Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade

Ontojenliği sırasında inhibitör GABA'erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA _A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik.

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABA_A receptors (GABA_ARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.

During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABA_ARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.

To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABA_AR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABA_AR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABA_ARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

GABA en bol uyarıcı nörotransmiter glutamat ¹ önceki embriyonik beyinde bulunan erken nörotransmitterlerin biridir. Gelişimi sırasında, GABA eksitotoksisiteyi yaratmadan hücre çoğalması, göç ve nöral ağların oluşumunu düzenleyen önemli bir rol oynayan, olgunlaşmamış nöronlar depolarizes ve heyecanlandırıyor. Yetişkin beyin GABA _A reseptör kanalları için olan ters potansiyel nedeniyle klorid hücre içi konsantrasyonundaki bir azalma daha negatif potansiyellere kaydırılır. Bu değişim, paralel, yukarı-regülasyonu hücre dışına klorür taşımaları potasyum klorür ko-transporter (KCC2), ve neden, ve aşağı regülasyonu olan sodyum-potasyum klorür transporter (NKCC1), ve ters etkisi ^2.

Beyinde, GABA, esas olarak, hızlı veya yavaş sinaptik önlenmesine aracılık eder GABA _A ya da _GABAB ya reseptörlerine, ilgili bağlananly. GABA _A TL ayrıca heteropentamerik iyonotropik veya ligand-kapılı Cys-köprüsü iyon kanalları olarak da bilinen reseptörlerinin bir sınıfıdır. GABA iki molekül, bikarbonat iyonları, klorür iyonlarının ve daha düşük bir dereceye kadar geçirgen olan reseptörün aktivasyonu için gereklidir. Klorit iletimindeki artış sinaptik sonrası nöronu ³ aktive edilmesinde depolarize edici, uyarıcı etkinlikleri etkinliğini azaltmaktadır.

GABA _A Rs yapısal çeşitlilik uzun fonksiyonel ve farmakolojik özellikleri onların geniş belirlemede önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Ortak olan α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ ve θ ^3: Doğal GABA _A TL olarak sınıflandırılan çok sayıda izoformları ile alt üniteden oluşan hetero pentamerler olan Büyük bir N-terminali hücre-dışı alanını, dört transmembran (TM) ve TM'lerin 3 ve 4 ⁴ arasında büyük bir hücre içi alanı içeren zar topolojisi.Bu alt birimlerinin genetik silinmesini taşıyan fareler doğumdan ^5,6 sonra ölmek için β3 ve γ2 alt birimleri, sinaptik inhibisyonu ve organizma hayatta kalmak için gerekli. Bunun aksine, α alt birimi tek tek izoformları, anksiyete, sedasyon, uyarılma ve diğerleri gibi farklı davranışlar ile bağlantılı beyin özel sinaptik bağlantıların fonksiyonu için önemli olan, fakat, ayrı ayrı, yaşam ^7-9 için gerekli değildir. GABA _A Rs güçlü sedatif, hipnotik, anksiyolitik ve benzodiazepinler, barbitüratlar, nörosteroidler ve anestezik ^7,10,11 gibi antikonvülzan etkileri ile ilaçların çeşitli eylem ana yerleridir.

Sinaptik GABA _A TL tipik olarak γ2 altbirim (en yaygın β2 veya β3) iki β alt birimi ve iki α alt birimi (α1, α2, α3 veya α5) ^12,13 ihtiva etmektedir. Extra-sinaptik reseptörlerinin baskın sınıfı, kombinasyon halinde δ alt ünitesinden oluşurİki α-birimden (α4 veya α6) ve iki β alt birimlerine (β2 veya ^{β3), 14} ile. Plazma zarına aksonlar, dendrit ya soma ve sokulmasından _GABAA Rs alt hücre lokalizasyonu, β-alt-birimlerinin ^15,16 varlığına bağlıdır. Ancak, farklı GABA _A R seçici eklenmesi spesifik α alt birimden (α1, α2, α3 veya α5) ^7,17,18 varlığı ile iyi korelasyon sinapsların farklı türlerde alt tipleri. Önemlisi, farelerde α1 veya α2 alt biriminin silinmesi inhibitör sinapsların ¹⁹ de ultrastrüktürel değişikliklere neden olur. Bu GABA _A sinaps oluşumunu düzenleyen doğrudan bir rol oynayabileceğini kendilerini rs düşündürmektedir.

Kanıt GABA'erjik sinaps gelişimi nöronal hedefleri de farklı inhibitör akson türleri ve öbeklendirilmiştir reseptörleri tarafından temas eden olaylar hassas bir şekilde koordine dizisi olduğunu gösteririnhibitör sinaps her sınıf seçici ve ^17,20-22 işlevsel alıştırılır. GABA'erjik sinaps spesifisitesinin temel ilke öncesi ve postsinaptik ortakları sinaptik bağlantıları başlatılması sırasında birbirini tanımasını nasıl olduğu sorusunu gündeme getirmektedir.

İn vitro ko-kültür deneyleri, sinaps oluşumu bazı mekanizmaların çalışma ve bu işlem tek tek sinaptik geçişli proteinlerin rolünü test etmek için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Sinaps oluşumu ve olgunlaşması aracılık ettiği iki-yönlü olarak işlev gören ortak bir şekilde trans-sinaptik etkileşimli protein kombinasyonlarının biri Neurexins (Nrxns) ve Neuroligins (NLS) bulunmaktadır. Nrxns çok farklı izoform ²³ sebebiyet veren kendi laminin neurexin-seks hormonu bağlayıcı protein alanları içindeki alternatif birleştirme sergileyen presinaptik proteinlerdir. Nrxns başka proteinlerle de etkileşime giren birlikte, NLS bunların her yerde postsinaptik pa olduğu düşünülmektedir²⁴ rtners. Birlikte bu proteinler yakın ve sert appozisyonun ²⁵ presinaptik ve postsinaptik membranlar tutarak katkıda bulunur. En bol iki izoformu uyarıcı ve inhibitör sinaps, sırasıyla ²⁶ mevcut olan NL-1 ve NL-2 bulunmaktadır. Trans-sinaptik protein etkileşimlerini incelemek üzere tasarlanmış ilk ko-kültür modeli sistemlerinde biri, nöronal olmayan hücrelerin farklı kullanılan, örneğin aşırı ifade NL- üzere, insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri gibi en yaygın olarak ölümsüz hücre çizgileri 2. Bu hücreler pontin nöronlarla kültürlenmiştir zaman, HEK hücre yüzeyine yakın presinaptik protein birikimi sinaps benzeri kontaktların oluşumunu gösteren gözlenmiştir. Bu ko-kültürlerde çözünebilir β-neurexin ilavesi Nrxns ve UL'lere arasında, trans-sinaptik etkileşimleri sinaptik iletişim oluşumu ²⁷ için gerekli olduğunu düşündürmektedir temas oluşumunu inhibe etmiştir. Ayrıca, geçici sentezlemeCOS β-neurexin ayrışan hipokampal glutamaterjik ve GABAerjik nöronlar postsinaptik proteini gephryin ve GABA _{A, R'nin} alt birimlerinin ile uyarılan ifadesi, birlikte kültürlenmiş bir (Cı V-1 (O rigin olarak) maymun ve S V40, genetik malzeme taşıyan), hücrelerin Bu iki hücre tiplerinde ²⁸ arasındaki temas noktalarında γ2 ve α2. Sinaps oluşumunu araştırmak için kullanılan bir ko-kültür modeli başka örnek geçici GABA _A R ile α2 / β3 / γ2 ve NL-2 ve hipotalamus nöronları ²⁹ karışık bir nüfus alt birimleri transfekte HEK293 hücrelerinin, çıkıyor. Bu çalışma, NL-2'nin ifadesi önleyici sinaps oluşumu için mutlak bir gereklilik olduğu sonucuna varıldı.

