmiş tungsten tel iğneler veya benzeri de diseksiyon bazı adımlar için faydalıdır.
5. inte başlayan baş deri ve kafatası kaldırGelişmekte olan nöral tüp (Şekil 1C) erişmek için anterior ve posterior iki forseps ile eş zamanlı çekerek gelişmekte olan telencephalon (TEL) ve diensefalon (DI) (Şekil 1B) rsection.
6. Rhombencephalon gelen mesencephalon (MES) ayıran orta beyin-Beyin-sınır (MHB, Şekil 1B-D siyah ok başını) belirleyin. Sadece veya MHB (Şekil 1D, üçgen ok) altına rhombencephalon kesin.
   Not: MHB ek derialtı alan nöral tüp zarar vermeden deri çıkarılmasını kolaylaştırır.
7. Yüz iskeleti (Şekil 1E) ile kafatası tabanındaki telencephalon / diensefalon arasındaki bağlantıyı Sever. Bu telencephalon, diensefalon ve mezensefalon (TEL-di-MES) (Şekil 1F-H) ihtiva eden bir blok içinde sonuçlanır.
8. buz üzerinde genişleme ortama TEL-DI-MES bloğu aktarın. o kompletti tutunely kaplanmamış Petri kabındaki genişleme ortamında kaplı. NSC'lerde ile kortikal SVZ içeren telencephalon dokunmamak için forseps bir çift ile mezensefalona de blok tutun.
9. Tekrarlayın 5.5 bütün embriyolar (Şekil 1F-H) ile 5.8 arasındaki adımları.
10. Bir transfer TEL-di-MES buzla soğutulmuş 1 x PBS içinde bloke eder. Şekil 1i 'de gösterildiği gibi, diensefalon gelen mesencephalon ayrılması, ön mezensefalon (Şekil 1F-H)' de kesikli bir hat boyunca kesilmiş.
11. Şekil 1F kesikli çizgiler boyunca keserek TEL DI ayırın. Şekil 1J izole telencephalon bakın.
12. Şekil 1J noktalı çizgi boyunca kesme iki telencephalic hemisfer bölün. Şekil 1K gösterildiği gibi bu iki ayrı yarımkürede sonuçlanır.
    Not: sol hemisfer Şekil 1L büyütülür.
13. medial çete tespitlionic eminences (MGE, Şekil 2A, *) ve lateral ganglion eminences (LGE, Şekil 2A +) gelecek Foramen interventriculare ile görünür.
    1. Forseps veya iğne kullanarak, MGE ve LGE ve anterior korteks (karınca-ctx, Şekil 2B) arasındaki kesişme noktasında düz bir çizgi boyunca teşrih. korteks, hipokamp (HIP) ve koroid pleksus (SP) ile düz bir çizgi kesin. Bu (GE 2B, C Rakamlar) ganglion eminences gelen koku ampul (ob) da dahil olmak üzere ön korteks ayırır.
14. Yine korteks, hipokampus ve koroid pleksus ile kesme, kaudal ganglion eminens (CGE, Şekil 2C, D) ve posterior korteks (Şekil 2C) kesişiminde ikinci bir düz çizgi kesti.
15. telencephalon düzleşmek. Tamamen arka kutup ve koku ampulü (Şekil 2B) çıkarın. belirlemekDaha önce ^6,7 tanımlandığı gibi hipokampus ve koroid pleksus (Şekil 2C) içeren kortikal hem.
    Not: hipokampus korteks daha ince neuroepithelium vardır. CP kırmızı damarları içerir.
    1. Ganglion eminences (Şekil 2D) ölçülerine denk korteks büyüklüğü bırakarak korteksten kortikal etek ayırın. Bu korteks (hedef doku) ve ganglion eminences (GE, Şekil 2D) bir blok ile sonuçlanır.
16. çanak yüzeye ventriküler (iç) yüzü korteks-GE bloğu çevirin.
    Not: yarımkürenin dış yüzeyi deneyci (Şekil 2E) karşı karşıya gelecek. Dış yüzeyinde kan damarı içeren zarları (Şekil 2E) bulunmaktadır.
    1. Sol el ile çanak yüzeye GE'yi Pin ve (sağ (dominant) el forseps bir çift Şekil 2F meninksler soyulabilir ).
       Not: Meninksler kuvvetle korteks uygun, çünkü bu teknik olarak en zor adımdır. korteksten menenjlerin ayırma aşamaları 5.13.1 ve 5.14 yılında tamamen düz çizgi (pürüzlü değil) keserek kolaylaştırılır.
17. Dier yarımkürede ve tüm embriyolar için 5.16 ile 5.12 arasındaki adımları. LGE (Şekil 2G, 2H) yarı ana çapı olan bir mesafe LGE boyunca korteks kesin. Disseke korteks 1,2 mm x 2,4 mm (Şekil 2H) bir alana yayılmıştır ve NSC'lerde ile SVZ / germinal katmanı içerir.

Eksplant kültürleri 6. hazırlanması

1. Az 400 mikron çaplı (Şekil 2I) ve eksplant içine korteksi kesin. Referans (Şekil 2H ve 2I) için diseksiyon Petri kabı altına yerleştirilmiş 400 mikron ızgara (Ek Şekil 1) kullanın. buz işbirliği ile yeni bir Petri kabı içine tüm eksplantlar aktarınLD genişletme aracı.
2. Bir doku kültürü çanak (adım 4.4) den fibronektin çıkarın. o kurumaya bırakın. X 10 mm 10 mm (Şekil 3) Kafes 35 mm çanak merkezi soğuk genişletme ortamın 1 ml ilave edilir. Orta küresel bir damla (Şekil 3) oluşturmak için izin verir.
3. damla merkezine 8 eksplantlar kadar yerleştirin. Eksplantlar ideal göç analizi için aralarında en az 3 mm mesafe ile ızgara üzerinde yer almalıdır (bkz: Bölüm 8).
4. Eksplant bağlanması için bir hücre kültürü inkübatöründe yaklaşık 1 saat (37 ° C,% 21 _O2,% 5 _CO2) çanak inkübe edin. Eksplantlar yerleşmek ve fibronektin kaplı bir yüzeye eklemek için izin verir. Eksplantlar ayırmak ve optimal ızgara merkezi dışında hareket edebilir çünkü, çanak sallamayın.
5. 1 saat inkübe edildikten sonra (37 ° C,% 21 _O2,% 5 _CO2), 2 mi genişletme ortamının toplam hacmi artı büyüme f çanak doldurmakaktörler veya ilgi maddeler test etmek ve inkübe.
   Not: ne enzimatik sindirme veya serum veya santrifüj eksplant hazırlanması için gereklidir. Bu hücre bütünlüğü için en uygunudur.

