Мы разработали метод микроскопии в реальном времени для количественного определения внеклеточных ловушек нейтрофилов или НВЛ. Эти НВЛ играют важную роль во врожденной иммунной защите. Однако стало ясно, что накопление НВЛ в тканях способствует патофизиологии множественных воспалительных и аутоиммунных заболеваний.
Из-за патологических последствий НЭО интерес к разработке антагонистов нетоза возрос. Для изучения ингибирования NETosis мы разработали метод микроскопии в реальном времени для количественной оценки высвобождения НВЛ у человека, что позволяет нам изучать NETosis и его ингибирование с высокой пропускной способностью. Нейтрофилы являются чувствительными клетками и могут изменять свою реакцию на раздражители в процессе очистки из-за механических, микробных и других видов стресса.
Поэтому важно валидировать протокол выделения нейтрофилов, чтобы свести к минимуму активацию нейтрофилов. Таким образом, этот метод позволяет изучать высвобождение НВЛ как у здоровых, так и у больных людей. Кроме того, это позволяет изучать кинетику образования НВЛ, индуцированную различными физиологическими стимулами.
С помощью этой высокопроизводительной микроскопии мы смогли продемонстрировать, что антагонист NETosis CIT-013, моноклональное антитело, нацеленное на цитруллинированные гистоны 2А и 4, способен эффективно ингибировать высвобождение НВЛ с помощью IC 50 или 4,6 наномоляра. Это демонстрирует, что данный анализ подходит для тестирования антагонистов нетоза. После сбора периферической крови у здорового добровольца в литиевую гепариновую пробирку, переложите кровь в свежую 50-миллилитровую пробирку.
Промойте пробирку с гепарином лития с помощью DPBS и переложите ее в ту же 50-миллилитровую пробирку, убедившись, что соотношение крови и DPBS составляет 1:1. После перемешивания добавьте разведенную кровь поверх раствора градиента плотности. Центрифугируйте кровь при 400 G в течение 40 минут с минимальным ускорением и перерывом.
Выбросьте верхний слой плазмы с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. Затем с помощью пластиковой пастеровской пипетки удалите мононуклеарные клетки периферической крови и раствор градиента плотности. Аккуратно встряхните слой, содержащий эритроциты и нейтрофилы, перед тем как повторно суспендировать его в 15 миллилитрах DPBS.
Добавьте 25 миллилитров 6%-ного декстрана и 0,9%-ного раствора хлорида натрия и перемешайте, перевернув трубку. После 25 минут инкубации перенесите верхний слой нейтрофилов в свежую 50-миллилитровую пробирку с пипеткой объемом 10 миллилитров и центрифугируйте при 500 G в течение 10 минут. Сцедите пробирку, чтобы сбросить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу в 10 миллилитрах буфера для лизиса калия хлорида аммония.
Добавьте 40 миллилитров того же буфера для лизиса и инкубируйте при комнатной температуре, непрерывно переворачивая трубку, пока раствор не станет полупрозрачным. Центрифугируйте пробирку при 350 G в течение 10 минут. После удаления надосадочной жидкости медленно и по каплям добавьте пять миллилитров питательной среды, 10% поверх гранулы нейтрофилов, не превращая нейтрофилы во взвешенное состояние.
Осторожно вращайте пробирку до тех пор, пока большая часть эритроцитов, присутствующих в верхней части гранулы нейтрофилов, не будет повторно суспендирована в питательной среде. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу нейтрофила в 10 миллилитрах питательной среды, 10% После полной ресуспендирования добавьте до 50 миллилитров питательной среды 10% и центрифугируйте смесь перед повторной суспендированием гранулы в 10 мл буфера для анализа Neutrophil Extracellular Trap или НВЛ. Для начала добавьте 0,001% раствор поли-L-лизина в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубируйте в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.
Трижды промойте лунки 200 микролитрами DPBS и просушите лунки на воздухе. Затем повторно суспендируйте необходимое количество нейтрофилов в буфере для анализа Neutrophil Extracellular Trap или NET. Перенесите четырехкратно концентрированный ДНК-краситель в буфере для анализа NET в каждую лунку.
Добавьте в соответствующие лунки четырехкратно концентрированные стимулы NETosis в буфере для анализа NET. Затем добавьте в соответствующие лунки четырехкратно концентрированные антагонисты нетоза в буфере для анализа NET и суспензии нейтрофилов. Центрифугируйте планшет при 100 G в течение двух минут.
Затем вставьте планшет в систему микроскопии живых клеток, помещенную в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После помещения 96-луночной визуализирующей пластины, содержащей суспензию нейтрофилов, в систему микроскопии живых клеток откройте системное программное обеспечение. Нажмите «Запланировать» для приобретения и нажмите кнопку с плюсом для запуска.