Ancak, son ko-kültür çalışmasında, stabil olarak aktarılan α1 / β2 / γ2 GABA _A HEK293 hücrelerinde TL fonksiyonel sinaps oluşturmak için yeterli olduğu bulunmuştur birlikte kültüre edildiğinde, GABAerjik MedEk-trans-sinaptik ya da sinaps sonrası yapışma proteinleri için gerek kalmadan yum dikenli nöronlar. NL-2 GABA _A Rs ³⁰ ile birlikte eksprese edilmiştir, ancak, sinaps oluşumu ve mukavemetinde önemli bir artış gözlenmiştir. Bu, bu ko-kültürü modeli sistemi, daha önce tarif edildiği model sistemler, en açık artan bir hassasiyet ve sinaptik kontak algılama güvenilirliği üzerinde avantajlara sahip olduğunu göstermektedir. Sinaptik temasların saptanmasında genel iyileşmeye katkıda bulunan iki önemli faktörler şunlardır: i), ayrı ayrı hücrelerin yüzeyi GABA _{A, Rt} alt-birimlerinin yüksek ve tutarlı bir ifade ile stabil olarak transfekte edilmiş HEK 293 hücre çizgilerinin kullanılması. Bu tutarlılık, farklı ko-kültür koşulları arasındaki nicel karşılaştırmalar kolaylaştırır. ii) embriyonik striatuma ³¹ kültüre GABA'erjik orta dikenli bir nöron saf nüfusun kullanımı allo komplikasyonları ve karışık nöronal nüfus ve kullanımından kaynaklanan belirsizlikleri kaldırırsi, örneğin, sinaps oluşumu sırasında birbiriyle mukayese edilebilir, en uygun olan, postsinaptik GABA _{A, R'nin} tiplerinin tespiti.

Sinaps oluşumu öncesi ve postsinaptik hücre yapışması komplekslerinin içinde birçok trans-sinaptik sinyalleri içerdiği düşünülmektedir. Nedeniyle sinaptik sinyalleri ve hücre adezyon moleküllerinin sırf sayılar çift yönlü doğası, bu sinaps oluşumunda yer alan temel bileşenleri tespit etmek zordur. Bu nedenle, bir nöronal olmayan hücre içine tek bir hücre yapışma proteini transfekte (bu durumda, in vivo, GABAerjik orta spinal nöronların için iki en yaygın post-sinaptik hedefler, α1 / β2 / γ2 veya α1 / β3 / γ2 GABA _A TL ^32), büyük ölçüde postsinaptik yüzeyde temin şekilde trans-sinaptik sinyallerin karmaşıklığını azaltır ve sinaps oluşmasını teşvik bu proteinin etkinliğini hassas analiz edilmesine olanak sağlamıştır.

Sprague-Dawley sıçan ya da BAB / c kendilenmiş fareler; İngiltere Home Office [ve 24 Kasım 1986 Avrupa Toplulukları Konseyi direktifine göre muhafaza ve öldürüldü (Harlan, UK kullanılan hamile kadın sayısı 30 idi) (86/609 / EEC) ] kurallar. Proje resmen Eczane Etik Kurulu UCL School tarafından onaylandı.

Instruments, Kültür Orta ve Yemekleri 1. Hazırlık

1. Açın ve her zaman steril koşullar altında çalışmak için% 70 etanol ile laminer akış temizleyin.
2. (, L-glutamin (2 mM), penisilin (50 birim / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve fetal sığır serumu Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı pH 7.4 (DMEM, 500 mi) ihtiva eden 10 HEK 293 hücre kültürü ortamı hazırlayın %).
   NOT: penisilin ve streptomisin tahriş edicidir.
3. Neuro temelli vasat pH 7.4 (500 mi), B27 eki (25 mi), L-glutamin (2 mM), penisilin içeren, serumsuz nöronal kültür ortamının hazırlanması(50 birim / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve glükoz (6 mm).
4. HBSS 10x stoklar (50 mi), HEPES (1 M) (5 mi) ve su (445 mi), pH 7.4 ihtiva eden HEPES-tamponlu tuz çözeltisi (HBSS), 500 ml, hazırlayın.
5. Otoklav, fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS, pH 7.4; 1 L), su (1 L) ile, cam lamel (çapı 13 mm), sterilize edilmeleri için cam Pasteur pipet.