MGK Tek Hücre Kültürü 7. Hazırlık

1. 37 ° C'de genişleme ve pasaj orta Isınma.
2. Soğuk genişletme maddesi (tüp A) 15 ml'lik bir tüp içine (adım 5.17 arasında) ayrılmış korteks parçaları aktarın. g x 1200 5 dakika boyunca korteks parçaları santrifüj. süpernatant aspire. korteks parçaları tekrar süspansiyon 200 ul önceden ısıtılmış genleşme maddesi ekleyin.
3. Bir P1,000 ucu (tüp A) 15 ml'lik bir tüpe önceden ısıtılmış pasajlama ortamında 700 ul ekle. Yavaşça pelletini. 15 ml tüp altındaki ucu yerleştirin. Yavaşça ve yavaş yavaş P1,000 ucu ile üç kez aspirasyon doku parçaları ayırmak.
   Not: orta Pasajlanması hücre ayrımı teşvik ve enzimlerin kullanımını önlemek için gereklidir.
4. Tüp dibinde yerleşmek için daha büyük (ağır) ayrışmamış parçalar için 30 ila 60 saniye boyunca oturmak için izin verin. Tek Çözülen hücreler süpernatan içinde kalır. Taze 15 ml tüp (tüp B) süpernatant yaklaşık 700 ul aktarın.
5. Tekrarlayın 7.3 ve 7.4 büyük parçaları ayırmak için yineleyin.
6. Tekrarlayın 7.3 ve 7.4 büyük parçaları ayırmak için ikinci kez yineleyin. Taze 15 ml tüp (tüp B) tüm süpernatant aktarın.
7. 5 ml'lik bir toplam hacme genleşme maddesi ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. tripan mavi boyama ile ölü hücreleri değerlendirin.
   Not: Küçük NSC'lerde büyük hücrelerden daha iyi 7.2 7.6 adımları tolere. 10 embriyolardan% 10 ölü hücreleri ile yaklaşık 4 x 10 ⁶ hücre bekliyoruz.
8. NSC'lerde genişletilmesi için, 8 ml genişletme aracının bir hacim içinde, 10 cm fibronektin kaplı doku kültür kabı başına 1.5 x 10 ⁶ hücre plaka. Standart genişleme, 1,000x rhFGF2 stokunun 8 ul ekleyin. Her gün rhFGF2 ul 8 ekleyin ve beni değiştirmeyeHer gün dia.
   Not: Bu gelişme aşamasında korteks NSC'lerde bir çoğunluğu ve farklılaşmış hücrelerin sadece bir azınlık içerir. farklılaşmış azınlık hücreleri rhFGF2-tedaviye cevap ve genişletme kültürü sırasında ölme.
9. Passage% 60 izdiham NSCs genişletti.
   1. geçit NSC'lerde için genişleme orta çıkarın. hızla yıkayın hücreleri 5 ml pasajlama ortamı ile üç kez. 4 dakika - 2 bekleyin. Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +} hücrelerinin olmadan yavaş yavaş yuvarlama, yüzeyden ayırmak. Faz mikroskop altında hücrelerin dekolmanı doğrulayın. Gerekirse yüzeyden görsel dekolmanı görülünceye kadar, bir kaç dakika bekleyin.
      Tek hücreler tamamen ayırmak, ancak çoğu hücreleri hala çanak yüzeye bağlı kalacaktır: Not. ayrılması için gereken süre fibronektin kaplamanın süresine bağlıdır. Kısa bir fibronektin kaplama (12 saat veya daha az) daha hızlı hücre dekolmanı sonuçlanır. uzun deneyleri için (>; 1 hafta) fazla 24 saat içinde fibronektin kaplama tavsiye edilir.
10. yavaşça yüzeyden hücreleri ayırmak için bir 10 ml pipet kullanın. hücreleri ile 5 ml pasajlama orta toplayın ve taze bir 15 ml tüp aktarın. pasajlama ortamının ek 5 ml ile tekrarla.
11. borunun alt kısmında 10 mi pipet yerleştirilmesi, pipetleme üç kez aşağı 15 ml tüp içinde hücreleri ayırmak. Oda sıcaklığında 1.200 x g'de 15 dakika süre ile boru dönerler. Süpernatantı ve 2 ml genişletme ortamda pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Ölü hücrelerin değerlendirilmesi için tripan mavisi kullanarak.
    Not:% 60 izdiham genişleme sonra, 4 bekliyoruz - yaklaşık% 10 bir ölü hücre sayımı ile 5 x 10 ⁶ hücre.
12. Plaka daha ileri pasajlar için 10 cm'lik tabağı başına 8 x 10 ⁵ hücre.

8. Göç Değerlendirme

1. göç değerlendirilmesi için, eksplantlar Bölüm 5. Tohum göre eksplantlar izole35 mm ızgara yemekleri. Bir saat sonra kaplama, FGF2 (rhFGF2) ekleyin. 2 gün boyunca 37 ° C inkübatör yemekler yerleştirin.
   Not: Optimal eksplant eki için, bulaşıkları hareketli kaçının.
2. 1.000 ul ucu ile orta çıkarın. 1.000 ul ucu iç çemberin başlayan (Şekil 3) Genişletme orta 2 ml ekleyin. Bu eksplant yüzey gerilimini azaltır.
3. Deney için gerekli tek başına ya da kombinasyon halinde büyüme faktörleri ekleyin. FGF2 / BMP4 / TGFβ1 pozitif kontrolünü kullanın. Not: Bu deneyde, 35 mm tabak başına 2 ul FGF2, 2 ul BMP4 ve 4 ul TGFβ1 tek başına ve kombinasyon (Şekil 5) ilave edildi.
   1. ek faktörler ve / veya test edilebilir maddeleri ekleyin. 37 ° C'de 2 gün daha bakir yemekler tutun.
4. ters bir mikroskopta eksplant fotoğrafını çekmek.
   Not: Living eksplantlar sabit hücrelerin daha iyi faz kontrast görüntüler verir. De olabilir.
5. göçdeğerlendirme, piksel ölçümler sağlayan bir grafik yazılımı (örneğin, Fiji ⁸⁾ kullanın.
6. piksel 500 mikron mesafe çanak ızgara ölçün ve iç referans olarak kullanabilirsiniz.
7. göç başlangıç ​​noktası olarak eksplant merkezini tanımlayın. eksplant merkezi ve 10 hücre dış grubun arasındaki mesafeyi ölçün.
   Not: Tüm hücreler santrifüj uzak eksplant göç. Kendiliğinden test durumlarda (Şekil 5) altında çevresinde bir tabaka oluşturur.

