Наша работа сосредоточена на разработке и использовании методологии одиночных молекул для изучения динамики в сложных биологических системах. В частности, нас интересует изучение того, как ведут себя ДНК-полимеразы при столкновении с препятствиями, в данном случае с G-квадруплексами. Мы разработали метод с использованием одной молекулы, основанный на флуоресцентной визуализации, который позволяет нам наблюдать поведение отдельных ДНК-полимераз при встрече с G-квадруплексом.
С помощью нашего анализа мы идентифицировали ранее не охарактеризованный путь обмена ДНК-полимеразы дельта при попадании на G-квадруплексы, в котором полимераза отпадает, а новая снова связывается. С помощью нашего протокола мы наконец-то ответили на вопрос: как ведут себя различные ДНК-полимеразы при встрече с G-квадруплексом, поскольку мы можем видеть в реальном времени, как кинетика и механика меняются со временем? Для начала извлеките функционализированную крышку из пылесоса и поместите ее на штатив для микропробирок, частично заполненный водой, чтобы создать влажную среду.
Пипеткой наберите в пробирку 100 микролитров блокирующего буфера, затем добавьте 25 микролитров раствора NeutrAvidin и хорошо перемешайте. Распределите раствор по поверхности крышки и дайте ему поинкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре во влажном боксе. Далее промойте чехол в воде, затем высушите его, используя газообразный азот.
Поместите изготовленный на заказ блок из полидиметилсилоксана на защитное стекло в держателе проточной ячейки. Вставьте полиэтиленовые трубки в отверстия в проточной ячейке. Теперь нагрейте один миллилитр буфера-блокировки Tween, 500 микролитров буфера для промывки и буфер репликации до 40 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы освободить газы из растворов.
Дегазируйте растворы в вакуумной камере еще на 15 минут при давлении на 800 миллибар ниже атмосферного. Нанесите каплю масла на цель. Возьмите собранную проточную ячейку и поместите ее на предметный столик микроскопа.
Затем поднимите объектив так, чтобы он соответствовал обложке. Вставьте входную трубку в буфер блокировки дегазированного подростка и подсоедините выпускное отверстие к шприцевому насосу. Затем потяните шприц назад, чтобы втянуть блокирующий буфер Tween через трубку в канал.
Влейте 200 микролитров дегазированного промывочного буфера в канал со скоростью 100 микролитров в минуту, чтобы промыть буфер, блокирующий Tween. Теперь разведите растворы ДНК-матрицы до 0,5 пикомолара в 500 микролитрах буфера для репликации. Дайте 150 микролитрам раствора влиться в канал со скоростью 10 микролитров в минуту.
Осветите образец с помощью 647-нанометрового лазера с мощностью около 900 милливатт на квадратный сантиметр в плоскости образца, чтобы визуализировать отдельные матрицы ДНК. Как только станет видна достаточная плотность пятен, влейте свежий раствор репликационного буфера, чтобы вымыть избыток ДНК. Перейдите в новое поле зрения и сделайте снимок ДНК, чтобы определить степень колокализации между меченой полимеразой и подложкой ДНК.
После завершения увеличьте мощность лазера, чтобы фотоотбелить оставшиеся пятна. Далее приготовьте раствор полимеразы, содержащий дитиотреитол, дНТФ и флуоресцентный зонд в буфере репликации. Влейте в канал 100 микролитров раствора полимеразы со скоростью пять микролитров в минуту.
После того, как образец окажется в фокусе и общий угол флуоресценции внутреннего отражения будет отрегулирован, установите мощность лазера 647-нанометрового лазера примерно на 900 милливатт на квадратный сантиметр в плоскости образца. Начните визуализацию поля зрения в течение нужного периода времени. Последовательность G-квадруплекса блокировала синтез полимеразы дельта, о чем свидетельствует наличие полосы из 60 нуклеотидов в геле страницы, в то время как контрольная последовательность без G-квадруплекса продуцировала полосу из 100 нуклеотидов.
Одномолекулярная флуоресцентная микроскопия подтвердила, что полимераза дельта имеет более короткое время задержки на подложке G-квадруплекса — шесть плюс-минус две секунды, по сравнению с контрольной субстратой, которая имела время задержки 11 плюс-минус три секунды. Количество событий связывания полимеразы дельта было значительно выше на субстрате G-квадруплекса по сравнению с контролем, что свидетельствует о множественных циклах связывания и разъединения из-за блокады синтеза.