HEK293 Kararlı Hücre Hattı 2. Hazırlık α1 / β3 / γ2-GABA _A R'leri ifade

1. 10 cm'lik bir steril doku kültür levhası içine levhalar 2x10 ⁶ HEK293 hücreleri ve gece boyunca% 70-90 konfluent ulaşmak için, bir nemlendirilmiş% 5 karbon dioksit _(CO2) atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С inkübe edin.
2. Ertesi gün, G418 disülfatın (Tablo 1) direnç geni içeren pcDN 3,1 ⁽⁺⁾ sentezleme vektörü içinde, GABA _{A, R'nin} α1 alt-birim cDNA'sı ile HEK293 hücrelerinin transfeksiyonuve fleomisin D1 içeren sentezleme vektörü içinde, GABA _{A, R'nin} β3 alt-birim cDNA'sı (Tablo 1) direnç geni (her ikisi de bir insan sitomegalovirüs hemen-erken (CMV) promoterinin regülasyonu altında) ile negatif bir kompleksleri, katyonik lipozom formülasyonu kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak şarj edilmiş nükleik asit molekülleri (Tablo 1).
3. (PH 7.4; Tablo 1) Kısaca, bu olmaksızın düşük serum ortamında 500 ul ekleyin ve 7.5 ug cDNA, lipozomal transfeksiyon tamponlama reajanı 15 ul ve ardından steril bir 15 ml santrifüj tüpüne, için yapımı, ve yavaşça oda sıcaklığında ayrılmadan önce karıştırın, her 5 dak.
4. Bu karışıma, lipozomal transfeksiyon ayıracı 8.75 ul ekleyin ve yavaşça 30 dakika boyunca oda sıcaklığında ayrılmadan önce karıştırılır. Bundan sonra, (antibiyotikler olmadan) HEK 293 hücre kültürü ortamı içinde 3 ml ilave iki kez yukarı ve aşağı transfeksiyonunun santrifüj tüpünün içeriği pipetR, damla damla 10 cm'lik bir doku kültürü çanağı içinde büyüyen hücreler üzerine ve nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С C'de 48 saat boyunca inkübe edilir.
5. Aşağıdaki oranlarda, steril PBS, pH 7.4 ile hafifçe HEK293 hücrelerinin yıkayın ve yeni 10 cm'lik doku kültür tabakları içine transfekte edilmiş HEK293 hücreleri sulandırmak: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 ve 01:20. Bu, hücrelerin aşırı konfluent hale garanti eder.
6. Kültür ortamı, her antibiyotik seçim işaretleyicinin, G418, ve fleomisin D1 800 ug / ml ekleyerek, GABA _{A, R'nin} alt birimleri hem de ifade eden HEK293 hücrelerinin seçimini başlatın. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С hücreleri inkübe ve antibiyotik içeren ortam (10 mi) her 2 günde bir değiştirin.
7. Küçük beyaz koloniler (genellikle yaklaşık 7 gün sonra) oluşmaya başladığında, dikkatle yemekler her birinden tek bir koloni seçin ve steril P1000 kullanarak toplamakpipet ucu. Aşağı yukarı orta pipetleme tekrar süspansiyon dikkatli bir şekilde 500 orta ul ihtiva eden 24 oyuklu doku kültürü plakası, bir oyuğuna aktarın. Tam bir koloni (5-20 koloni toplam tavsiye edilir) her aktarılır emin olun. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С hücreleri inkübe ve antibiyotik içeren ortam her 2 günde bir değiştirin.
8. Koloniler,% 70-80 konfluent hale sonra, yavaşça, 24 oyuklu doku kültür plakasının altından hücreleri çıkarmak için aşağı ve yukarı orta pipetle. Aktarın ve bir 6-yuvalı doku kültürü plakasında 2 oyuklar arasındaki hücre süspansiyonu bölün. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С hücreleri inkübe ve antibiyotik içeren ortam her 2 günde bir değiştirin.
9. 70 kere -% 80 birleşmiş, aynı tek kolon gelen hücreleri ihtiva eden 2 kuyu 1 hücreleri toplamaky ve hazırlanması, protein lizatlan. Kısaca, hücreler PBS, pH 7.4 ile 2 kat yıkama ve PBS, pH 7.4 içinde% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS), 200 ul ilave edin. Lizat toplayın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın. BCA protein reaktif kullanılarak protein konsantrasyonu ölçümü, üreticinin protokolüne uygun olarak (bakınız Tablo 1). Bu ilgili bilgi için Tablo 1 'e bakınız SDS / PAGE ile GABA _A reseptörlerinin α1 ve β3 altbirimin ekspresyonunu analiz eder ve (tavşan anti-α1-spesifik ve tavşan anti-β3-özel GABA _{A, R'nin} antikorlar alt biriminin spesifik antikorlar kullanılarak bağışıklık-boyamasıyla antikorlar).
10. Yerinden oynatılır ve büyük 6 cm doku kültür tabaklarına geri kalan gözlere sadece pozitif klonları aktarın. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С hücreleri inkübe ve antibiyotik içeren ortam her 2 günde bir değiştirin.
11. Yavaş yavaş hücrelerin u kolonileri genişletmek10 cm doku kültür tabaklarına ve son olarak, doku kültür şişeleri (T-75 şişeler) aktararak antibiyotik seçimi nder. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С hücreleri inkübe ve antibiyotik içeren ortam her 2 günde bir değiştirin.
12. Cam lameller üzerine her bir koloniden 70,000 hücre (çapı 13 mm) levha ve bağışıklık GABA _{A, R'nin} alt ünitelerinin hücre yüzey ifadesi ve ko-lokalizasyonunu analiz etmek için hücrelerin tespit edilmeleri.
13. (10 cm'lik bir steril doku kültür kabı içine, GABA _A reseptörleri, levha 2 x 10 ⁶ hücre hem α1 ve β3 alt-birimlerinin yüksek seviyelerde ifade eden HEK293 hücrelerinde pozitif klon seçmek ve nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° С inkübe _CO2 kuluçka makinesinde) gece boyunca karıştırılmıştır. Hücreler her zaman antibiyotik içeren (G418 ve fleomisin D1) ortam içinde inkübe edilir emin olun.
14. Ertesi gün, HEK transfekteGABA _A R 293 hücreleri pcDNA ™ 3,1 ⁽⁺⁾ olmayan bir lipozom lipit transfeksiyon reaktifı (Tablo 1) kullanılarak Higromisin B direnç geni içeren sentezleme vektörüne alt-birim cDNA'sı γ2s.
    Not: Bu transfeksiyon yöntemi daha iyi hayatta kalma ve antibiyotikler ile sürekli seçimi altında, yavaş büyüyen stabil hücre hatlarında yabancı proteinlerin yüksek ekspresyon verim sağlar.
15. Steril bir 15 ml santrifüj tüpü içinde, 250 Arttırıcının ul DNA yoğunlaştırma tamponu (Tablo 1) ve γ2s GABA 1.4 ug _bir reseptör alt-birim cDNA'sı ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında ayrılmadan önce 1 saniye 11.2 Arttırıcının ul ve vorteks ekleyin.
16. 10 dakika oda sıcaklığında ayrılmadan önce 10 sn için olmayan lipozomal lipit transfeksiyon reaktifı ve vorteks 35 ul ekle. G418 / fleomisin, D1-ihtiva eden ortam 3 ml ilave edilir ve iki kez 'den önce yukarı ve aşağı santrifüj tüpünün içeriği pipetcevher 10 cm'lik bir doku kültürü plakasında yetişen hücreler üzerine damla damla havale edilmesi. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С C'de 48 saat boyunca kuluçkaya bırakılır.
17. Aşağıdaki oranlarda, steril PBS ile yavaşça hücreler yıkanır ve yeni bir 10 cm'lik doku kültür tabakları içine seyreltilmesi: 3, 1: 5: 1, 1: 7, 1:10, 1:15 ve 1:20.
18. Γ2s alt-birimini eksprese / β3-HEK293 hücreleri / fleomisin ortam, D1-içeren G418 antibiyotik seçim marker Higromisin B 800 ug / ml ekleyerek α1 seçimi başlatın. Taze G418'e / fleomisin D1 / Higromisin B ihtiva eden bir ortamda (10 mi) 2 günde bir ile eski orta değiştirin.
19. Tekrar G418 içinde sürekli seçim altında, 2,7-2,12 adımları / fleomisin D1 / Hygromycin hücre kültür ortamı B içeren.
20. Antibiyotik içermeyen hücre kültür ortamı ve ileride kullanılmak üzere% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 140 ° C 'de, pozitif klonları saklayın.
21. Seviyesini testifadesi nedeniyle antibiyotik seçimi altında hücrelerin düşük hayatta kalma değiştirebilirsiniz çünkü ve α1, β3 ifade, defrost aşağıdaki her klondaki imünoblotlama ve imünofluoresans ile GABA _A R altbirimden γ2s.

HEK293 Hücre Hatları 3. Bakım

1. Bir 15 ml'lik steril bir hücre kültür ortamı, 10 ml (yukarıda tarif edilmiştir) kontrol HEK293 hücrelerinde bir şişe ya da bu ifade α1 ya / β2 / γ2-GABA _A Rs (Tablo 1) veya α1 / β3 / γ2-GABA _A Rs Defrost santrifüj tüpü. 5 dakika boyunca 440 x g'de santrifüjleyin fazla DMSO çıkarıldı.
2. Taze hücre kültürü ortamı, 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
3. İlk olarak, poli-D-lisin (0,1 mg / ml) ve yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler daha sonra 1 ml ile kaplanmış bir 10 cm'lik doku kültür tabağına taze hücre kültürü ortamı 9 ilave edin. , Yan-yana, yavaşça karıştırın hücrelerin dağıtılması ve nemlendirilmiş bir 37 ° С inkübe% 5 CO ₂ atmosfer (CO ₂ inkübatör).
4. Ertesi gün, her hücre artıklarının çıkarılması ve taze HEK 293 hücre kültürü ortamı, 10 ml değiştirmek için orta aspire.
5. GABA _{A, R'nin} alt birimlerini ifade eden ve bu nedenle de antibiyotik direnci markerlerin ifadesi eksikliği olmayan herhangi hücreleri çıkarmak için antibiyotik kararlı hücre çizgileri seçin. Α1 / β2 / γ2 dengeli bir hücre hattı için, G418 (800 ug / ml) ihtiva eden taze bir hücre kültür ortamı, normal orta yerine. Α1 / β3 / γ2 hücre çizgisi için, yeni bir hücre kültür ortamı, G418 (800 ug / ml) ihtiva eden yerine, fleomisin D1 (800 ug / ml) ve Higromisin B (800 ug / ml). DİKKAT G418'e tahriş edicidir ve Higromisin B, korozif, toksik ve tahriş edicidir.
6. Geçiş düşük yoğunlukta ekim ile yeni bir doku kültürü kabı içine hücreler>% 70 ortak akışkanlığa elde kez. Aspire 10 hücre kültür ortamı ile yıkanır ve kısa süreyle iki kez yıkayınPBS, pH 7.4 ile yıkanır. 1 tripsin-EDTA çözeltisi, proteaz tripsin çözeltisi (% 0.05 tripsin) ve PBS içinde bir Ca ^{2 +} kenetleme maddesi EDTA (% 0.02), pH 7.4, çanak hücreleri ayırmak için bir mi. DİKKAT Tripsin-EDTA ekleyin çözüm tahriş edicidir.
7. Kabına doğru antibiyotikleri ihtiva eden hücre kültür ortamı, 10 ml ilave edilir ve hücreler aspire. 5 dakika boyunca 440 x g'de santrifüj hücreleri ve hücre kültür ortamı, 5 ml bunları tekrar süspansiyon.
8. Geçiş Taze hücre kültür ortamı ve uygun antibiyotikleri içeren yeni bir doku kültür şişesine (T-75 balon) içine 1:10 seyreltme kullanılarak hücreler. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С hücreleri inkübe ve ortam her iki günde bir değiştirin. Passage hücreler zaman>% 70 konfluent (adım 2.8 bakınız).