9. Invasion Değerlendirme

1. Protokol Bölüm 4'e göre fibronektin kaplı doku kültürü, 24 oyuklu plakalar hazırlamak.
2. Hücre işgali odalarının üst kuyuya sıcak genişleme orta 300 ul yerleştirin. 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 _CO2 için bir oda inkübe edin.
3. En kuyudan genişletme Ortamı çıkarın ve kaplı 24 oyuklu bir plakaya Boyden haznesi yerleştirin.
4. 50 eklede alt 0.5 rhFGF2 ul ve 0.5 ul rhBMP4 sıcak genişletme ortamı 0 ul.
5. Geçiş NSC'lerde ve 1 ila 4, Bölüm 7. Passages tarif edildiği gibi sayısı uygundur.
6. Plaka rhFGF2 0.3 ul ve Boyden odasının üst kuyuda rhBMP4 0.3 ul sıcak genişletme ortamının 300 ul bir hacim içinde 5 x 10 ⁵ hücre.
7. Kültür 24 saat boyunca tohumlanmış NSC'lerde.
8. Başka bir 48 saat odasına ve kültür hücreleri ek faktörler ve / veya test edilebilir maddeleri ekleyin.
   Not: Hücreler invaziv varsa, bunlar iyi dibine bazal membran katmanı sayesinde de üstten geçecek. Invaziv hücreler Boyden odasının alt yapışır.
9. Üretici tarafından sağlanan protokol takip edin. İki kez temizleyerek üst kuyuda non-invazif hücreleri çıkarmak için (işgali tahlil kiti dahil) pamuklu çubuklarla kullanın.
10. Kuyulardan orta çıkarın ve 500 ul genişleme orta ekleyincanlı hücrelerin ve kuyulara nükleer boya DAPI ile bir plazma zarı leke.
11. 37 ° C'de 10 dakika% 5 _CO2 inkübe edin.
    Not: boyalar optimum görselleştirme ^8, sırasıyla membran ve invaziv hücrelerin çekirdeğine entegre olacak. Seçenek: çok renkli immünsitokimya planlanan eğer plazma zarı boya atlayın.
12. boyalarla Ortamı çıkarın ve genişletme ortamı ile iki kez yıkanır. Görselleştirmek ve daha önce ⁸ gösterildiği gibi ters bir floresan mikroskop ile invaziv hücreleri saymak.
    Not: Bazı invaziv hücreler odasının altından müstakil olabilir ve onlar kaplı yüzeye sopa yerin altındaki kuyu yüzeyine düştü. tam bir analiz için de yüzeyinde hücreleri içerir.
13. Ortamı çıkarın ve 10 dakika boyunca buz soğukluğunda, taze% 4 PFA hücrelerin tespit. 1x PBS ile yıkayın 3x. Daha önce ^8-10 açıklandığı gibi, invaziv hücreler üzerinde immünsitokimya gerçekleştirin.

Bu EMT model sistem olarak tek hücre ya da gelişmekte olan sinir tüpün belirli bir bölgeden eksplant olarak iki NSC'lerde standart izolasyonuna dayanmaktadır, merkezi korteks (Şekiller 1 ve 2). Nicel değerlendirmesi için, eksplantlar 500 mikron ızgara kültürü çanak (Şekil 3) merkezinde hakkı ekildi. Merkezi korteksten eksplantlar ilk büyüme faktörleri (Tablo 1) farklı kombinasyonları ilave iki gün sonra iki gün FGF2'nin maruz bırakılmıştır. Biz gelişmekte olan nöral tüp diğer bölgelere göre daha büyük olan korteks ile başladı. Biz BMP4 içinde kültüre tek eksplantlar bir göçmen tepkisi (Tablo 1 ve Ek Şekil 2) gösterdiği görülmektedir.

Sonraki podoplanin (PDPN) ifade tanımlanmış koşullar altında analiz edildi. PDPN bir transmembran skanserlere ^11,12 ve NSC'lerde, ⁸ in işgali ile ilişkilendirilmiştir ialomucin benzeri protein. PDPN ifade eden hücrelerin oranı yüksek gliomlar ¹³ artar. PDPN gliyoblastoma hastalarda ¹⁴ daha düşük bir hayatta kalma ile ilişkilidir. Bundan başka, PDPN göğüs, akciğer, kolon karsinomları ^15,16 dahil olmak üzere birçok tümör habis ilerlemesi bir göstergesi olduğu gösterilmiştir. PDPN invaziv olarak göç NSC'lerde ⁸ hem de ifade edilir. Yukarıdaki protokol kullanılarak, PDPN sentezleme kontrol ile kıyaslandı, FGF2 sadece TGFβ1 tek başına BMP4 veya kombinasyon halinde ortaya eksplantlarında. PDPN ifade bütün BMP4 ve TGFβ1 / BMP4 tedavi edilen eksplantlar saptandı. Bunun aksine, herhangi bir PDPN tek FGF2'deki ya da tek başına TGFβ1 (Tablo 2 ve Şekil 4) ile birlikte eksplantlar kontrol eksplantlar gözlendi. Buna ek olarak, bir göç fenotip hücrelerinin BMP4 ve TGFβ1 / BMP4- indüklendimaruz bırakılan eksplantların kontrol eksplantlar (sadece FGF2) ve TGFβ1 ise tek başına göç hücreleri (Tablo 1) göstermemiştir. göçmen hücrelerin gözlem, düşük maliyetli, düz ileri niteliksel değerlendirme sağlar.

