Presentiamo un valido approccio sperimentale per studiare la cinetica dell'improvvisa attivazione intrinseca dei neuroni autonomici nei cuori perfusi e l'interazione tra attività catecolaminergica cardiaca e colinergica. I cuori di topo perfusi possono essere molto sensibili ai cambiamenti nell'ambiente, come la temperatura, l'ossigenazione e la concentrazione di perfusi. Richiedono un monitoraggio più attento rispetto ai modelli animali più grandi.
Inoltre, all'inizio il micro-LED può richiedere alcuni tentativi ed errori per ottenere risultati coerenti. Stiamo lavorando per capire cosa succede nel cuore quando i sistemi simpatico e parasimpatico vengono attivati contemporaneamente. La novità è che stiamo studiando l'argomento utilizzando l'optogenetica per fotostimolare i gangli cardiaci e i neuroni all'interno del cuore stesso.
Il micro-LED mostrato qui è a basso costo e relativamente semplice da replicare. Grazie alle sue dimensioni, il micro LED è manovrabile e può mirare alle aree del cuore in modo più preciso rispetto alle sorgenti luminose più grandi. Per iniziare, sotto un microscopio da dissezione in un'area ben ventilata, saldare le estremità spelate di due fili di rame isolati ai punti di contatto di un micro-LED da 465 nanometri.
Collegare il micro-LED a una fonte di alimentazione e accenderlo per testare la saldatura. Tagliare il centimetro inferiore di un puntale per pipetta filtrato da 200 microlitri. Spingere fuori il filtro utilizzando un'asta di piccolo diametro.
Inserire il micro-LED con i fili collegati nel puntale della pipetta in modo che il LED sia a filo con l'estremità del puntale. Riposizionare il filtro nella parte superiore del puntale della pipetta per fissare il LED e i cavi. Quindi incollare i bordi del LED sulla punta della pipetta.
Lascia asciugare la supercolla. Per preparare l'elastomero siliconico, mescolare la base e l'agente indurente fino a quando la soluzione non diventa uniforme. Eliminate eventuali bolle dal composto utilizzando una camera a vuoto.
Quindi, prendi una provetta da centrifuga da 0,5 millilitri e incidi i lati per facilitare la rimozione dei LED. Fissare con nastro adesivo l'esterno della provetta da centrifuga per evitare perdite. Versare circa 0,2 millilitri di elastomero siliconico nel tubo.
Posizionare il puntale della pipetta micro-LED nella provetta, assicurando almeno un millimetro di spazio tra il LED e il fondo della provetta. Posizionare la provetta da centrifuga micro-LED in posizione verticale in un forno a 50 gradi Celsius per otto ore o durante la notte. Una volta indurito l'elastomero, rimuovere il LED dal tubo.
Una volta indurito, tagliare l'elastomero in eccesso dalla punta del LED con un taglierino di precisione lasciando non più di un millimetro. Per iniziare, aggiungere 175 millilitri di soluzione di Krebs-Henseleit o KH al sistema di perfusione. Posizionare un filtro a membrana da 10 micrometri nel sistema di perfusione Langendorff.
Quindi inizia la circolazione. Accendi i bagnomaria e impostali in modo da mantenere la temperatura del perfusato a 37 gradi Celsius. Per calibrare il flussometro, arrestare il flusso nel sistema di perfusione utilizzando un rubinetto.
Quindi premere il pulsante zero sul flussometro per eseguire la calibrazione. Aprire il software di acquisizione dati LabChart. Configurare il software in modo che includa 12 canali.
Impostazione dei canali per la temperatura del bagno cardiaco, la temperatura del perfusato aortico, le derivazioni ECG da uno a tre per ulteriori derivazioni calcolate, il calcolo della frequenza cardiaca, la portata e un'uscita del generatore di funzioni per tenere traccia degli impulsi LED. Quindi, utilizzare il canale designato per la frequenza cardiaca per calcolare la frequenza cardiaca. Attiva la funzione di misurazione ciclica, impostandola per rilevare l'ECG del mouse sulla derivazione uno.
Utilizza l'estensione Cardiac Access di LabChart per calcolare le derivazioni tre aVR, aVL e aVF in base alle derivazioni uno e due. Dopo aver anestetizzato e soppresso il topo, tenere premuto il processo xifoideo con un paio di pinze e tagliare la cavità addominale usando le forbici chirurgiche. Tagliare con cura il diaframma per aprire la cavità toracica.
Quindi tagliare le costole per esporre il cuore e i polmoni. Afferra delicatamente i polmoni e asporta il cuore e i polmoni. Mettere il cuore in un piatto contenente una soluzione di KH eparinizzato.
Rimuovere i polmoni e gli eventuali depositi di grasso di grandi dimensioni. Al microscopio da dissezione, impostare su un ingrandimento 2x. Trasferire il cuore pulito in un secondo piatto di soluzione di KH eparinizzato.
Individua l'aorta e falla scorrere sulla cannula usando una pinza sottile. Fissare il cuore alla cannula con una sutura di seta 4-0. Quindi, sciacquare la cannula con un bolo di KH eparinizzato per rimuovere il sangue dai vasi coronarici.
Collegare il cuore cannulato al sistema di perfusione e posizionarlo nel piatto PDMS riempito di perfusato. Posizionare gli elettrodi dell'ago ECG nel piatto PDMS secondo il triangolo di Einthoven. Ruota il cuore in modo che l'atrio sinistro sia accessibile.
Usa le micro forbici ad apertura automatica per creare un'incisione di un millimetro nell'atrio sinistro. Inserire un tubo di un millimetro di diametro nell'incisione per consentire il drenaggio del perfusato intrappolato nel ventricolo sinistro. Quindi, ruota il cuore in modo che l'atrio destro sia rivolto verso l'alto e il nodo seno-atriale sia accessibile per l'illuminazione.
Regolare gli elettrodi ECG secondo necessità avvicinandoli al cuore per migliorare il rapporto segnale/rumore. Per l'attivazione optogenetica, collegare il dispositivo micro-LED a un generatore di funzioni e configurarlo per produrre onde di impulso con una frequenza di 10 hertz, un'ampiezza dell'impulso di 30 millisecondi e un'ampiezza di 10 volt da picco a picco. Posizionare delicatamente il micro-LED sul nodo senoatriale.
Quindi accendi il generatore di funzioni e osserva i cambiamenti nella frequenza cardiaca dovuti alla fotostimolazione. Cambiamenti immediati nella frequenza cardiaca indicano un'attivazione efficace. Spegnere il generatore di funzioni.
Consentire alla frequenza cardiaca di tornare ai livelli pre-attivazione. Se l'attivazione optogenetica provoca una variazione della frequenza cardiaca inferiore a 100 BPM, riposizionare il micro-LED per illuminare i neuroni nell'atrio destro. La stimolazione optogenetica dei neuroni ChAT ha ridotto la frequenza cardiaca di oltre 100 BPM durante la stimolazione alla luce senza che la noradrenalina sostenesse la riduzione durante la stimolazione.
Con 2.000 nanomoli di noradrenalina, la frequenza cardiaca è scesa di 40 BPM e ha iniziato a riprendersi prima che la luce si spegnesse. La soppressione optogenetica della frequenza cardiaca mediante fotostimolazione dei neuroni ChAT è risultata meno efficace nel superare gli aumenti della frequenza cardiaca indotti da alte dosi di noradrenalina, con conseguenti tempi di soppressione più brevi e diminuzioni minori della frequenza cardiaca.
