Как следует из названия нашего учреждения, Института медицины матери и плода, наши исследования в основном сосредоточены на женской репродуктивной биологии. Мы стремимся понять механизм возникновения нарушений репродуктивной функции и определить потенциальные мишени для их лечения. Одним из ключевых преимуществ этого подхода является существенное сокращение времени и затрат по сравнению с коммерчески доступными системами совместного выращивания.
Самодельные леса сооружаются из легкодоступных материалов, что значительно снижает стоимость установки. Эти многоклеточные модели in vitro лучше представляют сложную in vivo анатомию области имплантации. В будущем наша лаборатория представит другие типы клеток в эту многоклеточную модель in vitro со смешанным посевом и больше изучит как исследования имплантации, так и функцию матки в патогенезе таких заболеваний, как повреждение эндометрия и внутриматочное прикрепление.
Для начала приобретите напечатанный на 3D-принтере каркас для создания модели. Для клеточной культуры поместите чистый и стерильный 18-миллиметровый квадратный покровный лист на дно 12-луночного планшета. Покровное стекло покрыть 200 микролитрами внеклеточного матрикса в концентрации от 200 до 300 микрограмм на миллилитр.
Держите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем извлеките внеклеточный матрикс из пластины. Затем исследуйте ранее культивируемые эмбриональные стволовые клетки человека и клетки Исикавы под микроскопом, чтобы подтвердить соответствующее слияние.
Затем извлеките отработанную среду из лунок, и дважды промойте клетки тремя миллилитрами PBS. Теперь инкубируйте клетки с двумя миллилитрами фермента диссоциации при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут, чтобы отделить их. Нейтрализуйте реакцию с помощью готовой питательной среды.
Затем создайте одноклеточную суспензию путем пипетирования вверх и вниз. Теперь смешайте 100 микролитров клеточной суспензии с трипановым синим, поддерживая коэффициент разведения два. Затем наденьте покровное стекло на камеру гемоцитометра.
Заполните обе боковые камеры клеточной суспензией, смешанной с трипановым синим. Подсчитайте количество клеток в квадратах с обеих сторон под 20-кратным микроскопом и рассчитайте плотность клеток на основе подсчетов. Теперь засейте человеческие эмбриональные стволовые клетки в концентрации 10 в степени пяти клеток на миллилитр в подготовленную тарелку, содержащую свежую среду, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов.
Для клеточной линии Исикавы на следующий день засейте клетки в лунку без покровного стекла. Тщательно пропитайте каркасы этиловым спиртом и дважды дистиллированной водой на двое суток. После замачивания удалите двойную дистиллированную воду и закройте металлическую банку.
Затем простерилизуйте каркасы с помощью автоклава при температуре 121 градус Цельсия. После этого дайте им высохнуть. Добавьте примерно два миллилитра дополнительной среды в лунку с ячейками Исикавы.
Перенесите покровное стекло с прикрепленными человеческими эмбриональными стволовыми клетками на каркас, расположив клетку стороной вниз. Вставьте каркас в лунку, содержащую ячейки Исикавы. Для второй установки поместите покровное стекло с клетками Исикавы на каркас и вставьте его в лунку, содержащую эмбриональные стволовые клетки.
Инкубируйте системы совместного культивирования при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Аккуратно извлеките питательную среду из лунок, и аккуратно промойте клетки стерильным ПБС. С помощью тонких щипцов или пинцета снимите покровные стекла с прикрепленными клетками с посудой для культуры.
По желанию положите покровные листы в новую посуду с PBS, чтобы сохранить их увлажненность во время процесса переноса. Добавьте каплю PBS на чистое предметное стекло микроскопа и аккуратно перенесите покровное стекло, содержащее клетки, на каплю, убедившись, что клетки находятся на предметном стекле лицевой стороной вниз. Расположите подготовленное предметное стекло на предметном столике перевернутого микроскопа.
Выберите подходящий объектив объектива и используйте ручки грубой и тонкой фокусировки для регулировки фокусировки. Настройка параметров микроскопа, включая интенсивность освещения и настройки камеры. Используйте программное обеспечение микроскопа для получения изображений с желаемым увеличением и полем зрения.
Плотность обоих типов клеток оставалась низкой в условиях совместной культивирования через 72 часа, в то время как плотность независимо культивируемых клеток значительно увеличивалась. Длина совместно культивируемых эмбриональных стволовых клеток человека была короче, чем у тех, которые культивировались независимо.
