Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Bu maddenin amacı, detaylı bir şekilde oluşturabilir ve insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), elde edilen insan IgG monoklonal antikorları karakterize etmek için bir yöntem tanımlamaktır.

insan antikorları incelemek için faiz araştırma birçok farklı alanda büyüdü. Özellikle, birçok araştırma grupları oto-antikorların ^1-3 kaynaklanan patoloji ilgilendi. Biz klonlanmış ve patojenik oto-antikorlar ¹ nitelendirmiştir. oto-antikorların çalışma rakip antikorlar ⁴ kullanan, örneğin, kendi hedefleri tespit etmek ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, insan antikorlarının çalışma aynı zamanda, aşı ⁵ sonrası bağışıklık tepkisini değerlendirmek için maruz kalan ve belirli bir patojen ⁶ ya da çalışma için dirençli haline geldi kişilerin antikor profilini karakterize etmek için, örneğin, araştırmanın diğer alanlarda, ilgi hangi Antikorlar olanDoğal repertuar ^7,12.

Çeşitli teknikler, rekombinant insan monoklonal antikorlarını üretmek için ^8-12 geliştirilmiştir; Bunların çoğu, faj görüntüleme ve B hücre immortalizasyonunu kullanımı. Faj gösteriminin kullanımı, geniş ölçüde, yeni antikorlar ¹³ keşfedilmesi için uygulanmıştır. Ancak haline insan immünoglobulin ağır ve hafif zincir çiftinin işleminde ayrışmış, yani bu, önemli bir dezavantajı vardır. Insan B hücreleri ya da EBV dönüşümü ile hibridomlar üretimi bu dezavantajı ortadan kaldırır.

Biz Toll-like reseptör 9 (TLR-9) ^6,12'dir yoluyla poliklonal B hücre stimülasyonu ile birlikte EBV ile timik B hücrelerinin enfeksiyonu kullanın.

Bu yazıda ayrıntılı olarak in vitro antikor nesil PBMC izolasyondan tüm adımların eksiksiz bir bakış ile, IgG insan antikorlarının gelişmesi için kullanmak teknolojiyi tanımlamak. BuProtokol insan IgG profilin her tür analizi için kullanılabilir. Laboratuvarımızda, IgG antikorları üreten B hücreleri başarıyla sıralama sonra PBMC'lerin geri kalanından ayrılmış oylandı. Elli kriteri B hücreleri ⁸ daha sonra, çok oyuklu plakalara plakalanır ve bir B hücrelerinin klonal genişleme için, EBV ve TLR 9 aktivasyonu ile immortalize olabilir. Besleyici hücreler olarak, insan embriyonik akciğer dokusundan fibroblastlar, ölümsüzleştirilmiş B hücreleri görüntülenmesini kolaylaştırır hücre çizgisi WI38 kullanılmıştır. Bu B hücreleri, immünoglobulin ağır ve hafif zincirlerinin sekansları, PCR ile elde edilebilir, ve antikor genleri immünoglobülin G sentezleme vektörlerine klonlanmış ve in vitro koşullarda üretilen. Bu tekniği kullanarak, donör bulundu aynı antikor dizisi ile tek antikorlar ele alınabilir.

Aydınlatılmış onam çalışmanın katılımcılardan elde edilmiştir. Çalışma kurumsal etik komitesi tarafından onaylandı.

Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMC)

1. Santrifüj Kan çıkarma sonra en kısa sürede 15 dakika 900 x g'de en katılımcıların heparinlenmiş kan 25 ml. Daha az kan varsa, buna göre reaktif küçültün. Bir kaputu tüm sonraki adımları uygulayın.
2. Temiz bir tüpe serum aktarın. Bu otomatik antikorları test etmek için, PBMC dondurma ya da otoimmün hastalar durumunda sonraki adımda kullanılabilir.
3. RPMI 1640 ortam 10 ml kan sulandırmak ve yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tekrar süspansiyon.
4. Yeni 50 ml tüp polisükroz ve sodyum Diatrizoate (1.077 g / ml) ihtiva eden bir çözeltiye, 15 ml ilave edilir.
5. Yavaşça tüpler yakın sonuçlar almak için, iki açıklıklar getirerek aşama 1.4'te çözeltisinin üzerine kan tabakaonun iki sıvı temas çok yavaş gelir ve daha sonra 50 ml tüp üstünde yavaş PBMC süspansiyonu süzün kadar. Bu adım, PBMC'lerin iyi bir şekilde ayrılmasını olması kritik önem taşır.
6. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında fren yapmadan, 400 x g'de aşama 1.5 'de elde edilen bir tüp santrifüjleyin.
7. Santrifüj işleminden sonra, pipetle PBMC'leri içeren tüp, orta kısmında görünen beyaz halka kurtarın.
8. RPMI 1640 ortam, 25 ml hücreleri yıkayın.
9. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 300 xg santrifüjleyin.
10. Süpernatantı atın ve adım 1.9 olarak tekrar RPMI 1640 Santrifüj 10 ml hücreleri yıkayın.
11. Daha önce ¹⁴ bildirildiği gibi bir Neubauer odasına sahip PBMC'leri sayın.
12. Bölüm 2'de olduğu gibi PBMC'leri işleyin veya aşağıdaki gibi daha sonra kullanmak üzere saklayın: 10 milyon PBMC'ler adım 1.2'de elde edilen% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ve% 90 serum 1 ml seyreltilmiş cryovial tüp başına dondurma için. Kademeli ve uzun sto için Freezesıvı nitrojen içinde öfke.