Dahası, biz BMP4 (Tablo 2) gelişmekte olan nöral tüp çeşitli bölgelerinde göç tepkisi ve EMT indüksiyon test etti. Şekil 1 'de gösterildiği gibi 400 mikron eksplantlar, merkezi korteks posterior korteksinin (etiketli arka kutup), MGE ve mezensefalon hazırlandı. Eksplantlar Tüm BMP4 ile FGF2'nin iki gün, iki gün FGF2'nin maruz izlenmiştir . Göç, bir ön ve arka kenarı (Şekil 5 ve Yardımcı Şekil 2), düz göç hücrelerin görülmesi ile tanımlandı. Arka korteksinden göç hücrelerin güçlü bir indüksiyonu ve MGE ve MES bir ara yanıtıencephalon (Tablo 2) gözlenmiştir. merkezi korteksin 146 eksplant 145 FGF2 / BMP4 bir göçmen tepki gösterdi. Böylece, merkezi korteks, test edilen bütün eksplantlar (Tablo 2) göç hücrelerin en güçlü indüksiyonunu göstermiştir. BMP4 verilmemesi bir göç karşılığı bütünüyle ortadan kaldırmıştır (Tablo 1 ve 2 ve veriler gösterilmemiştir).

büyüme faktörü potens niceliksel değerlendirilmesi için, taşıma mesafesi çok büyüme faktörleri kültürlenen eksplantların ölçülmüştür. Eksplantlar faktörler (kontrol) ya da tek veya kombine BMP4 ve TGFβ1 yapılmadan FGF2'nin ilave iki gün, FGF2 iki gün yukarıdaki gibi kültürlenmiştir. Beklendiği gibi, kontrol eksplantlarında güçlü çoğalma FGF2'nin tepki gözlendi. Eksplantlar kortikal SVZ'unda türetilmiştir ve FGF2'nin ¹⁷ tepki olarak prolifere bilinen büyük bir kısmı NSC'lerde ihtiva edilmektedir. kontrol cerf ± 14 689, TGFβ1 hücrelerini 582 ± 49 mikron (Şekil 5.) ulaştı. BMP4 grup 935 ± 91 mikron ortalama göç mesafesi gösterdi. Buna karşılık TGFβ1 / BMP4-hücrelerinin, önemli ölçüde daha geçirilmiş 1,150 ± 23 um (Şekil 5) ile. Sonuçlar BMP4 FGF2 maruz kalan NSC'lerde bir göç uyaran olduğunu göstermektedir. Bu göç daha TGFβ1 tarafından geliştirilmiş olabilir. FGF2, BMP4 ve TGFβ1 kombinasyonu bu yüzden göç uyarılması için çok etkilidir. Özetle, hücre kültürü modeli sistemi hem nitel hem de nicel göç değerlendirmesini sağlar.

EMT gibi Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2, Twist1, örneğin göğüs kanseri, kolon kanseri, akciğer kanseri gibi epitel kanseri de dahil olmak üzere, çeşitli sistemlerde Twist2 gibi transkripsiyon faktörlerinin (TF), bağlantılı olmuştur ve aynı zamanda beyin ^1,18 tümörler. Biz hreklam önceden o FGF2 gösterilmiş ve BMP2 veya BMP4 Snail1 ve Snail2 ^8,9 uyarabilir. Yukarıdaki sistemi kullanarak diğer EMT ilgili TFs ekspresyon seviyelerini araştırdık. Twist1 ifadesinde hiçbir değişiklik tespit edilememiştir; Twist1 FGF2 maruz kalma sırasında düşük sentezleme seviyelerinde olmak (veriler gösterilmemiştir). Hücre kültürü modelinde FGF2 / BMP4-maruz kalma sırasında FGF2 maruz kalma sırasında ve Twist2 bölgesinin Zeb1 ve Zeb2 bir düzenlenmesi (Şekil 6) gözlenmiştir.

NSC'lerde oligodendrosit ön-madde hücreleri (OPC) ^8,19,20 nüfusuna katkıda bulunduğu bilinmektedir. Çeşitli türden kanıtlar şunu NSC'lerde ve özellikle OPC olarak gliomlar ^21,22 için kökenli hücre olabileceğini göstermektedir. daha yukarıda modeli karakterize etmek için, OPC markerlerinin ifadesi incelenmiştir. Bu FGF2 maruz NSC'lerde olig2 / Nestin bir ko-ekspresyonu gösterdi görülmektedirD Sox10 fazla% 90 / Nestin (Şekil 7). Bu gözlem, NSC'lerde sistemimizde OPC özellikleri gösterdiğini ortaya koymaktadır. Gerçekten de, Zeb'1 ve Zeb'2 upregülasyonu korelasyon OPC özellikleri (Şekil 6 ve 7). Bu sonuçlar aynı zamanda ilk Zeb EMT adımlarını tabanlı başlatır, olig2 ve Sox10 tarafından değerlendirilecek FGF2-genişleme, OPC kimliğini algılar olduğunu göstermektedir.

