Method Article
Lyme hastalığı Kuzey Amerika'daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir.
Lyme hastalığı, Borrelia burgdorferi etken İletim, memeli bilgisayarlar üzerinde kene Ixodes türlerin eki ve kan beslenmesi ile oluşur. Doğada, bu zoonotik bakteriyel patojen rezervuar konak çeşitli kullanabilirsiniz, ancak beyaz ayaklı fare (Peromyscus leucopus) Kuzey Amerika'da larva ve nimf keneler için birincil rezervuar olduğu. İnsanlar en sık B ile enfekte arızi ana nimf aşamasında. B. kene ısırması ile burgdorferi burgdorferi enzootik döngüsü boyunca onun ana uyarlar, böylece memeli konaklarda bu spiroketlerine ve bunların etkileri fonksiyonlarını keşfetmek yeteneği kene besleme kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, (tespiti ve bulaşıcı bir maddenin geri kazanılması için doğal vektörü kullanılarak) xenodiagnosis tekniği şifreli enfeksiyonun çalışmalarda yararlı olmuştur. Elde etmek amacıyla nimf o liman B. keneler burgdorferi,Keneler kılcal tüpler aracılığıyla kültür canlı spiroketlerine beslenir. İki hayvan modelleri, fare ve insan olmayan primatlar, en çok kene besleme ilgili Lyme hastalığı çalışmaları için kullanılır. Biz, bu keneler üzerine beslenir ve enfeksiyon veya xenodiagnosis biri için hayvanlardan elde edilebilir olan yöntemleri göstermektedir.
2011 yılında, Lyme hastalığı Kuzey Amerika'da (6. en yaygın Ulusal Bildirimi zorunlu hastalık oldu http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi hem genetik ve antijenik (1 gözden), çok yönlü bir mikroptur. Onun genetik anayasa büyük (> 900 kB) kromozomu içeren ve plazmid içerik izolatlar arasında değişen 21 plazmidler (12 doğrusal, dairesel 9), kadar. Çok plazmid açık okuma çerçevelerinin% 90 üzerinde bilinen herhangi bir bakteriyel dizilerine 2,3 ilgisiz olarak, bu spiroketlere öğrendim olmaktır. B. burgdorferi konak bağışıklık potansiyel hedefler olarak antijenleri geniş bir yelpazede sunar. Bununla birlikte, işlenmemiş bir enfeksiyon genellikle devam eder. Kene çevre ve omurgalı konak çevre ile spiroketlerine etkileşim B. tarafından alınmasını gerektirir Enfeksiyon süreci boyunca burgdorferi. Çeşitli plasmidle kodlanmışgenler farklı olarak sıcaklık, pH, hücre yoğunluğu ve kene ömrü 4-8, hatta aşamasında değişikliklere yanıt olarak ifade edilebilir olduğu bilinmektedir.
B. Çalışma doğal yoldan neden olduğu enfeksiyona takip eden enzootik döngüsü boyunca burgdorferi adaptasyon ve konakçı tepkileri uygun hayvan modelleri üzerinde keneler beslemek için yeteneğine dayanır. Bu tür çalışmalar B. liman kenelerin üretme teknik zorlukları ile karşılanmaktadır burgdorferi ve modeli konak üzerinde kene verimli iletim ve / veya besleme sağlanması. Buna ek olarak, enfekte kenelerin tutucu ve geri gereklidir. Kullanılan modeller arasında farenin ve Lyme hastalığı araştırmalarında değerli bir araç olarak hizmet eder, her biri insan olmayan primatlar, bulunmaktadır. B için doğal bir rezervuar bir ana beyaz ayaklı fare gibi burgdorferi, laboratuvar fare B. tarafından kalıcı enfeksiyon destekleyen son derece duyarlı bir ana 9 burgdorferi. FolBöyle C3H suşu olarak hastalığa duyarlı farelerin enfeksiyonu lowing, spiroket cilt, mesane, kas, eklem ve kalp dahil olmak üzere birden dokulara yaymak. Neden olduğu enfeksiyona enflamatuar tepkiler hastalıklı kalp ve eklem dokusu yol açar. Spiroket bu ana inat ve bulaşıcı devam ederken, iltihabi lezyonlar değil insanlarda sürecinin aksine, aralıklı olabilir. Fare modeli böylece B. fazla bilgi vermiştir artrit ve karditis ve bağışıklık tepkileri dahil olmak üzere 10-12 ev burgdorferi kaynaklı patoloji,. Kene vektör 13-21 aktarım için bazı gerekli olması halinde patojenin açısından bakıldığında, farklı olarak memeli enfeksiyon sırasında ifade edilen bazı genlerin, karakterize edilmiştir.
