В лаборатории Морхардта мы используем рыбок данио в качестве животной модели для изучения развития и функционирования мочевого пузыря. Мы определили функциональный мочевой пузырь, который наполняется и опорожняется у рыбок данио. Несмотря на то, что рыбки данио маленькие, мы стремились извлечь выгоду из их размера, чтобы экономично использовать пространственные транскриптомные методы и наше понимание мочевого пузыря позвоночных.
Пространственные транскриптомные методы могут быстро стать дорогостоящими, если не оптимизировать реагенты и оборудование. Этот протокол предоставляет проверенную технику для достижения этой цели с помощью рыбок данио-рерио и дает представление об ожидаемых результатах и смягчении проблем, которые могут возникнуть в результате использования технологии. Помимо экономичного использования дорогостоящих пространственных транскриптомных технологий, эта работа позволила нам провести крупномасштабный пространственный транскриптомный анализ практически целых органов в течение нескольких возрастов, минимизируя при этом периодические эффекты.
Для начала охладите криостат до 22 градусов по Цельсию и соберите все необходимые предметы. Подготовьте одноразовую пластиковую форму для юстировки образца. Поместите кусок лабораторного скотча на внутреннюю часть базовой формы и проведите через него прямую линию с помощью перманентного маркера в качестве точки отсчета.
Отметьте внутреннюю часть базовой формы, чтобы обеспечить правильную ориентацию образца во время криосекции. Загрунтовав сопло бутылки с замораживающим средством, выдайте необходимое количество в один угол базовой формы. Медленно наклоняйте форму основания, чтобы равномерно распределить среду.
Теперь поместите форму для основания с замораживающей средой на ледяную баню и инкубируйте ее не менее 10 минут, чтобы остыть среда. Далее добавьте одну часть 100% этанола на одну часть сухого льда в ведро со льдом под вытяжным шкафом. Поместите одноразовую алюминиевую тарелку или лодочку в ледяную баню и накройте ведро крышкой на пять-10 минут.
Соберите усыпленных рыб, погрузив их в воду с температурой четыре градуса Цельсия на 10 минут. С помощью щипцов с тонкими наконечниками возьмитесь за хвостовой плавник, чтобы удалить рыбу, и осторожно прижмите его к впитывающей безворсовой салфетке, чтобы высушить ее. Поместите подготовленную форму основания под стереомикроскоп с 10-кратным увеличением.
Расположите образец в форме вдоль точки отсчета в правильной ориентации. Аккуратно накройте образец еще одним тонким слоем замораживающей среды. Используйте анатомическую точку отсчета, чтобы точно выровнять рыбу по отмеченным линиям внутри базовой формы, и отрегулируйте ориентацию с помощью щипцов с тонкими наконечниками, избегая образования пузырей.
Приложите кусок сухого льда к дну базовой формы под образцом до тех пор, пока он не замерзнет на месте. Поддерживайте ровную горизонтальную плоскость, чтобы предотвратить смещение образца до полного замораживания. Теперь поместите форму с образцом на алюминиевую лодку или блюдо в ванну с сухим льдом и этанолом.
Убедитесь, что лодка остается плавающей на поверхности, а форма основания остается сухой. Накройте ванну крышкой и дайте образцам застыть в течение 10 минут. Далее заверните замороженную форму основания в фольгу и храните ее в морозильной камере при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока она не будет готова к разделке.
Принесите замороженную форму в предварительно охлажденный криостат для криосекции и поместите ее в камеру криостата. После извлечения предметного стекла пространственного изображения из хранилища поместите его в предварительно охлаждаемый держатель предметного стекла. Храните держатель предметного стекла с пространственным изображением в криостатной камере при температуре 22 градуса Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к сбору среза.
Теперь извлеките замороженный образец из базовой формы и поместите его в патрон со свежей замораживающей средой, убедившись, что режущая поверхность обращена к лезвию микротома. Затем поместите свежее мелкое лезвие микротома в криостат. После выравнивания формы по лезвию обрежьте интересующую область с рекомендуемой толщиной от 20 до 50 микрометров.
Убедитесь, что маркировка внутри формы перенесена на замороженный блок для правильной ориентации образца. Отрегулируйте форму во время обрезки таким образом, чтобы режущая поверхность оставалась параллельной эталонной маркировке в замораживающей среде. Срежьте срезы из замороженного блока и соберите их на стандартное положительно заряженное предметное стекло микроскопа.
Проверьте срезы под светлопольным микроскопом, чтобы убедиться, что обрезка завершена. Затем извлеките предметное стекло из камеры криостата и поместите его в ледяную ванну с температурой четыре градуса Цельсия, сохраняя при этом его внутри держателя предметного стекла. Начните криосекцию с рекомендуемой толщиной от 10 до 14 микрометров.
Собирайте секции на положительно заряженных слайдах, пока не достигнете интересующей вас области. Теперь извлеките предметное стекло для пространственной визуализации отдельных клеток из ледяной ванны и извлеките предметное стекло из держателя. Собирайте секции ряд за рядом, используя кисть с тонким наконечником, чтобы предотвратить скатывание.
Затем прижмите уголок пустого замораживающего средства к ножевому столику с помощью тыльной стороны кисти. Используйте верхнюю часть слайда в качестве точки опоры и медленно опустите слайд на секцию, чтобы он оставался в течение трех секунд, прежде чем поднимать. Расположите последовательные секции параллельно друг другу, чтобы максимально увеличить пространство на слайде.
После сбора срезов из интересующей области поместите предметное стекло обратно в держатель предметного стекла. Если образцы больше не нужны, храните предметное стекло при температуре 80 градусов Цельсия до двух недель перед анализом. Соберите срезы до и после исследуемой области на стандартное положительно заряженное предметное стекло микроскопа и выполните окрашивание гематоксилином и эозином для оценки выравнивания образца и качества среза, прежде чем приступить к анализу.
Выравнивание нескольких сечений было проверено путем сравнения конструкций между сечениями в одном вырезе. Корректировка этапов встраивания и сбора позволила уместить большее количество разделов в области изображения пространственного транскриптомного предметного стекла. Качество пространственного транскриптомного сигнала было высоким в тканевых областях, но более низким в пустых областях предметного стекла из-за низкой сложности сигнала.