2. Boyama PBMC'leri Hücre Sitometrisi ile CD22 + ve IgG + Ayırma

1. (L-glutamin, 10 mM HEPES tampon maddesi, 50 U / ml penisilin, 50 ug / ml streptomisin ve cenin sığır serumu,% 10 ile takviye edilmiş) tam RPMI 1640 ortamı 6 ml ile 25 ^cm2 hücre kültürü şişesi içinde PBMC'ler Plate ve onları% 5 CO ₂ 37 ° C'de inkübatör O / N kurtarmanızı sağlar.
2. Steril% 4 albümini fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi, O / N steril FACS tüpler bloke eder. PBS ile iki kez yıkanır tüpleri ve tam RPMI 1640 ortamı içinde 500 ul ile doldurun. Sıralama sonra hücrelerin kurtarmak için bu tüpler kullanın.
3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 400 x g'de, bir tüp ve santrifüj PBMC'ler toplayın.
4. Etiketleme tampon hücreleri (bkz 2.5 ve 2.6 adımları) tekrar süspansiyon ve bunları ¹⁴ saymak. etiketleme tamponu, steril% 2 fetal sığır serumu ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), P içindeBS.
5. 10 ⁵ hücre, her biri 3 floresans ile aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) tüpler hazırlayın ve markalama tampon 100 ul bunları tekrar süspansiyon. Bu tüpler sıralama kapılarını tanımlamak için hizmet edecektir.
   1. Birinci tüp içinde, üçüncü bir tüp içinde, ikinci boru 20 (üretici veri sayfasında önerilir) anti-IgG PE ul ve hiçbir şekilde, (imalatçının veri sayfasında önerilir) anti-CD22 antikoru PerCP 5 ul ekle. 30 dakika boyunca buz üzerinde ve karanlıkta inkübe edin.
6. Süspanse 5.000.000, bir FACS tüpü içinde etiketleme tamponu, 200 ul hücre ve anti-CD22 PerCP 10 ul anti IgG PE 40 ul ekle. 30 dakika boyunca buz ve karanlık üzerine inkübe hücreleri. Hücrelerin daha yüksek bir sayıda sıralama isteniyorsa, tüm reaktifleri büyütmek.
7. Oda sıcaklığında, 5 dakika için düşük bir fren ile, 400 x g'de santrifüje hücreleri.
8. Usulca süpernatant Durusu.
9. 500 μ hücrelerin yeniden süspanseEtiketleme tamponu. Oda sıcaklığında, 5 dakika için düşük bir fren ile, 400 x g'de santrifüje hücreleri. Tekrarlayın 2.7 ve 2.8 adımları
10. Yumuşak süpernatant boşaltacaktır ve RPMI tam ortam içinde 300 ul hücreleri tekrar süspansiyon.
11. 0.45 um'lik bir filtreden hücreleri geçirin. Hücreler sıralamak için hazırız.

B Hücreleri CD22 + ve IgG 3. Sıralama +

1. Hücrelerin canlılığını kurmak için 3 kontrol tüpleri kullanın. Hiçbir boyama ile kontrolde, lenfosit yolluk tanımlamak için ileri ve boyut dağılım grafiğini kullanın. CD22 PerCP ve anti-IgG PE kontrol kapıları ve sıralama kapısı kurmak için hizmet vermektedir. Önceden bildirilen verilerin ¹⁵ Aşağıdaki gerçekleştirin.
   Not: Bir kapı büyük bir kümesinden, bizim durumumuzda hücrelerinde, cytometric olayların belirli bir grup izole etmek için hizmet değer limitleri (sınırları) bir dizi. Bir sıralama kapısı değer sınırları söz konusu içinde olan sitometrik olaylar, hücrelerin giderilmesini sağlartanımlanmış sınırlar: CD22 + ve IgG +.
2. Sıralama bir toplama tüpü gibi, adım 2.2 elde edilen tam RPMI 1640 orta 500 ul, bloke tüpler kullanın.
3. Çift pozitif ^15'e sıralamak için devam edin: CD22 + IgG +. Her durumda hücrelerin nihai numarasını not alın. Plaka en kısa sürede besleyici hücreler üstünde hücreler kriteri.