Çeşitli hayvan türlerinin Lyme hastalığı 22 incelemek için kullanılmış olmasına rağmen, rhesus macaques en yakın insan hastalığı 23'ün çoklu organ karakter taklit eder. Diğer aksinehayvan modelleri, örneğin eritema migrans, Kardit, artrit ve periferal ve merkezi sinir sistemleri nöropati gibi hastalık belirtileri genişliği makaklarda gözlenmektedir. Farelerde, B. ana hazne erken ve geç-yaygın belirtileri nadir 9 iken burgdorferi, hastalık, fare zorlanma ve 24 yaş ile değişir. Buna ek olarak, diğer kemirgenler, Lagomorphs ve köpek her B'den nörolojik hastalık sergilemek başarısız burgdorferi enfeksiyonu 25. Önemlisi, makaklar Lyme borreliosis, yani, erken lokalize, erken yaygın, ve geç evre Lyme hastalığının 26-28 her üç aşamadan karakteristik belirtileri gösterirler. Eritem migranlan (EM) insan vakalarının 29% 70-80 meydana düşünülmektedir, ve aynı zamanda rhesus makaklarda 28,30 görülür. Enfeksiyonu takiben spiroket çoklu organ inokülasyon sitesinden yaymak. Spirochetal DNA iskelet mu tespit edildiscles, kalp, safra kesesi, periferik sinir ve sinir ağı, hem de merkezi sinir sistemi (beyin, beyin sapı ve beyincik, omurilik ve dura mater) 31.
Rezervuar yetkinlik 32-36 inceleyen ve B. çalışmalarda kene fareler üzerinde beslemek, kene kolonilerinin yayılması için bize ve diğer araştırma ekipleri tarafından kullanılmıştır burgdorferi 37-40 patogenezine. Bu teknik aynı zamanda xenodiagnosis ve farelerde 41-44 aşı etkinliğinin test edilmesi için kullanılmıştır. Biz Ixodes model geliştirme 28 için maymunları üzerinde kene beslenen, aşı etkinliği 45 bir çalışma, sebat ve sonrası antibiyotik tedavisine 46 değerlendirilmesinde xenodiagnosis için. O liman B. Keneler burgdorferi spiroket yaşam evrelerinde üzerinden iletilen olarak, enfekte fareler üzerinde larva besleme ve çalışmalar için perileri kullanılarak doğal bir enzootik döngüsü içinde muhafaza edilebilir. Bu rapordaBiz vahşi tip veya mutant B ile enfekte kene oluşturmak için nasıl talimat burgdorferi, kılcal tüp besleme kullanarak. Bu da mikroenjeksiyon ile 47 ve daldırma 48 ile gerçekleştirilebilir. B. yapay getirilmesi amacı keneler, kimin iletebilirliği bilinmeyen mutant suşlar çalışma olabilir, yüksek enfeksiyon oranı ile keneler bir grup oluşturmak için, ve bir temiz ve aksi bulaşmamış kene koloniyi koruyarak hata potansiyelini azaltmak için içine burgdorferi. Tutma ve dolu kenelerin iyileşme sağlamak için, böylece ek olarak,, fareler ve insan olmayan primatlar üzerinde kene besleme göstermektedir. Kene beslenmenin kullanımı B. bağışıklık tepkilerinin gelecek çalışmalar için gerekli olan burgdorferi enfeksiyonu, olası Lyme aşı etkinliği ve gizli enfeksiyonların tespiti için xenodiagnosis.
Lyme hastalığı araştırma için hayvanlar üzerinde kene aşılama ve besleme deneysel taslağı Şekil 1 'de gösterilmiştir.
