Мы заинтересованы в открытии новых клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих стволовую природу клеток. Наша основная цель — расшифровать, как стволовые клетки избегают дифференцировки в нишах. Поскольку мы работаем в экспериментальных условиях, важно сохранить целостность тканей, чтобы обеспечить физиологическое поведение ГСК.
Наш протокол поддерживает здоровую и функциональную нишу GSC, позволяя контролировать разделение GSC так, как это было бы in vivo. Использование визуализации с увеличенной продолжительностью жизни позволяет изучать весь клеточный цикл ГСК и спектросомную динамику. В частности, мы успешно охарактеризовали спектросомные изменения в клеточном цикле, что ранее было трудно сделать с помощью фиксированных изображений или более коротких периодов визуализации.
Знание того, как проводить в основном эксперименты, не влияя на его динамику, позволяет нам исследовать, как взаимодействуют нишевые клетки. Мы хотим изучить регуляторные механизмы экспрессии генов и клеточного метаболизма, опосредованные прямым взаимодействием между мРНК, метаболическими ферментами в биологии стволовых клеток. Для начала приготовьте 100 микролитров аликвоты смеси антибиотика стрептомицина пенициллина в концентрации 10 000 единиц на миллилитр.
Подготовьте все остальные необходимые реагенты для процедуры и храните их надлежащим образом. Соберите однодневных или двухдневных мух, экспрессирующих вездесуще и конститутивно выраженный пар один, слитый с GFP, в новую пробирку. Культивируйте мух в течение двух суток при температуре 25 градусов Цельсия в инкубаторе перед вскрытием.
Нанесите каплю специального клея Cell-Tak объемом три микролитра в центр покровного стекла пластины с покрытием из поли-D-лицина. Немедленно добавьте равный объем 0,1 моляра бикарбоната натрия с pH восемь к трем микролитрам адгезивной капли. Смешайте раствор с помощью пипетки.
Для полного испарения инкубируйте тарелку с крышкой при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем храните тарелку при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. После размораживания тарелки на следующий день тщательно промойте ее три раза шестью микролитрами автоклавной чистой воды, не касаясь и не тревожа клеевой слой.
Дайте воде полностью испариться при комнатной температуре в течение пяти-10 минут. Для начала культивируем мух и подготавливаем стеклянную донную пластину с покрытием. Затем очистите трехлуночную диссекционную чашку, щипцы и иглы для препарирования 70% этанолом.
Добавьте примерно по 200 микролитров раствора рингера в каждую из трех лунок чашки для вскрытия. С помощью щипцов захватите самку дрозофилы на пересечении грудной клетки и брюшка. Аккуратно оторвите кутикулу в задней части живота и оттяните ее назад, чтобы обнажить яичники.
После рассечения яичников перенесите их в следующую лунку, чтобы уменьшить загрязнение остатками тканей или мусором от вскрытия. Под стереомикроскопом со светодиодной подсветкой используйте одну пару тонких щипцов, чтобы закрепить весь яичник, а вторую пару — для захвата яйцеклетки на поздней стадии. Аккуратно растягивайте до тех пор, пока мышечная оболочка не сломается и не отстанет.
С помощью щипцов пересадите от 15 до 20 яичников без мышечной оболочки один за другим в третью лунку, содержащую 200 микролитров среды Рингера. Предварительно смочите кончик объемом 200 микролитров 0,1%Tween 20, чтобы яичники не прилипли к стенке кончика. Перенесите шесть микролитров раствора Рингера, содержащего яичники без мышечной оболочки, с помощью предварительно смоченного наконечника на подготовленную клеевую пластину при комнатной температуре.
С помощью рассекательной иглы или щипцов осторожно прижмите яичники к нижней части капли звонка, чтобы обеспечить контакт с клейкой поверхностью. Далее добавьте в планшет MatTek три миллилитра среды Шнайдера, дополненной 15% FBS и 0,6% смесью антибиотика Streptomycin penicillin. Транспортируйте пластину, содержащую яичники без мышечной оболочки, по плоской поверхности на станцию микроскопа.
Поместите пластину на объектив с 63-кратным увеличением микроскопа с вращающимся диском или конфокального микроскопа. Сфокусируйте образец и выберите среднюю плоскость Z для каждого германия. Чтобы настроить экспериментальные параметры, установите тип съемки 3D таймлапс.
Отрегулируйте мощность лазера до 70% от максимальной. Установите длину волны возбуждения равной 488 нанометрам. Диапазон стека Z до 30 микрометров и расстояние между стеками Z до 1,2 микрометра.
Установите интервал между временными точками каждые 10 минут и продолжительность 17 часов. Если это возможно, используйте опцию с несколькими позициями, чтобы переопределить XY образцов. Выберите плоскость Z в середине каждого гермариума так, чтобы стеки Z были центрированы в этой позиции, и начните сбор.
Анализируйте изображения во времени и по оси Z, чтобы визуализировать изменения морфологии спектросом с помощью программного обеспечения Imaris или Image J. Чтобы создать видеоролики, вручную выберите наилучшую плоскость Z в каждой временной точке. Сильный сигнал GFP par one круглой спектральной зоны G2 был значительно снижен во время фаз G2 MG1.
Во время ранней профазы GFP par one покидал спектросому и заполнял цитоплазму, что указывает на вхождение стволовых клеток зародышевой линии в митоз. После митоза и формирования ядерной оболочки сигнал GFP par one постепенно восстанавливался в круглом спектральном цикле G1. Denovo версия GFP par one к круглой спектросоме G1 привела к образованию морфологий спектросом plug, bar и fuseing.