GABA'erjik Orta Dikenli Nöron Kültürü 4. hazırlanması

1. Steril koşullar altında, bir 24-Hazırlamakpoli-L-lisin (0.1 mg / ml) ile II plaka lamelleri -kaplı (çapı 13 mm) nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С inkübe edin.
2. Ertesi gün, aspirat bir pipet ile aşırı poli-L-lisin ve iki kısa 10 sn için ve steril su ile ve iki adet 5 dakika uzun yıkamalar ile lamelleri yıkayın. Gece boyunca laminin (0.01 mg / ml) ilave edilir ve nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С inkübe edin.
3. % 70 etanol ile diseksiyon alanı dezenfekte ve kavisli ve düz doku forseps, makas ve cımbız gibi diseksiyon araçları bir dizi toplamak ve tam diseksiyon aletleri sterilize etmek için% 70 etanol içine koyun.
4. Sırtında CO ₂ ile ötenazi gebe sıçan / fare yerleştirin ve% 70 etanol ile karın cildi temizleyin. Iç organları ve rahim ortaya çıkarmak için, cımbız ile cilt sıkın ve cilt, kas ve karın zarı aracılığıyla karın çevresinde kestiaçıkça embriyolar ile. Rahimden embriyolar (E16-17) ayıklayın ve soğutulmuş PBS ile bir Petri kabı koyun.
5. Laminar akış başlığı içinde embriyolar yerleştirin ve soğutulmuş HBSS ile yeni bir Petri kabındaki kafaları toplanması, bunları başını kesmek.
6. Bir mikroskop altında, kavisli ve düz forseps kullanarak beynini teşrih. Soğutulmuş HBSS içeren yeni bir Petri kabı içine beyinleri yerleştirin.
7. İki yarımküreleri ayırın ve dikkatle meninksler kaldırmak. Hipokampus hattı boyunca kesilir ve striatum ortaya korteksi geri soyma. Yarımkürenin ön bir çizgili beyaz bir yapı olarak striatum gözlemleyin.
8. Striatum ayır ve çok küçük parçalar halinde kesilmiş (1 - 2 mm çapında) ve 1 ml'lik toplam hacmi steril bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne maddenin toplanması için bir ateş cilalı Pastör pipeti kullanılır. Yangın parlatma malzemesi zarar olmadan toplanır sağlar.
9. Yangın cilalı ti kullanmaPasteur pipet p, hücreleri aspire ve onlara 8 bırakın - 10 kez. Homojen görünene kadar - 6 kez orijinal çapına (1 mm) yaklaşık% 30 bir yangın lehçe ucu ile yeni bir pipet alarak, çözüme bir daha 4 çiğnemek.
10. Yeni bir steril santrifüj tüpüne 100 mikron naylon hücre süzgecinden kullanarak hücreleri filtre.
11. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve 24 oyuklu doku kültür plakasına oyuk başına nöronal kültür ortamında 500 ul içinde 70,000 hücreler plaka. Oyuklar sağa ve in vitro (DIV), 14 gün boyunca nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С inkübasyona bırakıldı çalkalayın.
12. 7 gün sonra, sinir hücresi kültürlerinde saflığını kontrol etmek ve glia hücreleri mevcut ise, sitosin β-D-arabinosid ekleme (Ara-C, 5 uM) çukurlara bunların çoğalmasını durdurmak. Bunu yapmak için, her bir göze nöronal kültür ortamına (pH 7.4), 250 ul çıkarın ve taze ortam 250 ul ihtiva ekleing Ara-C. DİKKAT! Ara-C tahriş edicidir.

5. Co-kültür hazırlanması

1. Nöronal kültür gününde, 11 kat, steril koşullar altında poli-D-lisin (0.1 mg / ml) ile bir 6-yuvalı plaka ve nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С gece boyunca inkübe edilir.
2. Ertesi gün (nöronal kültürün gün 12), fazla poli-D-lisin aspire ve küçük bir miktarı ile kaplamak için (antibiyotiksiz) kuyu taze hücre kültür ortamı eklenerek önce steril su ile 5 dakika boyunca gözenekleri 2x kısa bir süre için ve 2x yıkayın ortamından serum.
3. Doku kültürü şişesi (T-75) içinde kültür ortamı aspire. Ca ^{2 +} 1 ml ilave edilmeden önce iki kez PBS ile yıkayın hücreleri / Mg2 ⁺ şelatlayıcı madde EDTA'dır yumuşak ve enzimatik olmayan hücreler ayırır (0.48 nM). Doku şişenin dibinde onları ayırmak için hücreleri çalkalayın.
4. (Hücre kültür ortamı içinde 10 ml ekleyinBu antibiyotikler) transfeksiyonu engel olabilir olmadan steril bir santrifüj tüpüne hücreleri ve yer aspire. Düşük hız tezgah üstü santrifüj kullanılarak 5 dakika 440 xg'de Pelet hücreleri.
5. Süpernatantı ve taze hücre kültürü ortamı, 1 ml süspansiyon hücreleri. Bir hemositometre kullanılarak, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına 3 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda hücreler ve plaka sayımı. Yavaşça karıştırın ve nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferi _(CO2 kuluçka makinesinde) 37 ° С, 24 saat süre ile inkübe edilir.
6. Ertesi gün (nöronal kültürün gün 13) geçici olarak lipozomal transfeksiyon ayıracı kullanılarak pcDNA3 sentezleme konstruktunda MCherry cDNA ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. Kısaca, steril mikrosantrifüj tüpü içinde, düşük serum ortamına 500 ul ve MCherry cDNA'nın 5 ug ekleyin. Lipozomal tamponlama reajanı 5 ul ekleyin ve yavaşça 5 dakika boyunca oda sıcaklığında ayrılmadan önce karıştırılır.
7. Lipozomal transfeksiyon Reag 8.75 ul ekleent ve yavaşça 30 dakika boyunca oda sıcaklığında ayrılmadan önce karıştırılır. _(CO2 kuluçka makinesinde) Transfer damla damla de 6-çukurlu doku kültür plakasında, her ve nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° С inkübe iki kez yukarı ve aşağı mikrosantrifüj tüpü içeriğini Pipet.
8. Ertesi gün (nöronal kültürün gün 14), 6-deliklerin her birinden HEK293 hücre kültür ortamı aspire edildi ve PBS (pH 7.4) her oyuk iki kez kısaca yıkayın. Ca2 ⁺ 300 ul ekle / Mg2 ⁺ şelatlayıcı madde, EDTA (0.48 mM) ve tripsin-EDTA, 200 ul (0,02-0,48 mM) her çözeltisi ve 5 dakika için 37 ° С inkübe edin.
9. Steril bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne müstakil hücreleri, oyuk başına taze HEK 293 hücre kültürü ortamı içinde 1 ml ilave edilir (bu, tripsin söndürür) ile aspire. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'de santrifüj hücreler çıkartıldı ve süpernatan. Nöronal kültür ortamına (pH 7.4) içinde 500 ul pelletini.
10. Bir hemasitometre kullanarak nöronları ihtiva eden bir 24-yuvalı doku kültürü plakasında kuyucuk başına 30,000 hücre olan bir yoğunlukta hücreleri ve tohum sayısı. 24 saat süre ile _(CO2 kuluçka makinesinde) hücreleri dağıtmak ve nemlendirilmiş% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° С ko-kültürler inkübasyona plaka çalkalayın.