MGK İzolasyonu ve EMT İndüksiyonunun için standardize Embriyo ve Önbeyin Diseksiyon: Şekil 1. (A) sezaryen sonrası sıçan E14.5 embriyo sol ön ayakları. Her ön bacak basamaklı bir siyah bir ok ucu ile işaretlenir. E14.5 için tipik başlayan basamaklı oluşumu not edin. Gövde çıkarılmasından sonra (B) Fare E14.5 embriyo. dorsal diensefalon w de hash (#) Nothich deri / kafatası anlage kaldırılmasını başlamak için ideal bir yerdir. deri / kafatası zaten çoğunlukla (C) çıkarılır. Kaldırılan ve Çıkarılmayan cilt arasındaki sınır iki üçgen ok uçları ile işaretlenir. Cilt arka ok dan öne ön ok gelen ve posterior soyulmuş olabilir. (D) deri / kafatası artık tamamen kaldırılır. Bir ok ile işaretlenmiştir, bu sadece kaudal orta beyin-Beyin sınır (ok) ve kesme bir çentik edin. (E) telencephalon-diencephalon-mezensefalon (TEL-di-MES) blok embriyo geri kalan kısmından ayrılmış bir . (F) TEL-DI-MES bloğunun Üstün görünümü. Kranyal bırakılır. (G) eğik bir görünüşüdür yukarıdan. TEL-di-MES bloğun (lH) inferior görünümü. (I) 'in mezensefalon ve diensefalon parçası diensefalon ön kısmı ile telencephalon ayrılır. Üst: Her iki telencephalic vezikül ön görünümü. Alt: Righ. mesencephalon yanal görünümünü t, üst cranially yüzler (J) Üst: diensefalon olmadan telencephalic veziküller hem. İnferior görünüm diensefalon tümüyle kaldırılmasını göstermek için. Asterisk MGE tasvir etmektedir. Alt:. Diensefalon ön kısmı (K) Üst: Her iki hemisfer interhemisferik fissür ayrılır. sol tarafta sol hemisfer. Asterisk MGE tasvir etmektedir. Artı işareti LGE'yi göstermektedir. Medyan görünümü ile sol yarıkürenin (L) Büyütme. Sağ yüzleri cranially, üst sırasıyla sırt, alt karın olduğunu, kaudal bıraktı. Yıldız işareti (*) MGE bulunmaktadır. Artı işareti (+) LGE yer almaktadır. ch, kortikal kenar; FL, ön ayakları; di, diencephalon; mes, mesencephalon; MHB, orta beyin-Beyin sınır; HL, arka bacak; LGE, yanal ganglion itibar; MGE medial ganglion itibar; ob, koku alma ampul; pc, arka korteks; rho, rhombencephalon; tel, telencephalon. Her resmin üzerine ızgara ince çizgiler ile dört kesişme ile 2 mm kalınlığında çizgiler görünüyor her400 um. Tüm görüntülerde ölçek çubuğu:. 2 mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: MGK İzolasyonu ve EMT İndüksiyonunun için standardize Kortikal SVZ diseksiyonu. (A) sol yarıkürenin Medyan görünümü. Monro MGE ve LGE foramen yoluyla yıldızla ve artı işareti ile işaretlenmiş, görebilir. (B) koku alma ampul sadece cranially MGE-LGE ait çıkarılır. (C) korteksin arka kutup hemen CGE arkasında kaldırılır . (D) en: kortikal hem korteks ayrılır. Sol: arka kutup. Orta: korteks ve CGE lgE-MGE bloğun orta kısmı ihtiva eden bir kompleks. sağa MGE ve LGE yüzü. Sağ: koku bulb. (E) CGE-LGE-MGE-korteks blok yatay olarak çevrilir. Şimdi telencephalon dış yüzeyi mikroskop ile karşı karşıyadır. MGE ve LGE şimdi sola karşı karşıya. (F) kırmızımsı zarları parlak saydam korteks kaldırılır. CGE-MGE-LGE-ctx blok şimdi aynı prosedür sağ hemisfer ile tekrarlanır sonraki adıma. (G, H) için geri yatay olarak çevrilir. Merkezi korteks uzaklıkta CGE-MGE lgE blok ayrılır. İki oklarla, CGE-MGE-LGE bloğunda sol işaretlenmiş bir ara korteks bölgesi olduğunu unutmayın. Bu ara madde, korteks kalınlığı LGE yarı çapına tekabül etmektedir. LGE-CGE korteks arasındaki sınırı temsil Noktalı çizgi. (I) 'in merkezi korteks az 400 mikron çapında eksplantlar ayrılır. Ölçek çubuğu: 2 mm; Her resmin üzerine ızgara dört kavşak (ince çizgi) her 400 mikron ile 2 mm kalınlığında çizgiler görünüyor. Yıldız işareti (*) bulunan birt MGE. Artı işareti (+) LGE yer almaktadır. Kısaltmalar: ant-ctx, ön korteks; cen-ctx, merkezi korteks; CGE, kaudal ganglion itibar; ch, kortikal kenar; cp, koroid pleksus; ctx, korteks; LGE, yanal ganglion itibar; erkek, beyin zarları; MGE medial ganglion itibar; ob, koku alma ampul; pc, arka korteks. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Eksplant Tohum 35 mm kılavuz hücre kültür tabaklarında üzerine 500 um ızgara çanağın merkezine genleşme ortamı 1 ml yerleştirin. damla ızgara jant (küçük oklar) tarafından bulunur. Sağ 1 ml damla merkezinde yer eksplantlar. eksplantlar ızgara dışında yayılmış ise, swyavaş dairesel hareketlerle çanak IRL ve eksplantlar merkezcil kuvvet merkeze hareket edecektir. Not: eksplantlar sadece zar zor görünen göz (siyah ok başları) tarafından uygulanır. Ölçek çubuğu: 35 mm.

Şekil 4:. PDPN BMP 4 Varlığında indüklenir eksplantlar protokolü bölüm 8 (FGF2 2 gün, sadece daha sonra belirtildiği gibi faktörlerle FGF2'nin elde edilmiş) göre kültürlenmiştir. (A) kontrolü (tek başına FGF2) ve TGFβ1 (C) eksplantlar PDPN pozitif hücreler (yeşil) içermemektedir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. BMP4 (B) ve TGFβ1 / BMP4 (D) eksplantlar PDPN-pozitif hücrelerinin büyük bir oranını gösterdi. eksplant merkezi solda, sağda periferinde olduğunu. Not: PDPN-pozitif hücreler, çoğunlukla foun edildiperiferinde olup eksplant merkezinde, d. Düz ihtiva TGFβ1 / BMP4 eksplantlar daha PDPN-pozitif hücrelerin geliştirdiler. (E) farklı koşullarda eksplantlarında PDPN-pozitif hücrelerin yüzdesi gösterilmektedir. Kontrol ve TGFβ1 hem BMP4 ile şartlarından önemli ölçüde farklıdır. Means ± SEM gösterilir. TGFβ1 vs kontrol anlamlı değildi (ns) 'dir. BMP4 vs Kontrol ve TGFβ1: p <0.0001 (***). TGFβ1 / BMP4 vs TGFβ1: p <0.0001 (***). TGFβ1 + BMP4 vs BMP4 önemli değildir: p = 0,0981 (ns). TGFβ1 + BMP4 vs Kontrol: p <0.0001 (***). Tüm görüntüler için ölçek çubuğu, (A) 'da gösterildiği gibidir:. 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Kantitatif Göç değerlendirilmesi. Tek başına TGFβ1 BMP 4 ve TGF hücre göçünü 1 göstermek katkı etkisi olan B. Eksplantlar protokol bölümü başına BMP4 8. (A) Kontrol eksplant. (B) Eksplantasyon göre kültürlenmiştir. (C) Eksplantasyon. (D) Eksplant um TGFβ1 ve BMP4 kombinasyonu. (E) Göç mesafesi. 500 mikron ızgara referans olarak kullanılmıştır. kontrolü ve TGFβ1 eksplantları diğer koşullarda daha büyük bir eksplant çapı ile güçlü bir çoğalmasını gösteriyor. Means ± SEM gösterilir. BMP4 ve TGFβ1 / BMP4 eksplantlar kısmen eksplant çekirdek parçalanır ve hücreler santrifüj ondan göç unutmayın. TGFβ1 vs kontrol anlamlı değildi (ns) 'dir. TGFβ1 vsBMP4: p = 0,0353 (*). BMP4 vs Kontrol: p = 0,0351 (*). TGFβ1 + BMP4 vs BMP4: p = 0,0372 (*). TGFβ1 + BMP4 vs Kontrol: p <0.0001 (***). Ölçek çubuğu: 500 mikron. eksplant Merkezi bir artı işareti (+) ile işaretlenir. Göç hücrelerin dış kenarı üçgen ok ile işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6:.. QRT-PCR ile transkripsiyon faktörlerini EMT ilgili EMT Zeb- ve büküm-ailesinin önemli transkripsiyon faktörleri ile bağlantılıdır upregülasyonu (A, B) Zeb'1 ve Zeb'2 ilk aşaması sırasında yukarı düzenlenen edildi FGF2-maruz kalma. (C) Twist'2 secon sırasında yukarı regüle edilmiştirFGF2 / BMP4 maruz kalma d aşaması. QRT-PCR göre göreli ekspresyon seviyeleri gösterilmektedir (n = 2). mRNA düzeyleri, GAPDH normalize edilmiştir. Means ± SEM gösterilir. . FGF2, p genel kontrol grubu = 0.0002 Zeb'2: mRNA hasat edilmiştir FGF2 süresinin 0. günde, daha da mRNA FGF2'nin dört gün sonra daha sonra FGF2'nin bir gün sonra / BMP4 Zeb'1 hasat edilmiştir. Kontrol genel FGF2, p = 0.0206 Twist'2. vs kontrol edin. FGF2 + BMP4, p = 0.003.