Besleyici 4. Hücrelerin Işınlama

Not: 1 arasındaki besleyici hücreler hazırlanmasını gerçekleştirin - sıralamadan önce 3 gün. En az 5000 WI38 hücre, 96 hafta oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ihtiyaç vardır. Adımları bir başlık 4.1, 4.2 ve 4.4 gerçekleştirin.

1. Hücrenin, istenen sayıda ulaşılana kadar 37 ° C'de ve% 5 tam RPMI 1640 ortamı içinde _CO2 (PBMC ile aynı) de WI38 hücre geliştirin.
2. ¹⁶ önce tarif edilen bir protokol izlenerek, 50 Grays onları ışın tedavisi. WI38 hücreler tripsinize ve C içinde yeniden süspansiyon haline edildikten sonra ışınlama gerçekleştirmeRPMI ortamı veya kültür şişesine bağlı ve ışınlama sonrası tripsinize WI38 ile omplete. WI38 hücrelerinin tedarikçi tarafından gösterilen tripsinizasyonla yöntemini izleyin. (Toplam PBMC% 1 adımında 1.11 sayılır) IgG + B hücreleri kaplama için gerekli kuyuları karşılamak için gerekli hücrelerin sayısını ışın tedavisi.
3. Levha 5000 ihtiva eden 90 | il 96 hafta çukurlu bir levhanın her çukuruna WI38 hücre ışınlanmış. (Daha hızlı buharlaşmasına çünkü) boş bir levha dış satırda kuyular bırakın ve sadece hücreleri kaplama için plakanın ortasında 60 kuyu kullanın. 200 ul PBS ile plaka çerçeveleyici dış kuyu doldurun.
4. Gerekli olana kadar,% 5 _CO2 seviyesinde 37 ° C'de bir kuluçka yerleştirin.

5. Kaplama sıralama PBMC'ler, EBV enfeksiyonu ve Büyüyen

1. 96 hafta oyuklu plaka (daha önce kaplama wit 1640 komple ortam oyuk başına RPMI 50 ul 50 hücreleri plaka, sıralanmış PBMC'ler seyreltilirH WI38 ışınlanmış hücreleri) içerir. EBV iş için donatılmış bir kaput adımları uygulayın.
   Not: oyuk başına 50 hücre enfeksiyonu optimize edilmiş ve bir monoklonal antikor üretmek için ⁸ likehood arttırır, ancak ^1,6 önce tarif edildiği gibi PCR ile, bu kontrol etmek için önerilmektedir.
2. 96 çukurlu yuvarlak plaka ¹⁷ her göre - (4 x 10 ⁸ viral kopya / ml 3 ihtiva eder), EBV süpernatan 60 ul ekle. DİKKAT EBV çalışması sırasında alınmalıdır.
3. CpG 1 ug / ml (ODN2006) oyuk başına ekleyin.
4. % 5 _CO2 37 ° C'de bir kuluçka hücreleri bırakın.
5. Bir hafta sonra mikroskop altında büyüyen Görme monitör klon.
   Not: B hücresi büyümesinin bazı örnekleri sonuç bölümünde aşağıda görülebilir. Klonların bu büyüme oranları değişebilir dikkat ve ekstra zaman iyi ortasında büyüyen bazı hücre kütlesi görmeye başlamak için gerekli olabilir.
6. ^1. İki hafta sonraışık mikroskobu altında büyüyen ve ilk medya değişimi devam s monitör klon. Yavaş yavaş oyuk üst kısmından orta 90 ul pipetleme ve temiz bir 96-çukurlu plaka içinde toplayın. (B hücreleri kuyunun dibinde yalan, bu yüzden onları aspire riski yoktur).
   1. Her çukuruna CpG (ODN2006) 1 ug / ml IL2 50 U / ml ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı içinde 100 ul ekle. Klonlar büyümekte, adım 6'daki gibi ELISA ile ilk ortam değişimi analiz eder.
7. Artan klon izlemek ve 3. ^ve ortam 90 ul alarak ve CpG (ODN2006) 1 ug / ml ve 50 U / ml ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı, 100 ul ekleyerek tekrar büyüyen ^4. haftadan sonra ortamı değiştirmek IL2. Aşama 6'daki gibi ELISA ile IgG üretimi izlemek için toplanan süpernatant kullanın.
   Not: büyüyen bir ay klon yuvarlak hücrelerin agrega tha gözlemleyerek belirgin olmalıdır sonrat genellikle iyi yuvarlak alt ortasında yalan.
8. Bu aşamada, aynı şekilde ortamı değiştirmek önceki hafta ancak tam RPMI 1640 medya ile. İyi bir gösterge o sarımsı hücrelerin bir medya alışverişi ihtiyaç haline geliyor eğer ortamı değiştirmek için doğru anı, medya renk bilmek.
9. 96 oyuklu plakalar, büyük klonlar (yaklaşık 5 x 10 ⁵ hücre) ihtiva eden zaman, bir 24-yuvalı plakanın düz bir oyuğuna transfer edin. Yeni kuyu tam RPMI 1640 medya 300 ul ekleyin. Yukarı pipetleme ve homojen dağıtan yeni kuyuya birkaç kez, ve transfer hücreleri, aşağı, 96-iyi büyüyen klon yeniden süspanse. Gerektiğinde yeni medya ekleyin.
   1. 24 oyuklu bir plakanın gözleri de hücreleri (yaklaşık olarak 5 x 10 ⁶ hücre) dolu olduğunda, 6 kuyucuklu bir levhanın düz bir oyuğuna transfer. Iyi yeni tam RPMI 1640 medya 2 ml ekleyin. Yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı 24 plaka hücrelerin tekrar ve onlara homojen bir dağıtımınıcihaz- yeni kuyuda.
10. Gerektiğinde Medya ekle. Hücreler kültür içinde muhafaza edilmesi için ise, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet hücreleri. ELISA testi için süpernatantlar saklayın. 5 dakika boyunca 400 x g hızında tekrar 1 x PBS, santrifüj ile bir kez hücre topağı yıkayın ve RNA ekstraksiyonu kadar -80 ° C'de kuru saklanır.
    1. 6-çukurlu plaka içindeki hücreler konfluent (yaklaşık 20 x 10 ⁶ hücre) olduğunda, bir 60 mm kültür plakasına aktarılır. Yeni bir levha tam RPMI 1640 ortamı içinde 4 ml ekleyin. Bitmiş gibidir, onları 6 plaka hücrelerin yeniden süspanse ve transferi 5.9 ve 5.10 adımları.
11. Gerektiğinde yeni medya ekleyin. % 90 fetal dana serumu içinde 30 milyon / ml ve% 10 DMSO - Bu adımda, 10 hücreleri dondurma. Hücrelerin büyük miktarlarda istedi ise, daha büyük yüzey plakalarda klonların genişleme devam ediyor.

