היקף המחקר שלנו מתמקד בעיקר בפיתוח תאי iPSC CAR NK אנושיים עם פעילות אנטי-גידולית משופרת והתמדה in vivo לטיפול טוב יותר בגידולים מגוונים. עם פרוטוקול הדור החדשני הזה של CAR iPSC NK, אנו שואפים לענות על השאלה כיצד תאים אלה יכולים להתגבר על עמידות מיקרו-סביבתית של גידול ולשפר את היעילות ולהבטיח ייצור בטוח וניתן להרחבה. האתגרים הניסויים העיקריים בפיתוח תאי CAR NK שמקורם ב-iPSC כוללים השגת התמיינות עקבית ויעילה של iPSC לתפקוד במקרים המבטיחים ביטוי CAR יציב ללא תופעות לוואי ושיפור ההתמדה in vivo.
בנוסף, חוקרים מתמודדים עם אתגרים במדרגיות, דחייה חיסונית ומחזיקי רגולציה ליישומים קליניים. קידמנו משמעותית את מחקר תאי ה-CAR NK שמקורו ב-iPSC על ידי ביסוס אינטגרציה יעילה של גנים CAR מבוססי טרנספוזון. בנוסף, ביצענו אופטימיזציה של CRISPR-Cas9 ברמת iPSC כדי למחוק נקודות ביקורת חיסוניות, גורמי TMA לשיפור ומקרים של יעילות תאים וגידול והתמדה in vivo במודלים של גידולים מוצקים.
עם הפרוטוקול שלנו המשתמש בביטוי גן CAR בתיווך וקטור חזיר לא ויראלי, אנו שואפים לטפל בפער לפיתוח שינוי גנים בטוח, יעיל וניתן להרחבה עבור תאי iPSC CAR NK, שיטה זו מפחיתה את הסיכון למוטגנזה החדרתית משפרת את יכולת השחזור והעלות האפקטיבית של יצירת תאי CAR NK לאימונותרפיה של סרטן. בעתיד המעבדה שלנו תתמקד בפיתוח תאי NK מהונדסים חדשים שמקורם ב-iPSC המכוונים לנקודות ביקורת חיסוניות. כמו כן, נחקור התמקדות בגורמים מיקרו-סביבתיים שונים של גידול על ידי שימוש בנוגדנים דו-ספציפיים או תלת-ספציפיים כדי לשפר את הספציפיות בהתמדה ופעילות אנטי-גידולית.
כדי להתחיל בגוף עובר ספין או מעבר היווצרות EB, כ-200,000 iPSCs מהונדסים של CAR לבאר בצלחת מקודדת מראש של מטריצת קרום מרתף של שש בארות המכילה עודף MT, לדגור על התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, לאחר יומיים, להסיר את מדיום התרבית ולנתק את התאים על ידי דגירה עם מיליליטר אחד של TrypLE Select חם מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן נתק בזהירות את אגרגטי התאים לתרחיף תא בודד והעביר את המתלה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף שלושה מיליליטר PBS כדי לעצור את תגובת הדיסוציאציה.
לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במדיום MK SR-plus וסננו אותם דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים. צנטריפוגה התאים. שטפו את הגלולה עם חמישה מיליליטר PBS ולאחר מכן השעו אותם מחדש במיליליטר אחד של מדיום היווצרות EB.
לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לצפיפות המתאימה באמצעות מדיום היווצרות EB המכיל ציטוקינים ומעכב ROCK 10 מיקרומולרי. שימוש בזרעי פיפטה רב-ערוציים 3000 עד 10,000 תאים לבאר ב-100 מיקרוליטר של מדיה EB בצלחת של 96 בארות. צנטריפוגה של התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שישה ימים.
כדי לבדוק את איכות גוף העובר, הכינו תחילה ארבעה מיליליטר של 0.25% טריפסין שחומם מראש עם 0.4% סרום עוף לניתוק ה-EBs. לאחר שישה ימים העבירו 10 עד 30 EBs לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף תמיסת סרום עוף טריפסין ל-EBs ודגר אותם באמבט מים.
מערבולת ה-EBs במהלך ניתוק כל שלוש עד חמש דקות למשך 10 דקות. פיפטה את ה-EBs הטריפסיניים מתערבבים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח דיסוציאציה יסודית. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר PBS כדי לעצור את תהליך הטריפסיניזציה.
סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות והשעיה מחדש של הגלולה בשלושה עד חמישה מיליליטר של מדיה EB טרייה. לאחר הספירה, צבעו את התאים בסמני EB טיפוסיים.