Şekil 7:. NSC'lerde model sistemde OPC özellikleri göstermektedir NSC'lerde (Kısım 5'e göre) Merkezi korteksinden izole edilmiş ve FGF2'nin mevcudiyetinde tek hücreler olarak kültüre edildi. Kültür içinde 8 saat geçtikten sonra (geçit 4 D, Bölüm 7.9 uygun sonra) hücreler, küçük bir MGK koloniler oluşturulur ve B, olig2 (kırmızı için boyandıC), E, F) Nestin (İN Sox10 (kırmızı, yeşil, A, C, D, F). Hücrelerin önemli bir kısmı birlikte ifade olig2 / Nestin (AC) Sox10 / Nestin (DF). (G) olig2 / Nestin ve Sox10 / Nestin birlikte ifadesi, tüm hücrelerin yüzdesi de gösterilmektedir. Means ± SEM gösterilir. Ölçek (A) 'de gösterildiği gibi tüm görüntüler için bar ve (D):. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. BMP 4 ve BMP 4 1 p olan TGF kombinasyonu Sağlam Göç tepkisi oluşturur. Merkez korteks, dört günlük bir toplam genişletme orta ve FGF2'nin muhafaza edilmiştir eksplantlar. ilk sonraİki gün, eksplantlar ya tek başına (kontrol) ya da FGF2 ve kombinasyon Buna ek olarak TGFβ1, BMP4 ya TGFβ1 / BMP4 FGF2 almaya devam etmiştir. Kontrol ve TGFβ1- eksplantlar ne bir göçmen tepkisi ne PDPN ifade göstermek etmedi. BMP4 ve TGFβ1 / BMP4 tüm eksplant göçmen hücrelerin yanı sıra PDPN ifadesini hem uyarılmış.

Tablo 2. Merkezi Cortex FGF Cevabı en Sağlam Göç gösterir 2 / BMP 4 Eksplantlarındaki gelişmekte olan sıçan E14.5 nöral tüpün farklı bölgelerinden hazırlanmıştır. Merkez korteksi, posterior korteksi, medial ganglion şöhretini (MGE) ve mesencephalon. Tüm eksplantlar FGF2'deki / BMP4 (Bölüm 8) 'de aynı kültüre edildi. BMP4 olmadan tedavi Eksplantlarındaki herhangi göç yanıt (veriler gösterilmemiştir) yoktu. Tüm eksplant eksplantında bir göç hücrelerin görülmesi için taranmıştır. Tüm bölgeler göç ile BMP4 ile FGF2'deki cevap başardık. merkezi korteks, ancak, en sağlam tepki gösterdi. BMP4 bir göç hücreleri indüklemek için gerekli dikkat etmek gerekir. FGF2'nin kültürlenen Eksplantlar, tek başına çoğalma gösterdi ancakgöç; ve hayır düz göç hücreleri tek başına FGF2'deki (Tablo 1 ve Ek Şekil 2) gözlendi.

Ek Şekil 1. 400 mikron Izgara Dosyası. Grid dosyası baskılı ve yukarıdaki diseksiyon adımları sırasında referans olarak kullanılan ve olarak Şekil 1 ve 2'de olabilir. Büyük kavşaklar 400 mikron alt bölümleri ile 2 mm temsil etmektedir. Bu rakam bir PDF sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2. BMP 4 -exposed Eksplantlar ShDaire Göç eden hücreler. Şekil 5'te gösterilen hücrelerin Büyütme akış (A). Control (FGF2 tek başına) ve (C) TGFβ1-eksplantlar küçük yuvarlak hücreler ile güçlü bir hücre bölünmesini göstermektedir. (B) BMP4- ve (D) TGFβ1 / BMP4-eksplantlar sürekli düz uzatılmış hücreler gösterdi. (A) 'de gösterildiği gibi tüm görüntüler için ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Şekil 3. EMT araştırma. E14.5 fare merkez korteks için in vitro model sisteminin Özeti NSC-içeren SVZ'unda içerir. merkezi korteks u ya olaneksplant adet olarak veya tek hücre olarak sed. Eksplant parçalar kantitatif göç analizi (Bölüm 8) için daha uygundur. Tek hücreler, gen veya protein analizi (Bölüm 9.13) halinde, kalitatif analiz için uygundur.

EMT analizi kullanan NSC'lerde için standart bir sistem tarif edilmektedir Bu çalışmada, (Ek Şekil 3'te özetlenmiştir). Standardizasyon tekrarlanabilirliği (Tablo 1 ve 2) sağlamaktadır. NSC'lerde gelişmekte korteksinden normal EMT uğramayan bir doku elde edilir. Bu EMT erken aşamada analizi için avantajlıdır. EMT içinde ilk adımlar yeterli genetik değişiklikler birikmiş ve zaten EMT özelliklerini benimsemiş olabilir tümör hücrelerinde okudu edilemez. Ayrıca, primer tümör örnekleri en habis tümörler heterojen invaziv ve non-invaziv hücreler hem de içeren beri EMT anlamak için ideal değildir. sunulan protokol EMT indüksiyon erken aşamaları incelemek için yeni bir model ile EMT araştırmacılar sağlar. (İlk aşamada Zeb1 ve Zeb2 sırasında ikinci aşamada Twist2 sırasında upregüle Figür: Burada Zeb ve Büküm ailesinin anahtar EMT indükleyicileri sırayla devreye sokulmuş olduğunu göstermektedirE 6). Daha önce, Snail1 zaten BMP4 maruz kalma ⁸ birkaç saat sonra arttığını göstermişlerdir etmişti. Ayrıca bu BMP4 maruz kalma üzerine merkezi korteksten nöroepitelyal kök hücreler, düz kas aktin (SMA) ve calponin ⁹ pozitif mezenkimal hücreler, farklılaşırlar göstermiştir. Yukarıdaki sonuçlar bilinen üç temel EMT düzenleyicilerinin bütün sistemine dahil olduğunu gösteren önceki çalışmayı tamamlamak. Buna ek olarak, TGFβ1 önemli ölçüde tek FGF2 / BMP4 göç etkisini artırmak gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar EMT indüksiyon sırasında FGF-, BMP- ve TGFβ-sinyalizasyon arasında bir ağa etmektedir.