IgG Antikor Algılama 6. ELISA

1. Iyi bir ELISA plaka o 50 ul / dağıtımf keçi F (ab ') ₂ anti-insan Fc antikoru kaplama tampon maddesi içinde 1 200 seyreltilmiştir. Kaplama tampon maddesi 50 mM _Na-2 CO ₃ pH 9.6 içerir.
2. Plastik bir etiket ile plakaları Seal, ve 37 ° C 'de 1 saat inkübe edilir. Seçenek olarak ise, 4 ° de CO / N inkübe edin.
3. Yıkama tamponu içinde 200 ul her bir göze 6 kez yıkayın. Yıkama tamponu,% 0.05 Tween-20 1 x PBS içinde içerir. Dokunmak veya antikor bağlı olan kuyu yüzeyi çizmeyin.
4. Bloklama tamponu, 100 | il / oyuk ile bloke edin. Bloke edici tamponun PBS içinde yağsız kuru süt% 4 içerir. Plaka kapatın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir.
5. Yıkamayın. Engelleme tampon atın ve artık sıvıyı çıkarmak için bir kağıt havlu üzerine ters plaka 3 kez tokat.
6. Klonları süpernatantlar ve standartları inkübe edin.
   1. İlk testte, adım 5.6 veya RPMI 5.7 1/3 elde edilen klon süpernatantlar sulandırmak. Standartlar RPMI orta insan IgG çözeltisi ile seyreltilmiş için almak için: 1000 ng /mi, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62.5 ng / ml, 31.25 ng / ml, 15.6 ng / ml ve boşluk. De / 50 ul kullanarak ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Böyle 1/10 ya da 1/100 olarak antikor afinite test etmek için klon 'süpernatanının daha dilüsyonları, analiz edin.
7. Adım 6.3 yapıldığı gibi yıkayın.
8. Inkübasyon tamponu içinde 20,000: keçi F 50 ul / oyuk kullanarak (ab) 2 anti-insan IgG Fc peroksidaz 1 seyreltilmiş konjuge. Kuluçka tampon 1x PBS içinde% 1 BSA ve% 0.02 Tween 20 içerir. 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
9. Adım 6.3 yapıldığı gibi yıkayın.
10. % 0.1 3,3 'ihtiva eden 100 | il / kaynak hülasa çözüm, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB). Kuyularda istikrarlı bir mavi renk oluşana kadar 10 dakika inkübe edin. Dikkat et; Çok uzun beklemek yok!
11. 2 MH ₂ SO ₄ 50 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Reaksiyonun kesilmesinden sonra 30 dakika içinde, 450 nm'de emilimi ölçün.
    Not: Tüm klonlar 'ınboş fazla 3 standart sapma ile upernatants IgG insan antikorları için pozitif kabul edilir. Pozitif klonların teyidi için bu ELISA, aynı klonun farklı süpernatanlarında en az üç kez tekrarlanmalıdır. Ayrıca belirsiz çapraz reaktivite olasılığını atmak için süpernatantlar kaplanmamış inkübe ancak kuyuları bloke edildiğinde hiçbir sinyal yok olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Bu aşamada, bir algılama tahlil, ilgi konusu Antikorların Antijenik Spesifisitesi bölüm 7'ye devam etmek için önce gerçekleştirilebilir taranması için.