Sinaptik Rehber ve Faaliyet 6. Analiz

1. Ko-kültür 23 saat sonra, GABAerjik orta spinal nöronların ve HEK 293 hücreleri bir floresan boya ile konjuge edilmiş anti-synaptotagmin lümen alana özgü antikorun aktivitesi bağımlı alımını kullanarak arasında etkin 'kontaktların oluşumunu belirlemek (Cy5, Tablo 1 e bakınız) .
   NOT: antikor sadece synaptotagmin lümen etki, erişim kazanacaktır için sinaptik vezikül lümen ve hücre dışı alan arasında süreklilik olduğunda o bağlar hangi. Bu, özellikle, bu antib hale nörotransmitter açığa çıkmasıylaAktif presinaptik terminalleri mükemmel bir işaretleyici tanınabilir.
2. Ve nöronal ortam içinde 1:50 seyreltilmiş Cy5 etiketli fare anti-synaptotagmin antikoru (Neuro temelli bir ortam, pH 7.4) ilave etmek, İlk olarak nöronal ortamı ile ko-kültürler (Tablo 1 e bakınız bir ortam, pH 7.4, Neuro temelli) yıkayın Kültürler, 30 dakika karıştırıldı. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° С bu süre _(CO2 kuluçka makinesinde) boyunca kuluçkaya bırakılır.
3. Ko-kültürler yıkama, antikorun erişimi kaldırmak için üç defa kısaca: birinci, ikinci soğuk PBS (pH 7,4), 200 mM NaCI ihtiva eden, ve soğuk, normal PBS ile üçüncü bir soğuk normal bir PBS (pH 7.4) ile (pH 7.4)
4. Çalkalama ile 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz 300 ul (PFA, pH 7.4) ile hücrelerin sabitleyin. Iki uzun 10 dakika yıkama ile, sonra, PBS (pH 7.4) ile iki kez kısaca hücreleri yıkayın.
5. PFA söndürmek için çalkalama ile 10 dakika boyunca her bir göze glisin (0.3 M) eklenir.
6. Hücreleri yıkamak brieflY daha sonra iki kez PBS (pH 7.4) iki uzun 10 dakika yıkama ile birlikte spesifik olmayan bağlanmaların azaltmak için çözeltisi (a / h) inek serumu albümini (PBS içinde BSA), pH 7.4 içinde% 1 w () bloke 300 ul ilave edilmeden önce antikorlardır.
7. Engelleme çözeltisi aspire ve hint domuzu γ2 N terminal alanı ³³ karşı yönlendirilmiş bir anti-GABA _{A, R'nin-γ2} antikor ekleyin: gece boyunca 4 ° С de (1 PBS içinde 3000, pH 7.4) eklenmiştir.
8. Ertesi gün, kuyulardan aspire birincil antikor ve iki uzun 10 dk yıkama ile, sonra PBS ile iki kez kısaca hücreleri yıkayın.
9. Oda sıcaklığında 30 dakika için çözüm engelleme Triton X-100 (% 0.1) kullanılarak hücrelerin geçirgenliği.
10. Fare anti-glütamik asit dekarboksilaz ya da ilave edilmeden önce iki uzun 10 dakika yıkama ile, sonra, PBS (pH 7.4) ile iki kez kısaca hücrelerin yıkayın (GAD) 65 antikoru (1: 4000, Tablo 1) ya da fare anti-sinapsin I antikoru ( 1: 1000, oda ısısında tutulduktan 120 dakika için Tablo 1 ')emperature.
11. Iki uzun 10 dakika yıkama ile, sonra, PBS (pH 7.4) ile iki kez kısaca hücreleri yıkanır ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika için bloke etme çözeltisi ilave edin.
12. Santrifüj de antikorların toplamı çıkarmak için (tipik olarak 2 ug / ml'de Alexa Fluor 488 veya keçi anti-fare IgG ve Alexa Fluor 405, her konjuge anti guinea Cy5 konjüge edilmiş domuz IgG, keçi anti-fare IgG, keçi) uygun bir ikincil antikorlar çözümü engelleme için: 21.910 10 dakika xg ve antikorları (750 1) ekleyin. 1 saat uygun gözlerine ve ışık maruziyeti ve buna bağlı photobleaching gelen florosforlar korumak için alüminyum folyo ile kaplayın için geçerlidir.
13. Son olarak, herhangi bir bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak ve bağlantı ayıracı (Prolong, altın, Tablo 1) örtücü başına yaklaşık 10 ul kullanılarak lamelleri monte etmek için iki uzun 10 dakika yıkama ile, sonra, PBS (pH 7.4) ile iki kez kısaca hücreleri yıkayın. 4 aktarmadan önce ışıksız bir süre oda sıcaklığında ayarlamak için 24 saat VerenUzun süreli depolama için С °.
14. 63X yağ daldırma amacı ile bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak numunelerin analiz. Işık seviyelerini sağlamak ve dedektör kazanç doymasını önlemek için ayarlanır.
15. I ya da Cy5-etiketli anti-synaptotagmin sinapsin GAD65 pozitif presinaptik terminalleri ve DIC veya MCherry floresan indictor ile görselleştirilmiştir postsinaptik HEK293 hücreleri arasındaki eş-lokalizasyonu bölgeler gibi potansiyel sinaps-benzeri temas dikkate alınmalıdır.
16. Görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına 5 mikron - 4 derinlikte yoluyla - optik bölümleri (10 8) Z-yığın dizi kullanarak potansiyel sinaps gibi kişileri saymak.

Bu nöron-HEK 293 hücre ko-kültür model sistemi için protokol ince optimum hücre yaşamasına izin ayarlı olmuştur. Bu sistemde, sinaps benzeri kontaktların oluşumu ve analiz, bir işlevsel reseptörü içine monte üç GABA _{A, R'nin} alt birimlerinin sabit ve sürekli ekspresyonuna dayanır. Bu nöron kültürleri ile eklemeden önce, HEK293 hücre yüzeyinde alt birim ekspresyonunu test etmek için imüno sito kimyasal analiz kullanmak için önemlidir. Bu deneylerde, α1, β2 ve γ2 birimden (Şekil 1A) veya α1, β3 ve γ2 birimden (Şekil 1B), hücre yüzey ifadesi, bu alt-birimlerin hücre-dışı epitopuna bağlanabilir alt-spesifik antikorlar kullanılarak tespit edildi. HEK293 yüzeyinde, bu alt-birimleri arasında eş-lokalizasyonu yüksek derecede gösterilmiştir.

GABA _A yüzey ifadesi ve ko-lokalizasyonunu doğrulandıktan sonraHEK293 hücreleri, ko-kültürlerde R, alt-birimleri α1 / β2 / γ2 GABA _A, R'nin alt birimleri ve 14 gün boyunca (in vitro 14 gün (DIV)) kültürlendi orta spinal nöronların eksprese eden HEK293 hücreleri kullanılarak hazırlanmıştır. Ko-kültür Hücreler sabitlendi, 24 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı ve immünositokimya ve konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilmiştir. Kontakt Analizi GAD65-pozitif GABA'erjik akson terminalleri kontrol HEK293 hücreleri (Şekil 2A, 2B) ile tek tük kişileri oluştuğunu belirtti. 4 saat sonra tespit temasların sayısı HEK 293 hücre başına 7.3 ± 0.9, ve bu sayı kültür nöronları için HEK293 hücrelerinin ilave 24 saat sonra HEK 293 hücre başına 5.5 ± 0.5 bağlantıları (ortalama ± SEM) düşürülmüştür. Buna karşılık, GAD65-pozitif GABA'erjik akson terminalleri GABA _A R'leri ifade HEK293 hücreler ile çok sayıda sinaps gibi kişileri kurdu. HEK293 hücrelerinin ekledikten sonra 4 saatte elde edilen kontakların sayısı HEK293 hücre başına 28.3 ± 4.7 idi ve bu sayının daha da artması oldu52.1 ± 6.3 D ko-kültür, 24 saat (Şekil 2A, 2B) HEK 293 hücre başına (ortalama ± SEM).