הוסף את נפח הנוגדנים המומלץ לכל צינור המכיל תאים בודדים מנותקים של EB ב-100 מיקרוליטר של מאגר זרימה ודגירה על קרח למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר זרימה. הוסף כתם מת חי כחול של SYTOX ונתח באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.
התחל בקידוד כל באר של צלחת שש בארות עם חמישה עד 10 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין מעוקרת של 2%. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, שאפו כל תמיסת ג'לטין שנותרה והוסיפו שלושה מיליליטר של הרוצח הטבעי או מדיום התמיינות NK המכיל ציטוקינים לכל באר של צלחת שש הבארות המצופה בג'לטין.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, העבירו בזהירות EBs ספין שמקורם ב-CAR iPSCs מהונדסים לצלחת של 10 סנטימטרים. הוסף שלושה מיליליטר של מדיום התמיינות NK המכיל ציטוקינים לכל באר של צלחת שש הבארות. באמצעות מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד מפזר 16 עד 20 EBs לכל באר של צלחת שש הבארות ודוגר ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שלושה עד ארבעה שבועות.
לאחר הדגירה העריכו את הביטוי של סמני תאי NK CD45 חיוביים ו-CD56 חיוביים על ידי זרימה ציטומטרית על תאי השעיה. כאשר יותר מ-80% מתאי ההשעיה מבטאים CD45 חיובי ו-CD56 חיובי. קצרו את התאים על ידי העברתם דרך פילטר של 70 מיקרומטר להסרת גושים.
לפני תרבית משותפת, תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים או APCs מלאכותיים בתוך תאי NK, יש להקרין את הנגמ"שים המלאכותיים ב-100 אפורים ולשמר אותם כגבעולים קפואים. לאחר קצירת תאי NK, תרבית אותם בצפיפות של חמש פעמים 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר במדיום הרחבת NK בתוספת 50 יחידות למיליליטר של אינטרלוקין-2 ואינטרלוקין-15. הוסף APCs מלאכותיים המוקרנים להפשרה לתאי NK ביחס של אחד לאחד ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
כדי להתחיל, הפעל את ציטומטר הזרימה. הערך את ביטוי קולטן ההפעלה NK על תאי NK שמקורם ב-anti GPC3 CAR iPSC כדי לקבוע את פעילות תאי ה-CAR ומצב ההתבגרות. עבור מבחני Caspase-3/7.
ספרו את תאי המטרה בתאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC וצבעו אותם מראש בצבע סגול CellTrace בריכוז סופי של חמישה מיקרומולר ב-PBS תחת הגנה מפני אור למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו את תאי המטרה של הכתם במדיום תרבית שלם לפני תרבית משותפת עם תאי NK שמקורם ב-CAR iPSC ביחסי אפקטור למטרה שונים ב-37 מעלות צלזיוס. אחרי שלוש שעות ו-30 דקות של תרבות משותפת.
הוסף מגיב זיהוי ירוק Caspase-3/7 ודגירה למשך 30 דקות נוספות. הוסף תמיסת צביעת תאים מתים של SYTOX במהלך חמש הדקות האחרונות של הצביעה וערבב בעדינות. נתח את התאים המוכתמים באמצעות ציטומטריית זרימה.
היווצרות EBs ספין מ-IPCs מהונדסים GPC3 CAR נצפתה ביום השישי. אישור בידול מוקדם. תאי הרג טבעיים או תאי NK מובחנים מ-GPC3 CAR IPCs הראו מורפולוגיה מובהקת בשלבים שונים מהיום השלישי עד היום ה-28.
ניתוח זרימה ציטומטרי מדגים את הביטוי של אנטיגנים המטופויאטיים CD34 ו-CD31 כמו גם כמות קטנה של CD43 אך עדיין לא מבטאים CD45 הן בסוג הבר והן ב-GPC3 CAR iPSCs הנגזר מ-GPC3 CAR ePSCs ספין EBs ביום השישי. סמנים ספציפיים למקרה זוהו בסוג בר בוגר בתאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC ביום 35. אישור התמיינות מוצלחת לתאי NK.
תאי NK מורחבים מסוג בר ואנטי GPC3 CAR iPSC הראו סמני הפעלה שונים, המדגימים התבגרות של תאי NK. ביטוי אנטיגן GPC3 אושר על קווי תאי גידול באמצעות ציטומטריית זרימה, ואימת את ספציפיות המטרה עבור תאי NK שמקורם ב-anti GPC3 CAR iPSC. תאי NK שמקורם ב-anti GPC3 CAR iPSC הראו פעילות ציטוטוקסית גבוהה יותר כנגד קווי תאי GPC3 המבטאים HepG2, SNU-449, CAL 27 ו-SKOV3 בהשוואה לתאי iPSC NK מסוג בר.