Üretim IgG Klonların 7. RNA İzolasyon ve ilk şerit cDNA sentezi

1. IgG üretimi ELISA ile teyit edilir en kısa sürede, klon RNA ayıklayın.
2. Adımlarda 5.7 veya 5.9 büyüyen hücrelerden RNA çıkarılması için, 10.000 hücrelerinden bir hücre DNA elde edilmesine izin verir üst simge III hücreleri doğrudan cDNA sentez kiti kullanın.
3. Lar RNA çıkarmak için birHücrelerin ger miktarları ya adım 5.11 saklanan pelet yüksek saf RNA izolasyon kiti kullanın. RNA ekstraksiyonu diğer sistemler de bu aşamada uygun olabilir. Üreticinin talimatları izleyin.
4. Hücre sayıları için ters transkripsiyon sistemi kullanımı ⁴ 10 x ⁶ 10 x 1 ila 1, üreticinin talimatı takip. İlk iplik cDNA sentezi için diğer sistemler de kullanılabilir.

8. ^1. ve Ağır büyütülmesi ve IgG üreten B-hücresi Klonlarının hafif zincirler için ^2. PCR

1. Aşama 6 IgG ELISA'da aşama 5,6 ve 5.7 ve pozitif elde edilen hücre klonları, cDNA ile, Tablo 1 'de listelenen primerleri ile PCR gerçekleştirin.
2. Her IgG ağır, kappa ve lambda zinciri için bağımsız PCRlar ayarlayın. Ileri bir stok solüsyonu yapın ve eşit konsantrasyonlarda primerler ters. 0.4 uM nihai konsantrasyonda reaksiyona ekleyin.
3. 1 ^ST PCR gerçekleştirmek için cDNA sentezi 1 ul kullanın. Burada, Takara Taq üretici talimatları kullanarak 20 ul reaksiyonları gerçekleştirmek. Alternatif olarak, diğer polimerazları kullanın.
4. Aşağıdaki döngü koşulları altında 1 ^st PCR yerleştirin: 5 dakika boyunca 94 ° C; (50 döngü: 30 saniye için 94 ° C; 45 sn için 30 saniye için 58 ° C ve 72 ° C; 72 ° C, 7 dakika boyunca, reaksiyon 4 ° C.Include boş soğumasını sağlar, olası kirlilikleri tespit etmek.
5. 1x TBE (89 mM Tris-borat, 2 mM EDTA) hazırlayın. 1x TBE 100 ml bir hacim içinde agaroz (% 1 agaroz jeli) 1 g ekleyin. Agaroz çözülür alır dek yaklaşık 1 dakika süreyle mikrodalgada çözüm ısıtın. Daha sonra, 10 mg / ml etidyum bromür (ya da eşdeğer DNA boyası) 4 ul eklenir ve karıştırılır.
   1. Bir tepsiye dökün ve içeriği polimerize olur kadar bekleyin. Bantları görselleştirmek için jel PCR karışımı 5 ul çalıştırın. Ağır zincir fragmanı400 bp - hafif zincir yaklaşık 300 olması gerekirken, 550 bp - s 400 civarında olmalıdır. Bantları ^{algılanmazsa,} 2. PCR benzer şekilde devam eder.
6. ^2. PCR gerçekleştirmek için mix ilk PCR 1 ul kullanın. Adım 8.2 ama primerlerin uygun karışımı kullanarak (Tablo 1), aynı reaktifler kullanın. ^2. PCR kullanımı, aşağıdaki şartlar için: 5 dakika boyunca 94 ° C; ;: (30 saniye için 94 ° C; 30 sn için 56.5 ° C, 55 sn için 72 ° C, 50 döngü) 7 dakika için 72 ° C; 4 ° C'de soğumaya bırakın. Olası PCR kirliliklerinin tespit tepki olarak bir boş, ekleyin.
7. 8.5 de tarif edildiği gibi, bir agaroz jeli hazırlayın. 9. adımda klonlama için doğru boyut fragmanları ihtiva amplifikasyonlar kullanın ve adım 10 antikorları üreten 8.5.1 gibi PCR ürünü görselleştirmek için jel çalıştırın.
8. Sekansı içeren 10 ul bir reaksiyon kullanılarak, DNA: ^2. PCR, 0 100 ng.Astar veya primer karışımının, sonlandırıcı 1 ul ve tamponu 1 ul 2 iM. (:; 5 sn için 50 ° C; 10 sn için 96 ° C ve 4 dakika için 60 ° C 25 döngü;): bu koşullar altında dizileme reaksiyonu gerçekleştirmek 7 dakika için 60 ° C; 4 ° C'de soğumaya bırakın.
9. Üreticinin talimatlarını takip microspin G50 sütunları ile sıralama reaksiyonları arındırın. ¹⁸ daha önce tarif edildiği gibi otomatik bir dizi analiz ligasyon sekanslarını değerlendirir. Elektroferogramları temiz ve tek bir immünoglobülin dizisine karşılık gelmelidir.
   Not: PCR ürünleri belirsiz ya da karışık immünoglobulin dizileri gösteriyorsa, izole dizileri almak ve sonra 9. adıma geçmek için, TopoTA sistemini kullanarak bunları klonlamak düşünün lütfen.