Bu sinaps benzeri iletişim olup olmadığını belirlemek için, 'aktif,' yani veziküler verici serbest desteklenen bir vezikül-luminal etki alanına özel anti-synaptotagmin Cy5-konjüge edilmiş antikor, kuluçkalama 23 saat sonra eş-kültür ortamına ilave edildi. Bu antikor, sadece presinaptik sinir terminalleri içine dahil edildiği zaman, sinaptik vezikül lumen ve nörotransmitter serbest bırakılması sırasında, sinaptik aralık içinde hücre dışı sıvı arasında bir gözenek oluşur. Salınmasını takiben, gözenek Cy5-konjüge edilmiş floresan antikor vezikül içinde synaptotagmin bağlı synaptotagmin bırakarak kapatır. Bu şekilde, aktif nöro-ileticinin salıverilmesine yapan sadece veziküller antikor ile etiketlenir. Birkaç Bu deneylerde herhangi bir kumanda arasındaki temaslar HEK293 hücreleri ve orta dikenli nöron terminalleri olsaydı 'aktif & #8217; HEK293 hücrelerinde presinaptik GAD65 / synaptotagmin floresans ve MCherry floresan (Şekil 3A) arasında eş-lokalizasyonu eksikliği ile gösterildiği gibi. Buna karşılık, birçok etkin 'iletişim orta spinal sinir terminalleri ve α1 / β2 / γ2 salgılayan GAD65 / synaptotagmin ve mCherry arasındaki eş-lokalizasyonu yüksek derecede ortaya koyduğu gibi, HEK293 hücreleri, spesifik olarak HEK293 hücrelerinde ifade edilen (arasında oluşmuştur Şekil 3B).

Orta spinal nöronların ile HEK293 hücrelerinin sentezleyen GABA _A, R'nin farklı bir alt tipi, aynı zamanda, in vitro olarak sinaps benzeri oluşumunu teşvik olup olmadığını test etmek için, adres ortak-kültürlenir α1 / β3 / γ2. Yine, kontrol HEK293 hücreleri ender ulaşan sinapsin pozitif presinaptik terminali ile temas alınan ± 0.48, 10.8 ko-kültür (Şekil 4A, sol, 4B) 'de, 24 saat sonra HEK 293 hücre başına temas (ortalama ± SEM). Bununla birlikte, HEK293 hücreleri sentezleyensinapsin pozitif presinaptik ko-kültür 24 saat sonra HEK293 hücre başına 25.3 ± 0.27 (ortalama ± SEM) kişileri ulaşan orta dikenli nöron terminalleri (Şekil 4A hakkı ile sinaps gibi rehber α1 / β3 / γ2 GABA _A TL formu önemli ölçüde daha fazla, 4B). Onların gücü α1 / β2 / γ2 içeren GABA _A R'leri kuvvetine göre daha düşük olsa bu α1 / β3 / γ2 GABA _A TL HEK293 hücrelerinde ifade olduğunu gösterir, aynı zamanda sinaptik iletişim oluşumunu teşvik edebiliyoruz.

Bu deneyler laboratuvarda geliştirilen ko-kültürü modeli sistemi bu işlemde _GABAA Rs farklı alt tipi etkinliğinin sayısal in vitro sinaptik iletişim oluşumu analizinin yanı sıra değerlendirmesine izin verir olduğuna işaret etmektedir. Bu deneyler ayrıca, GABAerjik sinaps kritik fonksiyonel bileşenlerini olmanın yanı sıra bu GABA _A Rs, göstermek önemli bir rol oynayabilirtanınması ve bağımsız bir şekilde, diğer sinaptik yapışma proteinlerinin önleyici sinirlerle ve uygun nöronal hedef hücreleri arasında olduğu, sinaptik temasların oluşum sürecinde.

Şekil 1. immünositokimyasal GABA _{A, R'nin} α1 ekspresyon analizi / β2 / γ2 veya sabit bir HEK293 hücre hattında α1 / β3 / γ2. GABA _{A, R'nin} alt ünitelerinin hücre dışı alanları tanıyan antikorlar, hücre yüzeyinde eksprese etiket reseptörleri kullanıldı. ( A), HEK 293 hücre hattı ifade α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) ve yüksek düzeyde γ2 (Cy5). (B), HEK 293 hücre hattı ifade α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) ve γ2 (Cy5)yüksek seviyelerde alt-birimlerini. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. GABA'erjik orta dikenli nöronlar ko-kültür HEK293 hücrelerinin ifade α1 / β2 / γ2- ile sinaps gibi kişileri oluşturur. (A), (sağ mavi,), floresan anti-GAD65 antikorları ile presinaptik terminallerin etiketleme (yeşil) ve veya GABA _{A, R'nin} γ2 alt birimi (kırmızı sol olarak) mCherry ile HEK293 hücreleri, bunlar arasında eş-lokalizasyonu noktaları ortaya ko-kültür, 4 veya 24 saat sonra, sinaps benzeri kontaktların oluşumunu gösteren belirteçler. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (B) sinaps gibi co kantitatif analizi rmal. Her a optik bölümünde göz ile sayılabilecektir DIC görüntüleme ve / veya ekspresyon MCherry, ve GAD-65 pozitif puncta (yeşil) ve HEK293 hücrelerinde yüzeyi arasındaki temasların sayısı ile ortaya çıktığı gibi, HEK293 hücreleri, şekil dayanarak belirlenmiştir Z yığın serisi (8-10) görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına, ve kişiler / hücre sayısı olarak ifade edilmiştir. Grafik ko-kültür, 4 ve 24 saat sonra orta dikenli nöronların ve kontrol HEK293 hücreleri (açık gri) veya α1 / β2 / γ2-HEK293 hücreleri (siyah) arasındaki temasların sayısını gösterir (ortalama ± SEM, n = her 8 İki bağımsız deneyden gelen durum). Bu rakam Fuchs ve ark modifiye edilmiştir. (2013) ^30. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

reklam / 52.115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 3. GABA _A RS sinaps gibi GAD65 için pozitif orta dikenli nöron terminaller arasındaki ko-kültür 24 saat sonra oluşan kontakları (Alexa Fluor 405 mavi) ve (A) kontrol HEK293 hücrelerinin. Immunolabeling aktif sinaptik bağlantıları oluşumunu teşvik veya (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 hücreler, geçici mCherry transfekte hem (kırmızı) inşa. Aktif iletişim presinaptik terminallerde hem vesikül lümen etki alanına özel anti-synaptotagmin antikoru (Cy5) ve GAD65 özgü antikor arasında eş-lokalizasyonu ile tanımlanır, ve MCherry HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