EMT ve göç analizleri için NSC'lerde başarılı izolasyonu için en kritik adımlar şunlardır: doğru anatomik gelişen embriyonun işaretlerini, taze kültür ortamı hazırlanmasını ve (en azından gece) kaplanmış plakalar, ince uçlu araçların kullanımını belirleme, embriyonik yaş belirleme ve proGelişmekte olan korteksin orta kısmının diseksiyonu başına kortikal eksplantları kurmak.

Sunulan tekniklerin bazı değişiklikler ile arttırılabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, çok sayıda eksplantlar bir ızgara ile tek bir kap üzerine kaplanır. Birden bileşiklerin taranması için, ancak, 96 oyuklu bir plakanın her çukuruna tek eksplantlar daha uygun olabilir. Dahası, model sistem büyük ölçekli ilaç keşfi için rafine edilebilir. Yukarıda tarif edildiği gibi, PDPN PDPN invaziv NSC'lerde, ⁸ bulunduğu için yeni alınan göç özellikleri için önemli bir belirtecidir. Bir PDPN muhabiri EMT indüksiyon önce normal NSC'lerde transfekte edilebilir. Bunun bir sonucu olarak PDPN PDPN Normal NSC'lerde (Şekil 4 ve Tablo 1) olarak ifade edilmez çünkü hücreler, hücre transformasyonu için bir iç kontrol olarak hizmet edebilir ifade. Çeşitli ek MGK belirteçler gibi EMT indüksiyon ⁸ sonra kaybolan Nestin gibi, mevcuttur. Sonuç olarak,hem ilk devlet "/ olmayan göçmen non-invaziv / Nestin +" ve son durum, "göçmen / invaziv / PDPN +", otomatik ilaç keşif sağlayan, izlenebilir. Birden oyuklara (örneğin, 96-yuvalı plakalar ve daha büyük), ilk hücre büyük hücre kültürü plakalarına edilebilir ve var olan ilaçların ya da bilinen işlevi olmayan bileşikler ile muamele edilmiştir. Böylece, çukurlu plakalar otomatik olarak PDPN veya diğer göç / işgali belirteçlerin ifadesi için taranabilir. bir inhibitör ekranın ana hedefi ise, PDPN ifade kaybolması Varsayımsal ilginç yeni inhibitör bileşiklerin belirlenmesi için yardımcı olabilir.

yeni bir maddenin test sırasında eksplantlar göç göstermeyebilir ve / veya eksplantları kadar yuvarlak ve çanak ayırmak olabilir. Bu durumda, medyanın sadece yarım (yerine tam ortam değişikliği her gün) her gün değiştirmek için en iyisidir. Taze medya ile değiştirirken Bu yüzey gerilimi ile stresi azaltır.eksplantlar sonra ilk kaplama eklemek olmayabilir. Bu durumda, fibronektin, en az 36 saat, bulaşık yüzeyi ile temas içinde olmak zorundadır. fibronektin plastik yapışabilir çünkü kaplama için kullanılan fibronektin taze fazla 10 dakika boyunca plastik bir tüp maruz kalmadan elde edilmesi gerekir. Dahası, eksplantlar ızgara dışında yerleşmek olabilir. Bu durumda, yavaş dairesel hareketlerle çanak girdap tavsiye edilir. Bu eksplantlar merkezcil kuvvet (bakınız Şekil 3) ile merkeze yeniden konumlandırmak için izin verir.

Gliomlar NSC'lerde ^23,24 türetilen NSC'lerde ve / veya OPC türetilen dair kuvvetli kanıtlar vardır. INK4 / ARA-eksik fareler Sampetrean ark izole NSCs ve H-Ras ²⁵ aşırı ekspresyonunu zorla. Bunun bir sonucu olarak, diğer gruplar NSC'lerde bazında glioma büyüme modelini oluşturmuştur. Yüksek dereceli habis tümörler transplantasyon ²⁵ sonra çoğalması ve işgali gösterdi sonuçlandı. McNeill ve ark., genetiği değiştirilmiş farelerin de izole NSC'lerde (floxed Rb1, NF1, Kras, PTEN yalnız ve kombinasyonlar halinde) ^26. Genler Cre-virüs enfeksiyonu ile inaktive edilmiş ve NSC'lerde ²⁶ nakledildi. Her iki model sistemler işgali in vivo ve potansiyel yeni bir anti-işgal ilaçlar izlenebilir avantaj test edilebilir var. Onların ana dezavantajı işgali başlangıcı iyi tanımlanmış değildir ve hücrelerin glioma tipik EMT işgali (EMT genleri) ya da sadece yerel göç göstermek belirsizdir olmasıdır. Bundan başka, sadece tek bir madde hayvan başına test edilebilir ve analiz birçok hafta gerekir. Bir yeni anti-işgal ilacı tanımlamak için, ilaç firmaları, (a), (b) farklı ilaç konsantrasyonlarını denemek için testler ve (c) çoğaltmak için, birkaç bin bileşiklerin taranması ya da bir kez daha gerekiyor. Birkaç bin nakledilen hayvanların hazırlamak farklı ilaçlar ile tedavi ve nihayet histokimyasal veya biyoparlaklık ile etkileri test etmek içinAnaliz çok kaynak tüketen. İşte EMT ilgili işgali için yeni bir MGK tabanlı bir model sistem bileşiklerinin binlerce maliyetli tarama izin verdiğini tarif edilmektedir.