9. klonlanması ve Üretim IgG klonlarının ağır ve hafif zincirlerinin dizilenmesi

1. Vektörlerinin DNA 'nın 1 ug pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss- hazırlanmasıCLIg-HL2 ve pFUSEss-CHIg-HG1.
2. Uygun kısıtlama enzimleri ile bu gibi vektörler Digest. PFUSEss-CHIg-HG1 için kullanın Eco RI ve pFUSE2ss-CLIg-HL2 için pFUSE2ss-CLIg-hk, Eco RI ve Avr II BSI WI ve Eko UR ve NheI. Vektörün DNA 1 ug her bir sınırlama enzimi 3 adet kullanın.
   1. Tek enzim sindirimi ve bir PCR Arıtma Kit ile sindirilmiş ürünü arındırmak. İkinci enzim ile sindirimi ve (imalatçının protokolüne göre) göre bir Gel Extraction Kit ile saflaştırılması. Agaroz jelden ilgi fragmanını kesin. Adım 8.5 olarak agaroz jel hazırlayın.
3. Eko RI ve BSI WI kappa zincir amplifikasyonu için, Eko RI ve Avr II lambda zincir amplifikasyonu için, ve Eko RI ve Nhe ben ağır zincir yükseltilmesi için: üreten IgG klonu ^2. PCR ürünleri Digest. Bir enzim ile sindirimi ve P ile sindirilmiş ürünü saflaştırmakCR Arıtma Kiti. İkinci enzim sindirimi ve bir PCR Arıtma Kit ile sindirilmiş ürünü arındırmak. Adım 9.2 gibi enzimler ve DNA miktarı aynı birimleri kullanın.
4. T4 DNA ligaz 16 ° CO / N aşağıdaki üreticinin önerilerine vektörlerin iç PCR parçaları Arter. 1 olmalıdır Kullanılan oran: 2 (vektör: insert).
5. DH5α bakterilerini transforme etmek için ligasyon 1 ul kullanın. Dönüşüm DH5α üreticinin 'koşullarını uyun. Olarak kullanılan vektör tipine bağlı olarak, blasticidin ve zeosin levhalarda bakterileri. 37 ° C'de plakalar O / N inkübe edin.
6. Üreticinin talimatlarını izleyerek, tek koloniler büyür ve miniprep kiti ile DNA ayıklayın. Tek koloni için kullanın büyümek ve DNA DNA miniprep kiti üreticinin, öneriler ekstraksiyon. Adım 9.2 ve 9.3 olarak vektörler ve ekler hazırlanması için kullanılan enzimleri ile sindirme ile analiz eder.
7. Sekans DNA usin görevektör g 100 ng adımlar 8.8 ve 8.9 de yapıldığı gibi.

HEK hücreleri Antikorların 10. Üretim

1. 150 mm'lik bir hücre kültür plakasına% 75 konfluansa kadar 10% fetal buzağı serumu,% 1 L-glükoz,% 1 penisilin / streptavidin (DMEM +) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 'de HEK hücreleri büyütün. Bir kaputu gerçekleştirin 10,1-10,7 adımları.
2. Transfeksiyondan önce, fetal buzağı serumu olmadan önceki gibi ancak orta orta değişimi.
3. Her bir ağır hafif zincir Transfeksiyon için, (PEI (serumsuz) DMEM, 2.5 ml, ağır zincirli vektör 9 ug, hafif zincir ile vektörün 6 ug ve polietilenimin, 100 ul bir transfeksiyon karışımı hazırlamak 1 ug / ml stok) çözeltisi (). 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Yavaşça plakadaki HEK hücrelerine aşama 10.3 hazırlanan transfeksiyon karışımı 2.5 ml ekleyin. Homojen dağıtmak için plakayı sallayın.
5. Içinde24 saat boyunca% 5 _CO2 37 ° C'de inkübatör hücrelerin cubate.
6. Fetal buzağı serumsuz ortama kültür ortamı değiştirin.
7. 4 gün sonra plakaları orta toplayın.
   Not: ortam antikorlar, in vitro ve in vivo olarak reaktifliklerini karakterize etmek için kullanılabilir.