1.. Aşılayarak Nymphal Ixodes B ile keneler Kılcal Tüp-besleme kullanarak burgdorferi
Kene ile manipülasyonlar yaparken, elastik kollu, eldiven ve tek bouffant kapakları beyaz laboratuvar mont giyilir.
2. B. Fareler bulaşmasını Kene tarafından burgdorferi
3. B. Enfeksiyon için primatlarla üzerinde Keneler Besleme burgdorferi veya xenodiagnosis
Not: Çoğu zaman, tutucu cihaz sadece uzak deriden sıyrılabilir. Yapışma güçlü ve potansiyel olarak cilde zarar olabilir, Unisolve çözgen uzaklaştırılması için hafif bir bölgeye uygulanır. Cilt izopropanol ile sildi ve keneler, 23 ° C'de saklanır Enfeksiyonu için kullanılırsa, keneler B ihtiva numarayı onaylamak için ezilebilir burgdorferi. xenodiagnosis için kullanılırsa, keneler önceki midgut içeriklerinin analizi için 1-3 hafta boyunca tutulur.
Bu aktarım için hayvanlar üzerinde beslenir önce kılcal besleme tamamlanmasından sonra, keneler, genellikle 2-3 hafta boyunca 23 ° C'de dinlenmiş. Kılcal-besleme tekniği kullanarak, beslenen% 90 üzerinde liman B. keneler bulduk burgdorferi. pozitif kenelerin yüzdesi yıkama ile tespit edilir daha sonra bir mikrofüj boru şeklindeki havan tokmağı ile steril PBS içinde onları ezme, peroksit ve etanol keneler. Orta bağırsak içeriği PBS içine dökülen slaytlar üzerinde sabit ve FITC ile konjüge edilmiş bir anti-Borrelia türü antikor ile boyandı. Floresan mikroskop ile izlendi Temsilcisi kene ortabağırsak smear Şekil 2B-C tasvir edilir
Düşük geçit gerginlik B31 vahşi tip B. ile fare enfeksiyon oranları burgdorferi% 100 yakın. B. serolojisi ve kültür bir arada Fare dokularından burgdorferi her bir fare enfekte olup olmadığını belirlemek için kullanılır. A western blot showiB ile enfekte farelerden ng serum antikor tepkileri kene tarafından burgdorferi Şekil 3C gösterilmiştir. Bu teknik, B. bulaşıcılığını ve enfeksiyon incelemek için kullanılmıştır burgdorferi mutant 37-39 suşları.
Biz enfeksiyon ve xenodiagnosis için maymunları üzerinde kene beslenmesinde kullanılanlar var. Çabalar flep çevreleme cihazı uygulayarak kene beslenmesini ve tam beslenen keneler kurtarma geliştirmek için yapılmıştır. Flep ürün insanlarda tıbbi kurtçukların uygulaması için kullanılır, ama biz kene primatlar üzerinde beslemek için değiştirilmiş. Daha önceki çalışmalarda, biz kene muhafaza 27,28,45,46 için sert bir kapsül kullanılan ve 23,5-52,5% 35.2 arasında değişen ortalama% besleme oranı (# beslenen keneler / # kapsüllere eklenir keneler), elde. Enfeksiyon çalışmalarda, iletim (# hayvanlar enfekte / # üzerine beslenen) oranları% 86.5 ortalama. Daha yeni deneylerde, LeFlap kullanarak besleme oranları arasında olmuştur % 50-90. Nadir durumlarda, önceki yöntemi kullanarak keneler kapsül altında ve onlar kuruyacak ve ölmek yapışkan bant, içine sürünerek gelmiştir. Flep kullanılarak geliştirilmiş besleme ve yapışkan çoklu katmanlar bulunan keneler tutmuş.
