Мы представляем ценный экспериментальный подход к исследованию кинетики внезапной активации внутренних вегетативных нейронов в перфузированных сердцах и взаимодействия между сердечной катехоламинергической и холинергической активностью. Перфузированные сердца мышей могут быть очень чувствительны к изменениям окружающей среды, таким как температура, оксигенация и концентрация перфузата. Они требуют более тщательного мониторинга, чем более крупные животные модели.
Кроме того, для получения стабильных результатов для получения стабильных результатов поначалу может потребоваться некоторое количество проб и ошибок. Мы работаем над тем, чтобы понять, что происходит в сердце, когда симпатическая и парасимпатическая системы активируются одновременно. Новым является то, что мы изучаем эту тему с помощью оптогенетики для фотостимуляции сердечных ганглиев и нейронов в самом сердце.
Показанный здесь микро-светодиод недорог и относительно прост в воспроизведении. Благодаря своим размерам, микросветодиод является маневренным и может воздействовать на области сердца более точно, чем большие источники света. Для начала под препарирующим микроскопом в хорошо проветриваемом помещении припаяйте зачищенные концы двух изолированных медных проводов к точкам контакта 465-нанометрового микросветодиода.
Подключите micro-LED к источнику питания и включите его, чтобы проверить пайку. Отрежьте нижний сантиметр от 200-микролитрового фильтрованного наконечника для пипетки. Вытолкните фильтр с помощью стержня малого диаметра.
Вставьте микросветодиод с присоединенными проводами в наконечник пипетки так, чтобы светодиод находился на одном уровне с концом наконечника. Установите на место фильтр в верхней части наконечника дозатора, чтобы зафиксировать светодиод и провода. Затем приклейте края светодиода к наконечнику пипетки.
Дайте суперклею высохнуть. Для приготовления силиконового эластомера смешайте основу и отвердитель до тех пор, пока раствор не станет однородным. Удалите из смеси пузырьки с помощью вакуумной камеры.
Затем возьмите центрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра и надрежьте боковые стороны, чтобы облегчить удаление светодиодов. Обмотайте лентой внешнюю сторону трубки центрифуги, чтобы предотвратить утечку. Налейте в тюбик примерно 0,2 миллилитра силиконового эластомера.
Поместите наконечник пипетки micro-LED в трубку так, чтобы расстояние между светодиодом и дном трубки составляло не менее одного миллиметра. Поместите трубку центрифуги micro-LED вертикально в духовку при температуре 50 градусов Цельсия на восемь часов или на ночь. Как только эластомер затвердеет, снимите светодиод с трубки.
После отверждения обрежьте излишки эластомера со светодиодного наконечника прецизионным канцелярским ножом, оставляя не более одного миллиметра. Для начала добавьте в перфузионную систему 175 миллилитров раствора Krebs-Henseleit или KH. Поместите мембранный фильтр 10 микрон в перфузионную систему Лангендорфа.
Затем запустите циркуляцию. Включите водяные бани и установите их на поддержание температуры перфузата на уровне 37 градусов по Цельсию. Чтобы откалибровать расходомер, остановите поток в системе перфузии с помощью запорного крана.
Затем нажмите кнопку «ноль» на расходомере, чтобы выполнить калибровку. Откройте программу для сбора данных LabChart. Настройте программное обеспечение так, чтобы оно включало 12 каналов.
Настройте каналы для температуры сердечной ванны, температуры перфузата аорты, отведений ЭКГ от одного до трех для дополнительных вычисленных отведений, расчета частоты сердечных сокращений, скорости потока и выхода генератора функций для отслеживания импульсов светодиодов. Затем используйте канал, предназначенный для измерения частоты сердечных сокращений, для расчета частоты сердечных сокращений. Активируйте функцию циклических измерений, настроив ее на определение ЭКГ мыши в одном отведении.
Используйте расширение Cardiac Access от LabChart для вычисления трех отведений aVR, aVL и aVF на основе отведений один и два. После обезболивания и усыпления мыши зажмите мечевидный отросток парой щипцов, а брюшную полость разрежьте с помощью хирургических ножниц. Аккуратно прорежьте диафрагму, чтобы открыть грудную полость.
Затем разрежьте ребра, чтобы обнажить сердце и легкие. Аккуратно возьмитесь за легкие, и иссеките сердце и легкие. Поместите сердце в чашку с раствором гепаринизированного KH.
Удалите легкие и любые крупные жировые отложения. Под препарирующим микроскопом установите 2-кратное увеличение. Переложите очищенное сердце во вторую чашку с раствором гепаринизированного KH.
Найдите аорту и наденьте ее на канюлю с помощью тонких щипцов. Закрепите сердце на канюле шелковым швом 4-0. Далее промойте канюлю болюсом гепаринизированной KH для удаления крови из коронарных сосудов.
Подключите канюлированное сердце к системе перфузии и поместите его в чашку PDMS, наполненную перфузатом. Поместите игольчатые электроды ЭКГ в чашку PDMS в соответствии с треугольником Эйнтховена. Поверните сердце так, чтобы левое предсердие было доступно.
С помощью микросамооткрывающихся ножниц сделайте разрез размером в один миллиметр в левом предсердии. Вставьте в разрез трубку диаметром один миллиметр, чтобы обеспечить дренаж застрявшего перфузата в левом желудочке. Затем поверните сердце так, чтобы правое предсердие было обращено вверх, а синоатриальный узел был доступен для освещения.
При необходимости отрегулируйте электроды ЭКГ, переместив их ближе к сердцу, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Для оптогенетической активации подключите устройство micro-LED к функциональному генератору и настройте его на выдачу пульсовых волн с частотой 10 герц, длительностью импульса 30 миллисекунд и амплитудой 10 вольт от пика до пика. Аккуратно поместите микросветодиод на синоатриальный узел.
Затем включите генератор функций и наблюдайте за изменениями частоты сердечных сокращений от фотостимуляции. Немедленные изменения частоты сердечных сокращений указывают на эффективную активацию. Выключите генератор функций.
Дайте частоте сердечных сокращений вернуться к уровню, предшествовавшему активации. Если оптогенетическая активация приводит к изменению частоты сердечных сокращений менее чем на 100 ударов в минуту, переместите микросветодиод так, чтобы он освещал нейроны в правом предсердии. Оптогенетическая стимуляция нейронов ChAT снижала частоту сердечных сокращений более чем на 100 ударов в минуту во время световой стимуляции без норадреналина, поддерживая снижение на протяжении всей стимуляции.
При введении 2000 наномолей норадреналина частота сердечных сокращений снизилась на 40 ударов в минуту и начала восстанавливаться еще до того, как свет был выключен. Оптогенетическое подавление частоты сердечных сокращений с помощью фотостимуляции нейронов ChAT было менее эффективным в преодолении увеличения частоты сердечных сокращений, вызванного высокими дозами норадреналина, что приводило к более короткому времени подавления и меньшему снижению частоты сердечных сокращений.