CD22 ve IgG pozitif hücrelerin boyanması sonrası ayırma yolluk, Şekil 1 'de gösterilmiştir, bu görüntü, çift pozitif hücrelerin alanı -. IgG antikorları üreten B hücrelerinin - Ayrı bir tüp içinde bu hücreler sıralamak için seçilir. Analizde, toplam PBMC'lerin yaklaşık% 1'i bu çifte pozitif nüfusa karşılık gelmektedir. Elde edilen kriteri hücrelerin sayısı Bölüm 1 'de elde edilen hücrelerin sayısına bağlıdır.

EBV ölümsüzleşme ve CpG (ODN2006) uyaranların 5 hafta sonra farklı sonuçlar, Şekil 2'de gösterilmiştir büyüyen klonlar tespit kolaydır.; Wi38 besleyici hücreler daha uzun fibroblast şekline sahiptir ve B hücresi klonları yuvarlak tabanlı çok oyuklu plakanın ortasında kümelenmiş büyüyen çok küçük yuvarlak hücrelerin görünür. Bu aşamada, bazı klonlar büyüyen başlangıç ​​belirgindir. Ancak, büyüme hızı kuyuları contai bazı değişken olabilir ve tabii edebilirsinizning hücreleri hiç büyüyen herhangi bir hücre olmayabilir ölümsüzleştirdi.

büyüyen klonlar yüzer Tablo 2'de gösterildiği gibi, IgG saptanması için bir ELISA'da test edilmiştir. Bu ELISA IgG için standart bir eğriyi test edilir birlikte klonlar ve boşlukları süpernatant ile. ELISA değer boş değeri üzerinden 3 standart sapma olduğunda pozitif klon olarak kabul edilir. Negatif klonları değerleri işlenmemiş 3 standart sapma altındadır. Teyidi için, pozitif klonlar, aynı klonun farklı süpernatanlarında en az üç kez ELISA pozitif ve ek bir tarama yöntemiyle belirlenmiş mümkünse olmalıdır.

Bu yazıda tarif edilen adımlar uygulanarak elde edilen bir insan IgG antikorunun tam sekansı, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu sekans, bir klonal genişletilmiş B hücresinden immünoglobulin ağır ve lambda zincir çiftinin klonlanmasıyla elde edilmiştir. Değişken birnd, ağır ve hafif zincir sabit bölgeleri, bu teknik ile karakterize edilebilir. Dizileri elde edildikten sonra, antikorlar, diziler klonlanabilir ve HEK hücre kültürlerinde in vitro koşullarda üretilen.

Şekil 1. Akış CD22 + ve IgG, insan periferal kan tek-çekirdekli hücrelerden + hücreleri sitometrik analizi. (A), canlı hücre nüfusunun seçimi P1 'de gösterilmiştir. (B), İleri saçılma grafiğidir. (C) boyutu dağılım grafiğidir. (D) Y ekseni anti-CD22-PerCP tarafından IgG-PE ile ayrılmış X ekseninde ayrılan hücreler gösterir. P4 kare (CD22 +, IgG +) sıralanır ve kültürü için geri getirildi hücre fraksiyonu gösterir. Bu fi büyük halini görmek için tıklayınızşekil.

Şekil B hücresinin 2. Örnek görüntü kültürünün 5 hafta sonra, 96 gözlü bir plaka klonları ölümsüzleştirilmiş. Bu iyi hiçbir ölümsüzleşme (A) 5 hafta sonra gözlendi, ancak WI38 ışınlanmış besleyici hücreler gözlenebilir. (B) yavaş büyüyen klon ortasında küçük yuvarlak agrega ile de bu gözlendi. (C) Hızlı büyüyen klon ölümsüzleştirdi B hücrelerinin agrega yuvarlak gösteren. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Insan immortalize B hücre klonu, F5 ağır ve hafif zincir çiftinin Şekil 3. İnsan antikoru dizileriV CDR1, CDR2'yi ve CDR3 dizilerinin belirten .2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ELISA ile IgG tarama Tablo 2. Örnek ile sonuçlanır. Klon yüzey maddeleri, A1-A10, B1-B10, C1-C10, D1-D10, E1-E10, F1-F10 bulunmaktadır. G1-G12 ve H1-H12: Boşluklar A11, B11, C11, D11, E11, F11, A12, B12, C12, D12, E12, F12.Standard eğrisi yineleniyor vardır. Her iki kopya halinde immünoglobülin karşılık gelen konsantrasyonu below.Positive veya IgG üreten klonlar koyu gri gösterilmiştir gösterilmiştir. Negatif veya non-IgG üreten klonlar açık gri gösterilir