igure 4 "fo: içerik-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52.115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 4. GABA'erjik orta dikenli nöronlar ko-kültür HEK293 hücrelerinin ifade α1 / β3 / γ2- alt birimi ile sinaps gibi kişileri oluşturur. (A), bir anti-synapsin (sol) antikorlarının (yeşil) ve kontrol HEK293 hücreleri veya α1 olan presinaptik terminallerin floresan etiketleme / β3 / γ2 HEK293 hücrelerinin ifade eden, her iki geçici olarak (kırmızı) mCherry ile transfekte edilmiş, noktalarını ortaya ko-kültür 24 saat sonra sinaps gibi temasların oluşumunu gösteren bu işaretlerin arasında co-lokalizasyon. Ölçek çubuğu: 10 mikron (B). Sinaps gibi temasların kantitatif analizi. HEK293 hücreleri MCherry ifade ile tespit edildi ve sinapsin bir pozitif puncta (yeşil) ve HEK293 hücrelerinde yüzeyi arasındaki temasların sayısı Z yığın serinin her bir optik bölümünde göz ile sayıldı (8-10) görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına ve rehber / hücre sayısı olarak ifade edilir. Grafik orta dikenli nöronlar ve kontrol HEK293 hücreleri (açık gri) veya α1 / β3 / γ2-HEK293 hücreleri (siyah) ko-kültür 24 saat sonrası arasında temasların sayısını gösterir (ortalama ± SEM, n = 8-12 hücreleri iki bağımsız deneyden her koşul). Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu protokol gerçekleştirmek için teknik olarak zor olmasa da, en doğru ve tekrarlanabilir ko-kültür deneyleri ulaşmak için takip edilmesi gereken birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, kültürlenmiş orta spinal nöronların optimal bir yoğunlukta tohumlanmıştır gerekir. Çok seyrek numaralı seribaşı ise, nöronlar çok yavaş geliştirmek eğilimindedir ve hayatta kalma büyük ölçüde azalır. Çok yoğun tohumlanır, Öte yandan, nöronlar HEK 293 hücreleri ile temas analizini ödün bu topaklaşma eğilimi. İkinci olarak, geçici olarak sabit bir şekilde önceden ko-kültür içine Platting için GABA _bir Rs eksprese eden HEK293 hücrelerinde bir flüoresan raportör, GFP veya mCherry ifade etmek için önerilmektedir. Bu durum, bu hücreler ve nöronal kültürlerinde en nadir glial hücre arasındaki şekil ve büyüklük açısından benzerlik tehlikeye olabilir HEK293 hücrelerinde, güvenilir tanınmasına imkân verir. GFP veya MCherry cDNA ile verimli transfeksiyona elde edilmesi için, HEK293 hücre çizgileri üslü büyüme fazında olması ve6-yuvalı plakalar içinde uygun bir yoğunlukta tohumlanmıştır. Transfeksiyonu takiben seyrek ekim aşırı-besleme cDNA alarak gelen hücreleri önleyecektir süre hücreleri zayıf büyümesine neden olur. Transfeksiyondan bir gün% 90 konfluent - bunlar 70 arasında olduğu İdealde Hücreler olmalıdır. Bazı hücre çizgileri diğerlerine göre daha duyarlı Üçüncü olarak, transfeksiyon, kullanılan her bir hücre hattı için optimize edilmelidir. Kurucu GABA HEK293 hücrelerinde _{A, R'nin} sentezleme hücre hayatta kalma ve transfeksiyondan sonra geri hücrelerin yeteneğini azaltan olmasıdır. Ayrıca, hayatta kalma, bazı hücre çizgileri belirgin olarak diğerlerine göre daha duyarlı olan, HEK293 hücrelerinde ifade _GABAA Rs türüne bağlıdır. Lipozomal bir reaktif kullanılarak transfeksiyonu, hızlı büyüyen hücre hatları yabancı proteinlerin ifade yüksek transfeksiyon verimi ve ifade düzeyleri hem de sağlamak için bir en uygun metottur. Bununla birlikte, bu reaktifin, yavaş gelişen hücre çizgileri için çok hasara neden olurhangi düzenli olmayan bir lipozom transfeksiyon reaktif kullanın. Bu lipozomal reaktife benzer bir şekilde çalışır, ancak etkili transfeksiyon için gerekli DNA miktarı önemli ölçüde azalır. Bu, daha yüksek hücre yaşamını sağlar (aşağı yukarı 80-90% 60, elüsyon için% lipozom tepkin madde ile karşılaştırıldığında) daha düşük transfeksiyon verimi (% 60). Son olarak, kontrol HEK293 ya α1 sayısı / β2 / γ2 HEK293 nöron kültürleri ile ilave ifade eden hücrelerin optimize edilmesi gerekmektedir. Onlar çok nadir olur çünkü çok az hücre ekleme, HEK293 hücreleri ve nöronlar arasındaki temasların başarılı analizini uzlaşma. Tersine, çok fazla HEK293 hücrelerinin eklenmesi birkaç saat içinde nöronal hücre ölümüne neden olur.

Embriyonik orta dikenli nöron kültürleri ideal embriyonik 15 yaş disseke striyatal doku kullanılarak hazırlanmış olmalıdır - Ancak 17. sık sık embriyolar optimal yaşında biraz daha genç veya daha yaşlı olduğunu olur. Bu durumda, bu durum nöron sayısının kültür tohumlanmış olacakdeğiştirilebilir olması gerekir. E15 daha küçük olan bir ince E17 optimum hücre hayatta kalmasını garantileyen, daha yüksek bir yoğunlukta ekildi gerekebilir daha eski olan doku iken, biraz daha düşük bir yoğunlukta ekildi gerekebilir. Ayrıca, sitosin arabinosid (ARA-C) yaşlı dokuda daha fazladır glia büyümesini önlemek için, daha eski kültürlere ilave edilmesi gerekebilir.

Ko-kültürler oluşturulurken, yukarıda belirtildiği gibi, bu transfekte edilmiş HEK293 ya α1 / β2 / γ2 HEK293 ifade eden hücrelerin optimum sayısı plaka önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni hayatta kalmak farklılıkları, her bir hücre hattı için bu belirlemek için gerekli olabilir. Bu koşullandırılmış ortam nöronal çok seyreltilmez sağlar ve tipik olarak 50 ul maksimum hacimde 30,000 hücre, daha önce nöronal kültür ortamında 500 ul ihtiva eden bir 24-yuvalı tabak, her bir oyuğuna ilave edilmelidir koşullar, bu Her içinde iyi, örneğin oldukça sabit kalır Büyüme faktörlerinin konsantrasyonu. Iyi hacimleri her fazla 50 ul ekleyerek genellikle nöronlar öldürecekti.

Ko-kültür tekniğin en önemli dezavantajlarından biri, nöronal kültürler nöron normal mikro-çıkarılır ve normal anatomik organizasyonu kuramadý edilmiş olduğu anlamına gelir, bir tek tabaka olarak yetiştirilen ayrışmış hücrelerden oluşturulmuş olmasıdır. Bu nedenle sinaps gelişmenin ilk aşamalarını etkileyebilecek diğer hücrelerden uygun bağlantıları, giriş ve salgılanan molekülleri yoksundur. Örneğin, in vivo orta dikenli nöronlar yoğun bu girişler striyatal doku diseksiyonu sırasında zarar görmesinden dolayı Glutamaterjik sinapslar oluşturmak yok bizim nöronal kültürlerde, ancak, korteks, talamus ve diğer beyin bölgelerinde ³⁴ Glutamaterjik girdiler ile innerve. Ne kültürlenmiş orta spinal nöronlarının fonksiyonel glütamaterjik sinapslarda büyük olmaması affects GABA _A R'leri ifade birbirleriyle ve / veya HEK293 hücreleri ile GABA'erjik sinaps oluşturmak için kendi yetenek açık bir soru kalır. Bu soru, kolayca kortikal glutamaterjik nöronlar böylece onları ³⁵ önceden HEK293 hücrelerine eklenmesinden fonksiyonel sinaps oluşturmak için izin birlikte orta spinal nöronların kültürlenmesi ile ele alınabilir. Alternatif bir yaklaşım, olgunlaşması ve sinaps oluşumu için önemli olabilir hücre mimarisini bazı korumak organotipik kesit kültürlerinde dayanan bir ko-kültürü modeli tasarım yaklaşımları olacaktır. Ancak, Organotipik dilim kültürleri burada yapılan analiz tehlikeye düşürebilecek yoğun ve heterojen neuropil var. Bu, yeteri kadar yüksek bir yüzey ekspresyonunu ³⁰ belirli bir sinaps oluşumu için gerekli olmadığı görülmüştür, ancak ko-kültür deneyleri kullanılarak bir diğer önemli dezavantajı, GABA _A TL bu nöronlar gibi toplaşmamıştır: HEK 293 hücreleri yüzeyinde ifade olmasıdır. Örneğin, rOdent beyin ve hipokampal kültürlerde, α1 GABA _{A, R'nin} alt birim arasında piramit şeklindeki hücreler her postsinaptik etki çoğu GABA sinapslar içinde bulunur. Ancak, α2 özellikle somata üzerindeki sinapslar ve dendritler bir alt kümesi bulunur ama immunofloresans ve elektron mikroskopisi ³⁶ bildirdiği gibi son derece akson ilk segmentinde zenginleştirilmiştir. Eş kültürlerinde sinaps oluşumu hala güvenilir bir şekilde tespit edilebilir olduğu göz önüne ^{alındığında, 30} analiz, bu HEK293 hücrelerinin hücre yüzeyinde _GABAA Rs yoğunluğu sinaptik olan bu reseptörlerin yoğunluğundan daha benzer ya da daha yüksek olabileceğini düşündürmektedir nöronlarda kümeleri. Bu, en azından bu tür gephyrin gibi neuroligin sinaptik yapışma proteinleri, ve postsinaptik yoğunluğu proteinler, uygun bir şekilde monte edilmiş GABA _A TL yeterli mevcut ise, eş kültürlerinde sinaps oluşumu için gerekli değildir bu yüzden kısmen üzere, açıklayabilir yoğunluğu.