Затем выберите «Сканировать по расписанию» и нажмите «Далее». Чтобы создать новое судно с нуля, выберите новое в разделе создания судна и нажмите далее. В разделе Тип сканирования выберите Стандартный и нажмите кнопку Далее.
Выберите настройки сканирования как ячейка за ячейкой, нет. Каналы изображения, фазовый контраст в зеленом цвете. Время захвата, 100 миллисекунд и цель 20x.
Затем нажмите «Далее». В разделе «Выбор сосуда» выберите подходящий тип сосуда для сканирования и нажмите «Далее». Укажите место в ящике стола для судна и нажмите кнопку «Далее».
В разделе «Шаблон сканирования» выберите скважины, которые необходимо отсканировать, и количество изображений в каждой скважине. Нажмите Далее. В разделе «Блокнот судна» укажите информацию о судне.
Введите название таблички и нажмите кнопку Далее. В разделе Настройка анализа выберите Отложить анализ на последующий период и нажмите кнопку Далее. В разделе Расписание сканирования выберите Создать новое расписание со сканированием с интервалами и выберите один час в разделе Добавить сканирование в расписание.
Выберите Остановить сканирование через пять часов после первого сканирования. Нажмите Далее и нажмите Добавить, чтобы запланировать сканирование, когда информация о сканировании будет верной. После получения фазово-контрастных и иммунофлуоресцентных изображений нейтрофилов запустите программное обеспечение для микроскопии живых клеток.
В окне просмотра выберите эксперимент с микроскопией живых клеток для анализа. Выберите Create New Analysis Definition (Создать новое определение анализа) и нажмите кнопку Next (Далее). Затем выберите базовый анализатор в разделе Тип анализа и нажмите кнопку Далее.
В разделе «Канал изображения» выберите зеленый цвет, отмените выбор фазы и нажмите «Далее». Откройте окно слоев изображения, выберите зеленый цвет и отмените выбор фазы. Отключите автомасштабирование в зеленом разделе и вручную установите min и max.
Затем откройте временное окно сканирования сосуда и выберите изображения, представляющие положительные контрольные скважины с НЭО. Откройте окно настроек определения анализа и запишите NET для имени объекта. Для сегментации выберите Адаптивный.
Для порогового значения GCU выберите от трех до пяти и установите значение Edge Split On в диапазоне от минус 10 до нуля. Далее, для очистки, выберите «Заполнение отверстий» до 100 квадратных микрометров и отрегулируйте размер до минус одного пикселя. В разделе Фильтры выберите область больше 200 квадратных микрометров, Среднюю интенсивность меньше 24,6 и Интегрированную интенсивность больше 7 000.
Затем нажмите «Просмотреть текущий вариант» или «Просмотреть все», чтобы применить настройки. Наведите указатель мыши на различные структуры NET и настройте параметры анализа для точной настройки ложноположительных и ложноотрицательных NET. Если настройки для анализа NET верны, нажмите кнопку Далее.
Выберите временные точки и скважины для анализа в разделе Время сканирования и скважина и нажмите кнопку Далее. Вставьте имя определения в раздел Сохранить и применить определение анализа и нажмите кнопку Далее. Нажмите кнопку Готово, когда информация об анализе будет проверена и верна.
Откройте анализ эксперимента, щелкнув анализ в интересующем сосуде. Затем откройте окно метрик графика. Затем нажмите кнопку с плюсом, чтобы создать метрику.
При представлении данных в процентах от NET confluency выберите «Площадь» в разделе «Метрика» и выберите «Confluence» в разделе «Значение». При представлении данных в процентах от нейтрофилов NETting выберите «Количество объектов» в разделе «Метрика» и выберите «На изображение» в разделе «Значение». После настройки параметров метрик в пользовательском разделе Метрики выберите NETs Area Confluence или NETs Object Count Per Image.
Выберите все необходимые временные точки и скважины для анализа в разрезах «Выбрать сканы» и «Выбрать скважину» соответственно. Наконец, нажмите «Экспорт данных». Стимуляция ионофорами кальция индуцировала более быстрый NETosis по сравнению с PMA, что приводило к более высокой доле нейтрофилов, высвобождающих НВЛ.
НВЛ, индуцированные ионофорами кальция, были более диффузными за пределами плазматической мембраны нейтрофилов, в то время как PMA-индуцированные НВЛ оставались ближе к плазматической мембране нейтрофилов. Тенденция к повышению уровня НВЛ наблюдалась при активации нейтрофилов покрытыми иммунными комплексами, FMLP и кристаллами уратов натрия. Высвобождение НВЛ в ответ на 23187 было полностью ингибировано CIT-013 при половинной максимальной ингибирующей концентрации 4,6 наномоляра.