Kene orta bağırsak hazırlanması (Şekil 2B-C) doğrudan floresan boyama ek olarak, daha hassas yöntemler B tespit etmek için kullanılabilir Kenelerin içinde burgdorferi. Moleküler algılama ve B tespit etmek için kullanılmıştır olabilir standart veya kantitatif ya PCR ile burgdorferi-spesifik DNA 42,50,51. Tespiti için ortak hedefler flab 46,50, OspC 46 ve OspA 42,51 genlerdir. Geri spiroketlerine canlılığı da ortabağırsak hazırlıkları kültürü tarafından incelenmiş ve beslenme xenodiagnostic naif fareler 42. keneler.
iles/ftp_upload/50617/50617fig1.jpg "/>
Şekil 1.. Borreliaburgdoferi İletimi için Hayvanlar Keneler Besleme. Beslenme ile ilgili tekniklerin genel şeması Lyme hastalığı çalışmaları için hayvanlar üzerinde kene. Keneler B. kılcal tüp beslenen kültürler vardır burgdorferi ve bu fareler ve insan olmayan primatlarda (Rhesus makak) olarak Lyme hastalığının hayvan modellerinde, üzerine beslenebilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2,. Kılcal tüp besleme yöntemi ve sonuçları. A) sağdaki kene ve kılcal borunun büyütülmüş görüntüsü gösterilmektedir keneler beslemek için kullanılan cihaz. BC) kenelerin midguts temsili görüntüleri B beslenir burgdorferi. ortabağırsak kobiars anti-Borrelia türe FITC poliklonal antikorlar (Kirkegaard & Perry Labs) ile boyanmış ve fluoresan mikroskop altında incelendi.
Laboratuvar fareleri üzerinde besleme Şekil 3.. Ixodes scapularis kene. A) kene beslenmesi için kullanılan fareler için özel kafes. Tel zemin kene toplamak için tavada su üstünde yükselir. Kene ile enfekte farelerde bir anestezi fare) doğru. B resimde gösterilmiştir keneler için kullanılan saklama kapları. C) Temsilcisi immünblotlarında. 21. günde serum Enfeksiyondan B içeren blot ile problandı burgdorferi lizatları ve rekombinant protein OspC, bir immünodominant antijen.
Yem için kullanılan kene çevreleme cihazın Şekil 4. Diyagramı yanaklı makaklarda keneler. Birinci katman Biatane köpük oluşur. Flep köpük üstüne yerleştirilir ve Duoderm üçüncü katman. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5. Ixodes scapularis kene-besleme Rh makaklarda üzerinde. A) tam çevreleme cihaz. B, cihaz yoluyla beslenmesi ve tamamen çıkarılmasını takiben flep kaldırılması. D) kene beslenmenin sitesi aşağıdaki kenelerin C) Görünümler cihaz.
O liman B. keneler elde etmek için alt çalışmaları için burgdorferi, keneler şunlar olabilir: (1) larva aşamasında enfekte olan fareler üzerinde beslenen, (2) B daldırıldı ya larva veya nimf aşamasında 48-burgdorferi kültürler; (3) B. microinjected burgdorferi 47, ya da (4) kılcal boru beslenen B. 49. burgdorferi. bu yöntemlerin her biri, kene büyük bir kısmının enfeksiyon liman B için kullanılacak sağlamaktan amacına sahip iken, burgdorferi, biz kılcal tüp besleme lehine. Spiroketlerine bilinen miktarlarda aşı gerekli değilse, kılcal besleme yöntemleri keneler zarar daha az potansiyele sahip olabilir. Bu hayvanlar üzerinde beslenmeleri için ise, bu önem taşımaktadır. Araştırmacılar geçirgenlik / enfeksiyon için mutantlar test edilmiştir, bu yöntem de tercih edilebilir. Bu plasmid kaybına neden olabilir 52 kültür içinde büyümenin tanımak önemlidir, bu yüzden kullanımıdüşük geçit B. burgdorferi gereklidir. Ayrıca, spiroketlerine orta yoğunluk ve verilme üzerine yapay, yani keneler post-kapiler besleme hemen kullanılmamalıdır. Spiroket deneylerde kullanılmadan önce kene mikro uyum Bunun yerine, en az 2 haftalık bir süre bırakılır.
