CRISPR-Cas9 опосредует делецию генов в плюрипотентных стволовых клетках человека, культивируемых в условиях отсутствия фидеров

Для начала засейте суспензию эмбриональных стволовых клеток человека на луночный планшет P24, покрытый Матригелем, 500 микролитрами среды. Инкубируйте в течение ночи, чтобы обеспечить прикрепление клеток. На следующий день инфицируйте прикрепленные клетки с кратностью инфекции 10, а также восемью микрограммами на миллилитр полибрена.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми часов. После инкубации замените среду на свежие среды с добавлением пенициллина стрептомицина, но без ингибитора породы. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, добавьте в среду 0,8 микрограмма на миллилитр пуромицина, чтобы начать процесс отбора.

Примерно через четыре-шесть дней разделите стабильные клетки в соотношении один к четырем и разверните их для криоконсервации и дальнейшего анализа. Чтобы выполнить отбор одиночных клеток, приготовьте клеточную суспензию, эквивалентную 500 клеткам, в 10 миллилитрах полной питательной среды. Засейте по 100 микролитров этой суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины.

Оставьте клетки в покое в инкубаторе на три дня, затем понаблюдайте за ними для дальнейшего роста. Затем отметьте лунки, содержащие одиночные клоны. Меняйте среду через день и инкубируйте до тех пор, пока колонии не достигнут достаточного размера для дальнейшего расширения, криоконсервации и анализа, что обычно занимает две недели.

Для начала необходимо получить человеческие эмбриональные стволовые клетки, дифференцированные в зависимости от судьбы нейроэктодермы. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, обработайте их 200 наномолями LDN193189 и 10 микромолями SB431542 в 100% нокаутных средах для замены сыворотки. По прошествии первых 24 часов инкубируйте клетки с двумя микромолями XAV939 в течение еще двух дней.

Через три дня постепенно снижайте процент нокаутирующих заместительных сред сыворотки в течение восьми дней с 75% до 50%, затем до 25% и, наконец, до 100% N2 среды. На 12-й день зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания с помощью Pax6 в качестве маркера нейроэктодермы. Для исследований по определению судьбы мезодермы обрабатывайте 70% клеток слияния тремя микромолями CHIR 99021 в определенных средах энтодермы в течение 24 часов.

После этого зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания, используя брахюры в качестве мезодерм-специфичного маркера. Для изучения эндодермальной стадии добавьте дефинитивную среду для энтодермы без CHIR 99021 и культивируйте клетки в течение дополнительных 24 часов. Для анализа формирования эмбриоидного тела засейте клетки на клеточных поверхностях с низким прикреплением, опуская Матригель, чтобы культивировать их в условиях суспензии.

Нокаутные клеточные линии А1, А5, В4 не показали изменения потенциала плюрипотентности, определенного по данным иммуноокрашивания на маркеры OCT4, NANOG и SOX2 по сравнению с контрольными клетками. Иммуноокрашивание маркера пролиферации клеток, KI67, не показало изменений в скорости пролиферации нокаутных клеточных линий по сравнению с контролем. Образование колоний и эмбриоидных тел в нокаутных клеточных линиях не влияло по сравнению с контролем.

Нокаутные клеточные линии А1, А5, В4 сохранили способность дифференцироваться в три клетки зародышевого слоя, что подтверждено иммуноокрашиванием на маркеры Pax6, брахиури и FOXA2, без изменения потенциала дифференцировки по сравнению с контрольными клетками.