Зубные пластинчатые биопленки состоят из сотен микроорганизмов, которые могут вызывать воспаление в эпителии полости рта, приводящее к таким заболеваниям, как гингивит. Мы хотим лучше понять эти взаимодействия, используя органотипические модели тканей. Эти системы предоставляют полезные платформы для оценки альтернативных методов лечения контролируемым образом.
Таким образом, развитие технологий секвенирования в последние годы трансформирует область биологии инфекций. Эти технологии позволяют нам по-настоящему исследовать взаимодействия патогенов хозяина, используя различные методы OMICs путем оценки сигнатур хозяина и микроорганизмов на протеомическом, транскриптомном и метаболомном уровнях. Наше недавнее исследование подчеркнуло важность межмикробных взаимодействий и полимикробных взаимодействий при инфекциях, связанных с биопленкой.
С помощью модельных систем in vitro мы смогли исследовать взаимодействия биопленок хозяина, протестировать новые антибиопленочные терапевтические средства и профилировать микробные сообщества с использованием инновационных технологий, таких как оперативная память и спектроскопия. Будущие исследования с использованием этих органотипических моделей тканей будут направлены на достижение мульти-OMIC-сигнатуры и совместного профилирования микроорганизма и ткани и культуры хозяина. Мы надеемся раскрыть и распутать сложные взаимодействия между хозяином и конкретными бактериями и видами грибов в наших биопленочных моделях.
Для начала удалите замороженные стебли пористых шариков, содержащих стрептококки при температуре от 80 градусов по Цельсию. Оживите виды стрептококков на базовых пластинах шнека Columbia Blood Auger, содержащих 5% стерильной дефибринированной лошадиной крови. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.
На следующий день переложите три-четыре колонии с тарелки по 10 миллилитров триптонного соевого отвара среды. Заквашивайте бульон при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 16-18 часов. После инкубации клеточные суспензии центрифугируют при 3000 G в течение пяти минут при 20 градусах Цельсия.
Промойте клеточные гранулы 10 миллилитрами стерильного PBS. Повторно суспендируйте гранулы в 10 миллилитрах PBS и стандартизируйте суспензию каждого вида стрептококка, индивидуально, используя спектрофотометр, установленный на 550 нанометров. После стандартизации разбавьте каждую суспензию стрептококка от одного до 10, чтобы достичь концентрации один умножить на 10 в степени семи клеток на миллилитр в соотношении один к одному из бульона Тодда Хьюитта и среды Мемориального института Розуэлла Парка.
Пипеткой внесите 500 микролитров разбавленных клеточных суспензий в 24-луночный микротитровский планшет, содержащий 13-миллиметровый гидроксиапатитовый диск. Инкубируйте культуру в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить образование биопленки. Аналогичным образом культивируют анаэробные микроорганизмы на привередливой анаэробной шнековой основе, содержащей 5% стерильной дефибринированной лошадиной крови.
Стандартизируйте каждый анаэробный микроорганизм до определенной абсорбции и разбавьте их в индивидуальной смеси бульона Тодда Хьюитта и среды Мемориального института Розуэлл-Парка. После созревания биопленки стрептококка следует осторожно удалить из лунок не прилипшие клетки и отработанные среды. Добавьте в каждую лунку 500 микролитров стандартизированных из расчета «один умножить на 10» в степень семи клеток на миллилитр суспензий четырех анаэробных микроорганизмов.
Инкубируйте биопленки в течение 24 часов в анаэробных условиях при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день удалите из лунок не прилипшие клетки и отработанные среды. Добавьте 500 микролитров стерильной смеси один к одному смеси бульона Тодда Хьюитта и среды Roswell Park Memorial Institute.
Культивировать биопленки в анаэробных условиях в течение 24 часов. На седьмой день дважды промойте биопленки 500 микролитрами стерильного PBS для совместного культивирования. Для начала распакуйте и перенесите эпителий полости рта человека или ткань и среду HOE в безопасный шкаф второго класса.
Добавьте один миллилитр поддерживающей среды, поставляемой с тканью, в каждую лунку 12-луночного планшета. С помощью стерильного пинцета удалите поликарбонатные вставки, содержащие ткань МОТЫГ, с питательного шнека, а также 24 скважину транспортировочной пластины. Переложите ткань на подготовленную 12 лунку пластину.
Инкубируйте модели тканей в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы акклиматизировать их к лабораторным условиям. Между тем, чтобы удалить биопленки с гидроксиапатитовых дисков, используйте иглу 19 калибра и пинцет, чтобы поднять диски со дна 24-луночной пластины. Переложите диски в бижутерию, содержащую один миллилитр стерильного DPBS.
Ультразвуком обрабатывайте диски с частотой 35 килогерц в течение 10 минут на ультразвуковой водяной бане. После акклиматизации с помощью пинцета удалите тканевые вставки из 12-луночной пластины. Пипеткой 100 микролитров биопленочной ультразвуковой суспензии непосредственно на тканевые модели.
Переложите вкладыши в другую 12-луночную пластину, содержащую один миллилитр свежей рабочей среды. Инкубируйте модели тканей в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Для обработки тканей приготовьте 350 микролитров буфера для RLT-лиза, содержащего 1%-ный пучок меркаптоэтанола в двухмиллилитровой пробирке с уплотнительным кольцом с винтовой крышкой.
Добавьте в тюбик примерно 100 микролитров 0,5 миллиметровых стеклянных шариков, промытых кислотой. С помощью пинцета извлеките вкладыши, содержащие ткань, из среды и выбросьте остатки микробной суспензии из вкладыша. Держите вкладыш перевернутым на уровне глаз, затем с помощью иглы 19 калибра аккуратно разрежьте ткань и мембрану с нижней части вкладыша.
Перенесите ткань и оболочку в подготовленный буфер RLT. Гомогенизируйте ткань в течение 30 секунд с помощью настольного гомогенизатора бусин. Извлеките РНК из полученного лизата, следуя инструкциям производителя по набору для экстракции РНК.
Соберите оставшуюся отработанную тканевую среду для протеомного анализа, используя методологии с низкой и высокой пропускной способностью. Экспрессия генов воспалительных биомаркеров в ткани ГОЭ была значительно повышена после воздействия биопленочного ультразвука по сравнению с нестимулированным контролем. Наибольшие изменения складчатости наблюдались для CCL2, CXCL1 и CSF3.
Экспрессия мРНК IL8 в тканях HOE была увеличена в 8,67 раза после стимуляции биопленочным ультразвуком по сравнению с контролируемой тканью. Уровни белка IL8 в отработанных средах были увеличены с 1,005 нГ на миллилитр в контрольной ткани до 4,245 нГ на миллилитр в ткани, стимулированной биопленкой ультразвуком.