Bu model, bileşiklerin yüksek veri akışı taramasını sağlasa da, bu sadece bir primer tarama platformdur. Söz konusu olan terkipler, bu modelde tespit edildikten sonra, bu ek doğrulama gerektirir. Yukarıda ^25,26 önem tarif edildiği gibi, in vivo testlerle tespit edilen herhangi bir bileşik için, güvenlik ve etkinlik parametreleri ve transplantasyon modellerinde için gereklidir. Model, aynı zamanda, kemirgen hücreleri üzerinde esas gerçeği ile sınırlıdır. Model sıçan veya fare EMT araştırmak için kullanılabilir, ancak, aynı mekanizma insan hücreleri veya insan hastada bir yerde ise, bu açık değildir. Daha başka deneyler, NSC'lerde in vitro invasif değil, aynı zamanda transplantasyon sonrası, sadece eğer araştırmak için ihtiyaç vardır. Çeşitli türden kanıtlar şunu NSC'lerde rolünü desteklemekglioma oluşumunda. Tenascin C Hey1 SPARC, Snail1 ve Snail2, FGFR + BMPR1a EGFR, PDGFRβ, Sox2 podoplanin, Gli3 ve p75NGFR ^8: Glioma ilerlemesi Aşağıdaki genlerin ile bağlantılı olmuştur. Bu genlerin tümü de invaziv mezenkimal hücreler ⁸ normal non-invazif NSC'lerde dönüşümü sırasında ifade edilir. şimdilik anda, NSC'lerde dış büyüme faktörleri sadece tümörlerin dönüştürülebilir belirsizdir.

Farklı tümörlerden tümör başlatılması kök hücreler (TIC) izole edilmiş ve tümör ilerlemesi ²⁷ anlamak için model olarak kullanılmıştır. EMT önce tikler ²⁷ meydana gelmiştir çünkü SI eğrisi, EMT analizi için uygun değildir, ancak, bulunmaktadır. EMT indüksiyon erken ve geç adımları anlamak için, birincil non-neoplastik hücre popülasyonu gereklidir. İdeal olarak bu nüfus ilk etapta EMT geçmesi gerekiyordu değildi. Daha önce embriyonik NSC'lerde uygun adaylar bu amaç için olduğu gösterilmiş olan^9,28. Başka bir deyişle, yer değiştirmesine ve istilasma FGF2 ve BMP4 ^9,28 ile NSC'lerde neden olabilir. Anahtar EMT aileleri Zeb ve Büküm ⁸ araştırılmamıştır beri FGF2 / BMP4 kaynaklı göç tek EMT-ilişkili genlerin ilişkili olduğu, ancak, tam kanıt yoktu. dört faktörün spesifik kombinasyonu, FGF2, BMP4, TGFβ1 ve insülin çok güçlü ve eksiksiz EMT indüklemesi göstermek Yukarıdaki sonuçlar, daha önce gözlenmemiştir. Bu çalışmada Zeb- ve Twist-ailelerin anahtar EMT genler de regüle olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, bu nedenle tek bir gen seçici yukarı-regülasyonu yok ilk kanıt sağlar, ancak sonuçlar tüm önemli EMT aileleri önerilen hücre kültürü sisteminde etkin olduğunu göstermektedir.

EMT, aynı zamanda, akciğer, meme, kolon ve mide kanseri ²⁹ beynin dışındaki epitelyal kanser gözlenmiştir. EMT incelemek için çeşitli modeller bu tümörler ^30-32 için kullanımda olanHangi önemli sınırlamalar, ancak gelir: Birden fazla genetik ve epigenetik ³³ değiştirir taşıyan dönüştürülmüş tümör hücre hatları (a) kullanımı; erken kanser aşamalarında EMT inhibitörleri tespit etmek, ileri evre kanser hücreleri yetersiz; (B) çeşitli tanımsız büyüme faktörleri içerir serum bağımlı kültürler; Bu kritik faktörlerin belirlenmesi çok zordur kılmaktadır. Serum kalite partiden partiye değişir çünkü Ayrıca, deney tekrarlanabilirliği bozulur; (C) Serum muhtemelen potansiyel olarak yararlı eksojen bileşiklerin inaktive inhibitörleri ve enzimatik faaliyetleri ihtiva eder; (D) hücre yüzey molekülleri aşağılamak hücre geçiş için enzimlerin ihtiyacı; Fizyolojik EMT teşvik etmek EMT agonistleri tespit etmek (E), normal hücreler indüksiyon testi için ihtiyaç vardır. Tümör hücre modelleri, normal kök hücrelerinin yenilenmesini teşvik maddeleri bulmak için yetersiz kalmaktadır.

Göç, aynı zamanda yara iyileşmesi ve REGENE gibi normal işlemler için gerekli olanyaralı beynin ¹⁸ oranı. Travmatik beyin hasarı, inme sonrası, NSC'lerde yenilenme ^4,34 katılmak için lezyon yerinde göç etmek gereklidir. Mevcut sistem, yer değiştirmesine ve istilasma teşvik maddelerin tanımlanması için de kullanılabilir. Yukarıda gösterildiği gibi, geçiş BMP4-tedaviden başlamasıyla indüklenir. Hücreler BMP ama bunun yerine yeni bileşiklere maruz değilseniz, bu yeni BMP agonistleri belirlemeye yardımcı olacaktır BMP eylem yerini alabilir. PDPN ifadesini gösteren bir muhabir sistemine sahip, yeni maddeler için büyük ölçekli test uygulanabilir hale; yeni bir bileşik BMP yerine eğer, PDPN ifade eden hücreler, otomatik olarak tespit edilebilir.

Önerilen sistem ayrıca hücre sinyal etkileşimleri araştırmak için yararlıdır. Elde ettiğimiz sonuçlar göç BMP etkisi TGFβ1 aktivasyonu ile gelişmiş olabilir göstermektedir. Sonuçlar BMP- ve TGFβ- arasındaki bir katkı etkileşimini ortayasinyalizasyon. Ancak, bu tür Çentik, Wnt- ek sinyal yolları veya EGFR- / MAPK- ve diğer sinyal yöntemleri söz konusu olabilir. Bu nedenle, BMP / TGFβ-etkileşimleri ve diğer yollar çapraz tartışma daha ileri araştırmalar gerekmektedir. Buna ek olarak, tepki veren merkezi korteks EMT altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı olabilir genetik olarak tadil edilmiş farelerde izole edilebilir. Özet olarak, burada açıklanan EMT model sistemi, kök hücre biyolojisi ve yenilenme alanlarında faydalı yanı sıra kanser araştırmalarında olabilir. Bu inhibe veya yer değiştirmesine ve istilasma artırıcı maddeler için ilaç kütüphanelerinin taranması için kullanılabilir.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Çalışma MHS ve AG (SNF IZLIZ3_157230) bir hibe ile Basel Bilim Vakfı Üniversitesi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz teşekkür ederiz: Dr. Tania Rinaldi Burkat cömertçe altyapının sağlanması için; tartışmalar ve yorumlar için Bettler grubun tüm üyeleri. Biz Gerhard Dorne (Leica Microsystems, İsviçre) Full HD MC170 video kamera profesyonel ve yetkin montaj için (Leica Microsystems, İsviçre) teşekkür ederim.