Bu yazıda, insanlara özgü PBMCs'den elde IgG antikorlarının üretilmesi için tüm adımları ayrıntılı bir şekilde sunulmaktadır. Bu protokol daha önce yayınlanmış tekniklere göre bazı avantajlara sahiptir. Avantajlarından biri üretilen antikor B hücresi klonu orijinal çiftine karşılık gelen ağır ve hafif zincirleri tutmasıdır. IgG antikorlarının tanımlanması insan vericinin her türlü yapılabilir, ve aşı ⁵ nedeniyle bağışıklık tepkisi alevlenme için bir ihtiyaç vardır. bir besleme hücresi olarak fıbroblast hücre hattı WI38 kullanımı, daha önce tarif edilen çalışmalar besleyici hücreler olarak kullanılan PBMC'ler ile karşılaştırıldığında, morfolojik olarak farklı ve ayırt etmek için çok kolay olduğu için, büyüyen klonlar daha hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar ^{1,6- 8.} Ayrıca besleyici hücre olarak WI38 kullanımı kolay, her deneyden önce çözülmeli ve kültürlü olabilir hücre alikotları büyük miktarlarda donmasını yanadır.

Crit biriBu protokol ical adımlar başlangıç ​​malzemesi: PBMC'ler. Kan santrifüj için çok uzun süre bekleyen olmuşsa, ya da PBMC'lerin çekimi sonrasında, uygun dondurucu koşullarda saklanmaz; canlı hücreler gibi sayısı elde klonlar üreten B hücresi IgG sayısı ile birlikte, azaltılabilir gibi. Bu nedenle, erken çıkarma ve PBMC'lerin iyi korunması için başarılı bir sonuç için tavsiye edilir. IgG üreten klonların sayısı, deneyin başlangıcında PBMC'ler sayısı ile sınırlı olacaktır. PBMC'lerin Yüksek sayılar IgG üreten klonlar ve çeşitli antikor üretimi yüksek sayıda verecektir. Bir başka önemli bir adım antikorunun hafif ve ağır zincirlerin PCR fragmanlarının klonlanması olup. Ligasyon birkaç denemeden sonra başarılı değilse, bir TopoTA sisteminde ^2. PCR ürünü klonlama fazladan bir adım önerilir. Uygun enzimler ile insertin sindirimi daha kolay olabilirpFUSEss sentezleme vektörlerinde takip eden bir ligasyon için TopoTA vektörü içinde.

Bu teknik, insan B hücreleri, ³ zenginleştirilmiş edildiği insan dokusunun her türlü aktarılabilir. Aynı zamanda, sadece PCR için Primer tasarımı ve ifade vektörleri (IgM, IgE, IgA ya karşı antikorlar IgD) sıralamak için kullanılan etiketli antikorlar değiştirerek, immünoglobülin diğer tip çalışma uygulanabilir. Bu immünoglobülin çalışmalar, diğerlerinin yanı sıra anlamak için ilgi ilk bağışıklık tepkilerinin, mukoza antikor sekresyonu ve alerji profilleri olabilir.

Sonuç olarak, insan immünoglobulin ağır ve hafif zincir çifti olduğu gibi bırakır, insan rekombinant monoklonal IgG antikorları üretilmesi için bir teknik tarif edilmiştir. teknik yararlı bir kan örneğinden başlayarak gerçekleştirmek için kolaydır. Bu yöntemle elde edilen monoklonal antikorlar, insan bağışıklık ile ilgili çalışmalarda potansiyel olarak yararlıdıryanıtları. Ayrıca, bu yöntemle üretilen monoklonal antikorlar, farklı patolojik durum için immüno-terapötik maddelerin geliştirilmesi için iyi bir başlangıç ​​noktası olabilir.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Araştırma sözleşmesi Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) (GN-G.). Bilimsel Araştırmalar "Translational Neuroscience Programı Enstitüsü" Hollanda Teşkilatı (022005019) (CH) den Kardeşliği.

Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ve Ortaklık Française contre les Miyopatiler için hibeler (PM-M.); yanı sıra Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü bir Veni Bursu (916.10.148) Hollanda Beyin Vakfı burs ile (FS2008 (1) -28) ve ML Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ( ).

Biz flow sitometri göre sıralama B-hücresi ona yardım için Jozien Jaspers teşekkür ederiz.