Fareler üzerinde keneler besleme, bu daha önce fareler tıraş için gerekli değildir. Biz deri üzerinde kene tükürük etkilerini incelemek için çalıştı (yayınlanmamış) hangi bir önceki çalışmada, tıraş gerekliydi. B) yüksek besleme oranı ve c) kolayca görülebilir bir) tüysüz cilde kolayca eklemek: Bunu yaparken, ve karşı sezgisel, biz keneler olduğunu keşfetti. Yemleme larva veya nimf kullanılan bağlı olarak değişebilir ama perileri kullanıldığı zaman sürekli% 50 üzerindedir. Bu nedenle, önceki beslenmeye fareler tıraş deneyler için değil, aynı zamanda, koloninin yayılması için değil, laboratuarımızda yaygın bir uygulama haline gelmiştir.
Daha önce, Tulane Ulusal Primat Araştırma Merkezi'nde bizim Bölümü'nde, 34 maymunlar 5 farklı çalışmalarda 770 Ixodes perileri tarafından üzerine beslenmiştir. 23,5-52,5% arasında değişen besleme oranları (# beslenen / # kapsüllere eklenir) ortalama% 35.2, kene. Enfeksiyon çalışmalarda, iletim ortalama% 86.5 oranları. (Yayımlanmamış) yeni bir pilot çalışmada, 5-75% arasında değişen oranlarını beslenme kene ve sonraki beslenmeye direnç belli oldu. Yemleme 2 nd için daha 3. girişim için çok daha fazla olduğu, ancak girişimleri 2 ve 3 arasında başarı oranları, önemli ölçüde değişmiştir. "Girişimi 2" keneler artık "girişimi 3" kene daha oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. Kene beslenmesini etkiler biz bulduk en önemli faktör kene yaş ve çevre ön deneydir. Kısa bir süre önce kullanmaya kadar 4 ° C sonrası dökücü tutulur olanlar genellikle daha iyi beslemek. Gibi, biz sürekli saklayarak, kenelerin propagandasını tavsiye accordingly ve hayvanlar üzerinde besleme yaparken mevcut kenelerin iki ayrı çok sahip.
Bizim en son çalışmada (yayımlanmamış) biz karşılaştırıldığında besleme flep cihaz ile besleme için sert kapsülü kullanarak makaklarda keneler. Ten maymunlar kapsüller ile bir kez üzerine beslenen ve iki kez LeFlap ile edilmiştir. Bu deney setinde, biz gözlenen ve kapsül ile% 17 (aralık% 5-25) ortalama besleme hızı ve flep ile 54.75 ortalama% oranı (aralık 35-90%). Biz kene beslenme ve sert yapıştırıcı kullanımının azaltılması için daha geniş yüzey alanı beslenmesini artırır olduğunu düşünüyoruz. Flep çevreleme kullanımı da müfettişler kene tüm cihazın çıkarılması olmadan kaldırılabilir gibi keneler, uzun beslemek veya daha fazla kene ekleyelim ya verir. Yapıştırıcılar bazı hayvanlarda (deri immün tepkilerini etkileyebilecek ya da neden olabilir) hafif cilt tahrişine neden olsa Son olarak, flap cihazın kendisi, eğer varsa, hayvanlar için rahatsızlık sınırlı olabilir.
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Yazarlar, teknik destek için Nicole Hasenkampf ve Amanda tardo teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr teşekkür ederim. Kılcal besleme yöntemiyle ilgili talimatlar için ıhlamur Hu ve Adriana Marques LeFlap muhafaza cihazı önerisi için, ve Dr Lise Gern. Bu çalışma NIH / NCRR Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) tarafından ve Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve hibe P51OD011104/P51RR000164 ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapı Programları Ofisi (OriP) tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
BSK-H | Sigma | B-8291 | |
Ketamine HCl | |||
Tangle Trap coating Paste | Ladd research | T-131 | |
SkinPrep | Allegro Medical Supplies | 177364 | |
LeFlap, 3" x 3" | Monarch Labs | ||
Hypafix tape | Allegro Medical Supplies | 191523 | |
SkinBond | Allegro Medical Supplies | 554536 | |
UniSolve | Allegro Medical Supplies | 176640 | |
Biatane Foam, adhesive 4"x4" | Coloplast | 3420 | |
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border | Convatec | 187971 | |
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom | Lomir Biomedical Inc. | ||
EQUIPMENT | |||
Pipet puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
Dark field microscope | Leitz Wetzlar | Dialux | |
Dissecting microscope | Leica | Zoom 2000 | |
Mouse caging | Allentown caging |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır