Мы стремимся разработать и охарактеризовать модель на основе органоидов, чтобы имитировать желудочно-кишечный тракт и сравнить его с живыми свиньями, а также сосредоточиться на транспортных характеристиках. Переход от классического эксперимента на животных к. В нашей области физиологии желудочно-кишечного тракта до ан.
Модель in vitro на основе органоидов, которая имитирует ситуацию in vivo. Мы объединили нашу модель тонкой и толстой кишки органоидов с. Это может быть использовано для исследования характеристик транспорта в режиме реального времени, чтобы можно было сравнить нашу модель и ситуацию с живыми свиньями.
Особенно в области исследований, связанных с животноводством, альтернативные модели классических экспериментов на животных встречаются редко. Мы преодолеваем это ограничение, используя нашу модель кишечного тракта свиней, основанную на органоидах. Мы планируем использовать нашу модель кишечника на основе органоидов для изучения воздействия патогенных бактерий свиней.
Это направлено на понимание механизмов патогенности этих бактерий. Для начала смешайте только что размороженную базальную мембрану в соотношении 1:40 с ледяной стерильной PBS в конической пробирке. Добавьте 200 микролитров этой смеси в апикальный отсек каждого вкладыша внутри стерильных пластин.
Установите на место крышку луночной пластины и выдерживайте не менее 1,5 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. После инкубации осторожно отсасывайте раствор, не касаясь мембраны. Удалите органоидную среду из лунок, содержащих трехмерные криптовые органоиды.
Чтобы растворить базальную мембрану, добавьте в лунку один миллилитр ледяного PBS и проводите пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника P1000. Соберите все растворенные органоиды в 15-миллилитровую пробирку, предварительно заполненную 10 миллилитрами ледяного PBS. Центрифугируйте пробирку при температуре 250 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
После аспирации надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре теплого 0,05%-ного трипсина ЭДТА. Инкубируйте пробирку в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане, а затем поместите ее на лед, чтобы остановить реакцию. С помощью наконечника P1000 проведите пипетку вверх и вниз 20 раз, чтобы полностью повторно суспендировать органоиды, а затем повторите еще 15 раз, используя наконечник P1000 с прикрепленным сверху наконечником P200.
Теперь добавьте 10 миллилитров ледяного DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят, или FCS. Центрифугируйте пробирку при 1000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После сброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре однослойной среды.
Используя камеру Нейбауэра, следуйте инструкциям производителя, чтобы определить количество живых клеток на миллилитр. Теперь замените раствор покрытия из апикального отсека на 500 микролитров однослойной среды, отпущенной при температуре 37 градусов Цельсия, и добавьте три миллилитра монослойной среды в базальный латеральный отсек. Удалите верхушечную монослойную среду.
Для 2D-культуры добавьте 500 микролитров монослойной среды, содержащей соответствующее количество клеток, в апикальную камеру каждого трансвелла и инкубируйте клетки. Для измерения трансэпителиального электрического сопротивления или измерения TEAR очистите электрод палочки для еды 70% этанолом и дайте ему полностью высохнуть. Введите короткий рычаг электрода палочки для еды в апикальный отсек, а длинный рычаг — в базальный боковой отсек вставок.
Далее включите и пустите. Измерьте равновесие для стабильного измерения, затем нажмите кнопку «Сохранить», чтобы записать значения TEAR. После измерения последней скважины нажмите «Сохранить», чтобы сохранить данные на USB-устройстве.
Очищайте электрод после каждой пластины и в конце измерения. Дайте электроду полностью высохнуть перед хранением. Вычтите из измеренных значений TEAR пустые значения, определенные перед загрузкой ячеек.
Меняйте среду и измеряйте TEAR каждые два-три дня, убедившись, что TEAR измерен до замены среды. Осторожно добавьте 500 микролитров, или три миллилитра, свежей теплой среды для дифференцировки в апикальные и базальные отделы. На 18-й день для органоидов тощей кишки или на девятый день для органоидов толстой кишки, после посева, приступают к функциональным экспериментам.
Прогрейте слизистые, и серозальные буферные растворы до 37 градусов Цельсия и проаэрируйте карбогеном. Соберите отдельные камеры, используя пустую вставку для каждой отдельной камеры, убедившись, что все апикальные стороны трансвеллов обращены в одном направлении. Заполните все камеры пятью миллилитрами предварительно подогретого буферного раствора слизистой.
Подсоедините все электроды от зажима напряжения к отдельным камерам, следуя инструкциям производителя. Чтобы откалибровать программное обеспечение камеры Ussing, нажмите кнопку RFDPI в программном обеспечении клещей напряжения. Убедитесь, что сопротивление всех пустых вставок составляет примерно 70 Ом, а ток — около нуля милливольт.
Снимите все электроды и выбросьте использованный буферный раствор. Откройте отдельные камеры, удалите пустые вкладыши и поддерживайте порядок камер. Теперь под защитным шкафом осторожно отсасывайте базолатеральную и апикальную среду из пластины.
Промойте клетки 500 микролитрами теплого буфера слизистой оболочки в апикальной камере, и тремя миллилитрами серозального буфера в базолатеральной камере. Снимите вставки с плиты и аккуратно снимите их опоры. Поместите вставки в камеры Ussing, убедившись, что ориентация соответствует фазе калибровки.
После сборки отдельных камер заполните камеры, обращенные к базолатеральной стороне клеток, пятью миллилитрами серозального буфера, а те, которые обращены к апикальной стороне, пятью миллилитрами буфера слизистой оболочки. Подключите электроды и аэрационные трубки к каждой отдельной камере и начните измерение в программном обеспечении Ussing. Измените условия с режима обрыва цепи на режим короткого замыкания в программном обеспечении.
После пяти-10 минут уравновешивания добавьте в серозальную камеру 10 микромолярных форсколинов. Через 15 минут остановите измерение, снимите с камер аэрационные трубки и электроды, а камеры разберите. Значения трансэпителиального электрического сопротивления постепенно увеличивались во время культивирования, достигая максимума в 150 Ом, умноженных на квадратный сантиметр для тощей кишки через 18 дней, и 200 Ом квадратного сантиметра для органоидов толстой кишки через девять дней.
Значения базального тока короткого замыкания были достоверно ниже в органоидах тощей кишки, чем в органоидах толстой кишки, в то время как значения базального сопротивления не показали существенных различий. Лечение Форсколином значительно увеличило значения базального тока короткого замыкания в тощицких органоидах с 0,86 до 27,78 микроампер на квадратный сантиметр, а в органоидах толстой кишки с 3,83 до 28,78 микроампер на квадратный сантиметр.