İyi GABA _A Rs yapısal ve işlevsel heterojen olduğu belgelenen ve reseptör birim bileşimi onların hücre içi lokalizasyonu ve farmakolojik özelliklerini belirler. Alt birim hemen hemen sadece mevcut extrasynaptic GABA _A Rs olduğu Örneğin, 2 alt birimlerin dahil _GABAA Rs sinaptik lokalizasyonu için bir şart olduğu bilinmektedir. Sadece kombinasyonları αβ dahil reseptörleri de ağırlıklı extrasynaptic etki ^{12- 14} lokalize olduğu düşünülmektedir. Bu özgüllük Bizim eş-kültür sistemine muhafaza olup olmadığı kolayca, geçici olarak nöron kültürleri ile eklemeden önce, sabit bir şekilde α ve β alt-birimlerini eksprese eden HEK293 hücre çizgilerine 2 ya da alt birim cDNA'lar transfekte edilmesiyle test edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak yapılan ön deneyler sinaptik iletişim kolaylıkla tarifhamesinden belirten, sadece 2 alt biriminin varlığında oluşmuş olduğunu ileri sürmüşlerdirin vivo olarak gözlenen, özgüllük, in vitro olarak korunmuş olması muhtemeldir (veriler gösterilmemiştir).

Ayrıca, farklı α alt birimleri içeren GABA _A Rs seçici presinaptik nöronların belirli tipleri ile oluşan sinaptik kişileri yerelleştirilmiş. Örneğin, globus pallidus olarak, α1-GABA _A TL genel striatopallidal (STR-GP), sırasıyla, dendrit ve orta spinal nöronların somatik bölgelerinde yer almaktadır palliopallidal (GP-GP) sinaps, bulunur. Α3-GABA _A Rs orta dikenli nöronların perisomatic bölgelerde bulunan ve bu nöronların distal dendritlerde bulunan ve striatum ³² girişlerine tarafından öncelikle temas α2-GABA _A Rs ederken, yerel GP akson teminatlar ile temas ettirilir. Sinapsların ve farklı nöronal bölümlerinde farklı belirli α alt birimlerinin sentezlenmesi, aynı zamanda, Hipp gibi diğer beyin bölgelerinde ortaya konmuşturocampus ²¹ ve ^18,20 neokorteks. Bu bulgular spesifik inhibitör sinapslar beyinde nasıl oluştuğunu olarak soruyu. Presinaptik terminal belirli bir tip yapışma temas noktaları içine belirli GABA _A R alt tiplerinin yerleştirilmesini neden mi? Reseptörleri plazma zarı ekleme belirli bir kökeni aksonal terminallerinin yapışması için bir ön koşul olan kendi alt-birimi bileşimi göre, spesifik hücre içi yerle kaçırılan mı? Bugüne kadar, bu sorular cevapsız kalır. Bu tür ko-kültür model sistem olarak indirgenmiş modeli sistemlerinde kullanımı, sistem önemlisi, DNA yapılan ve reaktifler uygulama transfeksiyonu kolayca uyum sağlar ve bu nedenle, bu karmaşık sorulara cevap başlatmak için izin, canlı hücre görüntüleme analizi için de uygundur ^30. Bu nedenle, bu model sistemi kullanarak bildiğimiz GABA _bir Rs farklı türleri dahil olmak üzere tek tek moleküller, rolü test başlayabilirn sinaptik kişileri mevcut olması. Bir başka avantaj dakika içinde sonrası hızlı bir şekilde, bu model sistemi formunda sinaps, deney süresini azaltmak olmasıdır. Benzer ko-kültürü modeli sistemleri, başarılı bir şekilde yeni synaptogenic molekülleri ^27,37,38 taranması için geçmişte kullanılmıştır.

Merkezi sinir sistemi nasıl geliştiğini anlamak, olgunlaşır ve örnek davranış veya biliş için kontrol çok girift nöronlar arasındaki bağlantıları oluşturmaktadır, temel öneme sahiptir. Bu uzak esas ancak gelişimi esnasında tanıma ve hücre-hücre iletişiminin bireysel aşamalarını düzenleyen moleküler mekanizmaların ortaya koymayı ile elde edilir. Nedeniyle saf karmaşıklığı, Bu bir çok selüler etkileşimlerin moleküler ayrıntıları şu sadece düşürülmüş sistemleri hassasiyetle incelenebilir. Bununla birlikte bu proteinlerin çoklu kombinasyonlar sentezleyen ve nasıl inceleyerek bu sistemlerin karmaşıklığını artırmak içinbunlar, örneğin, genetik silme yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında bazı avantajlara sahiptir etkileşim. Bir gen silme etkilerinin kesin yorumlanması Genellikle, özellikle gelişmekte olan beyinde, orijinal lezyonların maskeleme etkilerini telafi eden mekanizmalarla bağlantılıdır değişikliklerden tehlikeye olmasıdır. Burada anlatılan basit ama bilgilendirici ko-kültür tekniği sinaps oluşumu GABA _A Rs yapısal rolünün bir keşif izin ve GABA _A R ve diğer hücre yapışma molekülleri ve / veya sinaptik matriks proteinleri birbirleri ile etkileşim nasıl araştırmak için bir olasılık açtı sinaptogenez sırasında. Sinaptik matriks proteinleri son zamanlarda Glutamaterjik sinaps oluşumu ³⁹ önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ki verilen özel bir öneme sahiptir. Onlar 'normal ve rehberlik moleküler mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için potansiyele sahip çünkü ko-kültür modelleri daha da geliştirilmesi önemlidir# 8217; beyin gelişimi ve dolayısıyla bu mekanizmaları epilepsi, şizofreni, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri gibi birçok nörogelişimsel hastalıklar, değişmiş nasıl anlayışımızı artırmak.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz MRC İngiltere (G0800498) mali destek kabul etmek istiyorum. Biz de antibiyotik direnci içeren pCDNA 3.1 ⁽⁺⁾ ekspresyon vektörleri sağlamak için, GABA _A -R altbirim-spesifik γ2 antikor ve Profesör R. Harvey, Eczacılık UCL Okulu sağlamak için, Profesör JM Fritschy, Zürih Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum kararlı biçimde transfekte edilmiş HEK293 hücre çizgilerinin üretilmesi için genler içerir.